ANÁLISIS DEL PAPEL DE LAS FUCOSILTRANSFERASAS Y SIALILTRANSFERASAS EN EL COMPORTAMIENTO METASTÁSICO DE LAS CÉLULAS

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1 ANÁLISIS DEL PAPEL DE LAS FUCOSILTRANSFERASAS Y SIALILTRANSFERASAS EN EL COMPORTAMIENTO METASTÁSICO DE LAS CÉLULAS

2 Investigadores principales: Dra. Carme de Bolós Pí IMIM - Hospital del Mar Dr. Pere Clapés Saborit Institut d Investigacions Químiques i Ambientals de Barcelona, CSIC Dra. Rosa Peracaula Miró Facultat de Ciències Universitat de Girona Duración: 3 años 2

3 1. Resumen Los antígenos Lewis, sialil-lewis A/sialil-Lewis X, son estructuras glucídicas terminales que se unen a las selectinas involucradas en procesos de adhesión celular. La síntesis de estos carbohidratos está catalizada por fucosil- y sialiltransferasas específicas presentes en cada tipo celular. En las células tumorales se ha detectado una expresión anómala que se relaciona con su capacidad metastásica. Nos propusimos un análisis de los mecanismos que controlan la expresión y actividad de estas enzimas y la capacidad de inhibirlos mediante moléculas de tipo iminociclitoles. En un panel de líneas celulares de cáncer de estómago y de páncreas hemos analizado el patrón de expresión del mrna, por RT-PCR a tiempo real, de las fucosil- y sialiltransferasas involucradas en la síntesis de los antígenos sialil-lewis A/sialil-Lewis X; y la detección de estos antígenos en la membrana celular por citometría de flujo. Se han generado líneas de células transfectadas con los cdna de fucosil- y sialiltransferasas y se ha evaluado su implicación directa en procesos de adhesión e invasión in vitro e in vivo. Hemos sintetizado nuevas moléculas de tipo iminociclitol y evaluado, in vitro, su capacidad de inhibir la actividad de glicosiltransferasas y glicosidasas específicas. Nos hemos planteado si las citoquinas inflamatorias del tipo IL-1β, TNF-α e IL-6 pueden estar involucradas en la regulación de las glicosiltransferasas, y lo hemos estudiado en líneas celulares con patrones específicos de expresión de las enzimas, en presencia de citoquinas. También hemos determinado, por inmunohistoquímica, la relación entre la expresión de los antígenos Lewis y el componente inflamatorio de los tumores de estómago. La implicación de las citoquinas inflamatorias en la regulación de otros genes implicados en la carcinogénesis gástrica, como las mucinas intestinales MUC2 y MUC4, también ha sido evaluada. 3

4 2. Resultados La síntesis de nuevos iminoazúcares se ha llevado a cabo siguiendo una nueva estrategia quimioenzimática desarrollada en nuestro laboratorio y que ha demostrado ser útil para la preparación efectiva de estos productos y sus análogos, concretamente una nueva colección de moléculas con propiedades inhibidoras de glicosidasas. La etapa principal del esquema de síntesis es la adición aldólica estereoselectiva del fosfato de la dihidroxiacetona (DHAP) a un aminoaldehído o un equivalente sintético. La reacción aldólica es catalizada por aldolasas DHAP o dihidroxiacetona (DHA) dependientes con una elevada estereoselectividad, y por este motivo la utilización de estas enzimas es crucial en este paso. Cuando se obtuvieron los reactivos de partida y los correspondientes biocatalizadores (aldolasas) se procedió a la síntesis de los diferentes derivados de iminoazúcares: Los derivados N-alquil de las piperidinas de tipo piridinas y pirrolidinas polihidroxiladas y N-alquiladas así como derivados bicíclicos. De estos productos, se ha testado su capacidad inhibitoria in vitro frente a diferentes glicosidasas y posteriormente se han seleccionado para evaluar su citotoxicidad y actividad inhibitoria en líneas celulares de cáncer de estómago y de páncreas. Los resultados nos indican que la longitud de la cadena alquilada ligada al iminoazúcar determina su citotoxicidad y también el efecto inhibitorio de la actividad enzimática de las correspondientes glicosidasas específicas. Este efecto inhibidor se ha sugerido como una herramienta terapéutica útil para inhibir la metástasis. Para evaluar el papel específico de las sialiltransferasas (ST) y fucosiltransferasas (FUT), enzimas involucradas en la biosíntesis de los antígenos Lewis, en el comportamiento metastásico de las células, en primer lugar demostramos que la expresión del cdna de FUT1 induce cambios en la capacidad metastásica de las células HT-29/M3, como consecuencia de la alteración en el patrón de expresión de los antígenos Lewis de tipo 2. También se obtuvieron transfectantes de las líneas celulares 4

5 de cáncer de páncreas Capan-1 y MDAPanc-28, con los genes de ST3Gal III y ST3Gal IV. Los resultados obtenidos nos indican que un incremento en la expresión de ST3Gal III y/o ST3Gal IV contribuyen a un aumento de sialil- Lewis X en la membrana celular y, en consecuencia, aportan una mayor capacidad de adhesión y migración a las células. En estas células, también fue evaluado el nivel de expresión de ST3Gal III y de sialil-lewis X a diferentes grados de confluencia celular, observándose que ambos factores se correlacionan y aumentan a medida que se alcanza la confluencia. Por otro lado, los niveles de ROS y glutatión se asocian con los niveles de ST3Gal III y sialil-lewis X según el grado de confluencia. Para ROS la correlación era positiva, a mayor nivel de ST3Gal y sialil-lewis X, mayor estado oxidativo, mientras que la correlación para glutatión era negativa. La expresión de ST3Gal III también induce un descenso de un 50% en la secreción del factor VEGF. Sin embargo, cuando estas células se tratan con E-selectina, los niveles de VEGF se incrementan. Estos resultados sugieren un papel de la E-selectina en la producción de VEGF, que se incrementa cuando el nivel de sialil-lewis X en la célula es mayor. Estos resultados preliminares describen por primera vez una función nueva de la E-selectina en el proceso tumoral. Se ha postulado que la inflamación puede tener un papel importante en el inicio de la transformación neoplásica. Concretamente, en la mucosa gástrica, la infección por Helicobacter pylori desencadena un proceso inflamatorio que induce la presencia de citoquinas inflamatorias como TNFα, IL-1β e IL-6. Hemos analizado la implicación de estas citoquinas en la activación de fucosil- y sialiltransferasas y los resultados indican que IL-1β induce una bajada de FUT5 y un incremento de ST3Gal IV asociados a niveles más bajos de sialil-lewis X; mientras que IL-6 produce incrementos de FUT1 y de ST3Gal III y ST3Gal IV. En tumores gástricos humanos, sialil- Lewis X se detecta a niveles más altos en los tumores de enfermos que han desarrollado metástasis y también en los tumores que presentan 5

6 inflamación crónica, que se asocia a niveles más altos de TNF-α e IL-β. Estos resultados nos indican que la presencia de determinadas citoquinas inflamatorias en los tumores gástricos pueden modular la expresión de glicosiltransferasas específicas involucradas en la síntesis de antígenos Lewis implicados en el desarrollo de metástasis. También hemos observado que TNF-α e IL-β pueden activar genes intestinales implicados en la carcinogénesis gástrica como la mucina MUC2 a través de la vía de NF-κB. También en células de cáncer de estómago, IL-6 activa la expresión de MUC4 a través de la vía de gp130/stat3. Estos datos han sido corroborados en tumores gástricos humanos del tipo intestinal en los que el tipo de inflamación presente, aguda o crónica, asociadas a distintos patrones de expresión de citoquinas, puede modular el proceso de transdiferenciación regulando vías de activación implicadas en la expresión de genes involucrados en el proceso de la carcinogénesis gástrica. 3. Relevancia y posibles implicaciones clínicas de los resultados finales obtenidos Determinados iminoazúcares como el miglustat y miglitol se han convertido en principios activos de medicamentos para el tratamiento de la diabetes tipo II o para la enfermedad de Gaucher. Creemos que algunos de estos derivados podrían utilizarse para reducir la actividad metastásica de células tumorales o para la reducción de tumores malignos. Pero para llegar a esta fase hacen falta más investigación y nuevos ensayos en distintas fases de complejidad: toxicidad, animales de experimentación y ensayos clínicos. El presente estudio también ha permitido describir la implicación del antígeno Lewis sialilado, sialil-lewis X, en diferentes etapas del proceso tumoral. Como ligando de la E-selectina en el proceso de extravasación 6

7 celular de las células tumorales a través del endotelio capilar durante la metástasis, su incremento puede conferir a las células tumorales una mayor capacidad adhesiva a la E-selectina, migratoria, estimuladora de factores prometastásicos y posiblemente un mayor potencial metastásico. Algunas de las enzimas responsables de su síntesis, como FUT3 y ST3Gal III, se podrían considerar una buena diana terapéutica para frenar la diseminación tumoral. Las citoquinas proinflamatorias podrían tener un papel clave en la regulación de la expresión de sialil-lewis X en las células de cáncer de estómago y de páncreas. Por lo tanto, el componente inflamatorio estaría involucrado en la progresión tumoral, poniendo de manifiesto la importancia de profundizar en la utilización de moléculas específicas para el tratamiento y terapia de estos tipos de tumores. Nuestros estudios indican también un papel importante de la inflamación en la activación de diversos genes asociados con el proceso de transdiferenciación intestinal que tiene lugar durante la carcinogénesis gástrica. La caracterización de las vías de activación que determinan la expresión de genes implicados en este proceso de transformación neoplásica puede ser útil para el diseño de nuevas dianas terapéuticas para los adenocarcinomas de estómago. La erradicación de Helicobacter pylori y de la gastritis asociada, son la estrategia más útil para la prevención del cáncer gástrico, aunque en patologías avanzadas y en los carcinomas gástricos, la actuación en las vías de señalización activadas por citoquinas inflamatorias en las etapas que preceden al desarrollo del tumor es, sin duda, importante para generar nuevas herramientas terapéuticas para el cáncer gástrico. 7

8 4. Publicaciones Castillo J A, Calveras J, Casas J, Mitjans M, Vinardell M P, Parella T, Inoue T, Sprenger G A, Joglar J, Clapes P. Fructose-6-phosphate Aldolase in Organic Synthesis: Preparation of D- Fagomine, N-Alkylated Derivatives, and Preliminary Biological Assays. Org. Lett. 2006, 8, (26), Mejías-Luque R, López-Ferrer A, Garrido M, Fabra A, de Bolós C. Changes in the invasive and metastasic capacities of HT-29/M3 cells induced by the expression of FUT1. Cancer Sci. 2007, 98: Calveras J, Casas J, Parella T, Joglar J, Clapés P. Chemoenzymatic Synthesis and Inhibitory Activities of Hyacinthacines A1 and A2 Stereoisomers. Adv. Synth. Catal. 2007, 349, (10), Gutierrez M L, Garrabou X, Agosta E, Servi S, Parella T, Joglar J, Clapés P. Serine Hydroxymethyl Transferase from Streptococcus thermophilus and L- threonine Aldolase from Escherichia coli as Stereocomplementary Biocatalysts for the Synthesis of beta-hydroxy-alfa,omega-diamino Acid Derivatives. Chem. Eur. J. 2008, 14, (15), Mejías-Luque R, Peiró S, Vincent A, Van Seuningen I, de Bolós C. IL-6 induces MUC4 expression through gp130/stat3 pathway in gastric cancer cell lines. BBA-Molecular Cell Research. 2008; 1783: Concia A L, Lozano C, Castillo J A, Parella T, Joglar J, Clapés P. 8

9 D-Fructose-6-phosphate Aldolase in Organic Synthesis (II): Cascade chemical-enzymatic preparation of sugar related polyhydroxylated compounds. Chem. Eur. J. 2009, 15, Garrabou X, Castillo J A, Guérard-Hélaine C, Parella T, Joglar J, Lemaire M, Clapés P. Asymmetric self- and cross-aldol reaction of glycolaldehyde catalyzed by D- fructose-6-phosphate aldolase. Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, Calveras J, Egido-Gabás M, Gómez L, Casas J, Parella T, Joglar J, Bujons J, Clapés P. Dihydroxyacetone phosphate aldolase-catalyzed synthesis of structurally diverse polyhydroxylated pyrrolidine derivatives and evaluation of their glycosidase inhibitory properties. Chem. Eur. J. 2009, 15, Mejías-Luque R, de Bolós C. Inflammatory cytokines pathways as potential therapeutic target for gastric cancer. Current Cancer Therapy Reviews. 2009; 5: Padró M, Castillo J, Gómez L, Joglar J, Clapés P, de Bolós C. Cytotoxicity and enzymatic activity inhibition in cell lines treated with novel iminosugar derivatives. Glycoconjugate J Mejias-Luque R, Lindén SK, Garrido M, Tye H, Najdovska M, Jenkins BJ, Iglesias M, Ernst M, de Bolós C. Inflammation modulates the expression of the intestinal mucins MUC2 and MUC4 in gastric tumors. 9

10 Oncogene, 2010, Pérez-Garay M, Arteta B, Pagès L, de Llorens R, de Bolòs C, Vidal- Vanaclocha F, Peracaula R. Alpha-2,3-sialyltransferase ST3Gal III overexpression contributes to pancreatic cancer metastasis by increasing E-Selectin adhesion and cell motility. Glycobiology (sometido a publicación). Mejías-Luque R, Padró M, Cobler L, Garrido M, Pérez-Garay M, Puig S, Iglesias M, Peracaula R, de Bolós C. Regulation of glycosyltransferases and Lewis antigens expression by proinflammatory cytokines in human gastric cancer cells. PloS ONE (en revisión). Pérez-Garay M, de Llorens R, Vidal-Vanaclocha F, Peracaula R. Reactive Oxygen Species as alpha 2,3-sialyltransferase ST3Gal III and sialyl-lewis x expression regulators in pancreatic adenocarcinoma cell lines. Int J Biochem Cell Biol. (en preparación). Pérez-Garay M, Arteta B, Pagès L, de Llorens R, de Bolòs C, Vidal- Vanaclocha F, Peracaula R. Role of alpha-2,3-sialyltransferase ST3Gal IV in pancreatic cancer cell motility, adhesion and metastasis. Journal of Biological Chemistry (en preparación). 10