UNIVERSIDAD VERACRUZANA FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

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1 UNIVERSIDAD VERACRUZANA FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA RESPUESTA OVARICA A UN ESTIMULO SUPEROVULATORIO CON DIFERENTES NIVELES DE FSH EN OVINOS PELIBUEY TESIS PROFESIONAL QUE PARA OBTENER EL TITULO DE: MEDICO VETERINARIO ZOOTECNISTA PRESENTA: GUADALUPE PLIEGO PALACIOS ASESORES: MVZ. DR. HORACIO LEON VELASCO MVZ. ALFONSO DE JESUS RUIZ MORENO MVZ. ANTONIO REYES CERON. H. VERACRUZ, VER

2 LISTA DE CONTENIDO Paginas RESUMEN. 1 I.- INTRODUCCIÓN... 2 II.- REVISIÓN DE LITERATURA ANTECEDENTES DE TRANSFERENCIA DE EMBRIONES EN OVINOS FISIOLOGÍA DE LA REPRODUCCIÓN OVINA Comportamiento reproductivo de la oveja pelibuey Maduración de los folículos ováricos y de los oocitos Ciclo estral SELECCIÓN DE DONADORAS SELECCIÓN DE RECEPTORAS METODOS DE SINCRONIZACION Mecanismo de acción de los métodos de sincronización Sincronización con dispositivos intravaginales de progesterona (CIDR-G) Método de sincronización con la utilización de esponjas intravaginales con progestágenos (FGA acetato de fluorogestona) METODOS DE SUPEROVULACIÓN COLECCIÓN DE EMBRIONES RESULTADOS DE LA TRANSFERENCIA DE EMBRIONES EN OVINOS...19 III.- MATERIAL Y METODOS ZONA DE ESTUDIO METODOLOGÍA ANÁLISIS ESTADÍSTICO...28 IV.- RESULTADOS Y DISCUSIÓN..29 V.- CONCLUSIÓN.31 III

3 VI.- LITERATURA CITADA...32 VII.- ANEXOS.37 LISTA DE CUADROS Paginas Cuadro 1.- Sistemas de alimentación en las ovejas donadoras..22 Cuadro 2.- Sistema de superovulación en ovinos (grupo experimental).23 Cuadro 3.- Sistema de superovulación en ovinos (grupo testigo).24 Cuadro 4.- Resultados comparativos del efecto de la dosis de FSH en la respuesta ovárica en borregos pelibuey 29 Cuadro 5.- Numero de cuerpos lúteos en la respuesta superovulatoria en ovinos pelibuey..30 LISTA DE ESQUEMAS Esquema 1.- Esquema de sincronización y superovulación con FSH-P (280 mg.) Esquema 2.- Sistema de sincronización y superovulación en borregas con 220 mg. de FSH-P IV

4 RESUMEN PLIEGO PALACIOS G.; 2005 RESPUESTA OVARICA A UN ESTIMULO SUPEROVULATORIO CON DIFERENTES NIVELES DE FSH EN OVINOS PELIBUEY. La presente investigación se realizó en el rancho San Francisco propiedad de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Autónoma de Chiapas, que se ubica a la altura del kilómetro 8.5 de la carretera Terán- Vicente Guerrero, en el municipio de Tuxtla Gutiérrez Chiapas, con el objetivo de evaluar la respuesta ovárica a un estímulo superovulatorio de FSH (Hormona folículo estimulante) en 12 ovinos hembras de la raza pelibuey en condiciones de trópico seco, utilizando para ello diferentes niveles de concentración de hormona FSH. Los animales en estudio se separaron en dos grupos de 6 hembras cada uno: el grupo experimental y el grupo testigo. En ambos grupos se llevó acabo la sincronización de estros, utilizando esponjas intravaginales (Chronogest, lab. Intervet) impregnadas con 40 mg de acetato de fluorogestona, con una duración de 14 días. La superovulación consistió en la aplicación de 280mg-NIH-FSH-P (Folltropin-v) para el grupo experimental en dosis decrecientes durante 4 días, con un intervalo de 12 h, para el grupo testigo se aplicó Hormona folículo estimulante en una dosis de 220 mg-nih-fsh-p (Folltropin-v) así también en dosis decreciente durante cuatro días con un intervalo de 12 h. A ambos grupos se le aplicó prostaglandina F2α en dosis de 25 mg. a las 12 h de la primera aplicación de FSH (Dosis única) las aplicaciones de Hormona folículo estimulante, así como la prostaglandina se aplicaron por vía intramuscular. Una vez terminado el tratamiento se les dio el servicio de monta a las hembras donadoras, hubo una espera de 7 días después de la monta, para posteriormente evaluar la respuesta ovulatoria por medio de la técnica quirúrgica de laparotomía. Las variables evaluadas fueron; número de embriones (embriones viables, embriones no viables), cuerpos lúteos, óvulos. Estas variables fueron analizadas mediante un análisis de varianza dentro del paquete estadístico Statystical Análisis System (Programa SAS, 1999). Para el grupo experimental (con dosis de 280 mg-nih-fsh-p (Folltropin-v) los resultados fueron: un total de 44 embriones, con un promedio de 7.3 ± 3.3, de los cuales 6.3 ± 3.3 corresponde a embriones viables y 1 ± 0.2 es el resultado de embriones no viables, mientras que para el grupo testigo (con dosis de 220 mg -NIH- FSH-P (Folltropin-v), se obtuvo un total de 10 embriones, con un promedio de 1.6 ± 0.9 (P<0.01). En cuanto a óvulos para el grupo experimental, se obtuvo un promedio de 2.6 ± 1.0, mientras que para el grupo testigo el resultado fue de cero. 0tra variable analizada fueron cuerpos lúteos, para el grupo experimental el promedio de cuerpos lúteos fue de 17.6 ± 3.5, mientras que para el grupo testigo el promedio fue de 1.8 ± 1.3 (P< 0.01). Al analizar estos resultados y observar diferencia entre ambos grupos, se deduce que el éxito de los programas de reproducción artificial implica una correlación estrecha entre factores como adaptación, nutrición, pureza de raza, así como la dosis utilizada, observando una mejor respuesta en aquellos animales sometidos bajo un tratamiento de 280 mg.-nih-fsh-p (Folltropin-v) que aquellos que recibieron un estímulo superovulatorio de 220 mg.-nih-fsh-p (Folltropin-v). 1

5 I- INTRODUCCIÓN En el estado de Chiapas la ovinocultura es relativamente nueva, lo fuerte de las explotaciones se ven inclinadas principalmente hacia la producción bovina y la industria avícola. Sin embargo, la facilidad o la mayor posibilidad de establecer una explotación en la que el tamaño, la adaptabilidad, el bajo costo de producción, así como la posibilidad de obtener un incremento del hato en menor tiempo posible ha despertado el interés de desarrollar o establecer explotaciones ovinas, valiéndose para ello de nuevas técnicas reproductivas. Las metas y objetivos de las explotaciones dedicadas a la crianza de ovinos es obtener la mayor eficiencia productiva y reproductiva, ya que de ella depende la economía para el mantenimiento de la explotación, sin embargo, el logro de estas, se ve influenciado por factores medioambientales, genéticos y de sus interacciones ( Pérez, 1995 ). La población ovina en México según la F.A.O., se ubica en 6.7 millones de cabezas. La producción de carne ovina se estima en 37,4 mil toneladas y el consumo aparente se ubica en 95 mil toneladas. La producción ovina en México se realiza predominantemente bajo sistemas tradicionales con escasa tecnología, en la zona norte del país predominan sistemas con una mayor orientación a la producción de lana, en la zona central los sistemas se inclinan más hacia la producción de carne, utilizando cada vez más el cruzamiento con las razas Suffolk o Hampshire. En las zonas Tropicales se explotan generalmente razas de pelo como la Pelibuey, Black Belly y Katahdin (Arbiza, 1996). El objetivo de la mayor parte de los productores es ir estableciendo razas que aporten las necesidades requeridas para cada una de sus explotaciones, valiéndose para ello de introducir en sus explotaciones técnicas que permitan el mejoramiento de su rebaño (Ramón, 1999). Existen técnicas que permiten el mejoramiento genético de un rebaño, una alta prolificidad, así como la creación de bancos genéticos. Estas técnicas son la ovulación múltiple y la transferencia de embriones. El aumento de la prolificidad, incrementando la tasa de ovulación, mejora invariablemente la fertilidad (Robinson, 1992). La Técnica de ovulación múltiple y Transferencia de embriones es el eslabón primario de una serie de técnicas reproductivas expuestas en los últimos años para aumentar la productividad de las especies (Ramón, 1999). 2

6 Estas técnicas de reproducción artificial permiten generar embriones a partir de una madre genética inducida a ovulación múltiple y posteriormente transferir dichos embriones antes de la implantación a una madre portadora (receptora) en quién se desarrollará el embrión hasta llegar a término (FAO. 1993). JUSTIFICACIÓN.- En los últimos años se ha dado más interés en algunos productores en establecer un rebaño ovino, esto debido a que el tamaño, adaptabilidad, manejo y la finalidad de obtener un mayor número de corderos por animal por año, les ofrece nuevas y mejores expectativas en una explotación, pero son muy pocas las explotaciones que utilizan la tecnología de punta que les permita optimizar sus recursos (Amer, 1994). En una explotación una de las áreas importantes además de la nutrición es sin duda la reproducción. Las ovejas mantenidas en sistema de explotación extensiva suelen tener problemas de baja prolificidad y baja fertilidad, así como una baja calidad genética (Marai y Owen 1994). Estos problemas pueden ser mejorados mediante el uso o aplicación de la biotecnología reproductiva, es decir podemos explotar el potencial genético de hembras a partir de la inducción a la ovulación (ovulación múltiple) y transferencia de dichos embriones a hembras no necesariamente altas en calidad genética. La época reproductiva en las ovejas varía a lo largo del año, así como a la raza y al lugar ( Alvarez-Rubio, 1992), en México la raza Pelibuey y los denominados criollos tienen una época reproductiva larga y son muy pocos los meses críticos reproductivos los cuales se consideran que son de febrero y marzo así como también julio en condiciones de trópico seco. Los periodos de baja fertilidad en un rebaño son sinónimos de anestro, por lo que este estudio permitirá mediante el uso de progestágenos más gonadotropinas (FSH) incrementar el número de folículos maduros que a la vez se traducirá en una mayor ovulación y por lo tanto dependiendo de la respuesta al tratamiento se obtendrá un mayor número de embriones de alta calidad genética para ser transferidos ó congelados. La importancia de la aplicación de estas nuevas técnicas radica en que al ser utilizadas en una explotación permite al productor: _ Un mejoramiento genético del hato 3

7 _ Aumentar la prolificidad _ La producción de corderos fuera de la estación de reproducción puede ser económicamente atractiva, al incrementar el precio de la carne por la baja disponibilidad de corderos para abasto. _ Prevenir enfermedades (control sanitario de ciertas enfermedades) _ La creación de bancos genéticos de especies en peligro de extinción (McGuirk, 1989). OBJETIVOS: 1.- Conocer la respuesta ovárica a un estímulo superovulatorio con dos niveles de FSH (Hormona folículo estimulante) en ovejas de raza pelibuey en condiciones de trópico seco. HIPÓTESIS: Se espera obtener una mayor respuesta ovulatoria con una dosis de 280 mg-nih- FSH-P (Folltropin-v). De FSH vs. 220 mg-nih-fsh-p (Folltropin-v). En un programa superovulatorio en ovinos pelibuey en condiciones de trópico seco. 4

8 II.- REVISIÓN DE LITERATURA ANTECEDENTES DE TRANSFERENCIA DE EMBRIONES EN OVINOS Una de las técnicas de reproducción artificial que permite el mejoramiento genético de un hato, una alta producción, así como la creación de bancos genéticos, es sin duda la técnica de ovulación múltiple y la transferencia de embriones, en esta técnica los embriones generados por una hembra donadora (madre genética), son transferidos antes de la implantación a hembras receptoras (madre portadora) en donde se desarrollará el embrión hasta terminar la gestación (F.A.O, 1987). Los programas de ovulación múltiple y transferencia de embriones (MOET) han sido utilizados ampliamente en bovinos, pero en ganado ovino y caprino se está empezado ha ensayar el empleo de éste programa. En el año de 1890, inicia la historia de la transferencia de embriones en mamíferos, cuando Walter Heape, en la Universidad de Cambridge, Inglaterra, transfirió embriones de una coneja de Angora albina al oviducto de una coneja Belga que había sido montada por un macho de su raza. La coneja Belga parió seis crías, cuatro de raza Belga y las otras dos Angora albinas. Este experimento se realizó para determinar si había algún efecto del útero sobre los embriones ajenos, o de estos sobre los propios. década de l920 y principios de la de 1930 los ingleses Marshall, Hammond y Asdel transfirieron con éxito embriones de conejo, usando probablemente algún tratamiento superovulatorio, ya que en 1930 se descubrió el efecto gonadotrópico del suero de yeguas gestantes y se estudiaron las hormonas pituitarias y su efecto superovulatorio. Desde aquel entonces se sabía que las preparaciones hipofisiarias eran mejores que el suero de yegua (Ramón, 1999). La transferencia de embriones empieza a ser objetivo de investigación posterior a los estudios de Inseminación Artificial (Warwick y Berry,1934) realizan trabajos hechos en ovinos y en 1949 publican el primer artículo con excelentes resultados. En los años 50 Rowsor et al. y Moore (citado por Romano Pedernera, 2004) mejoran las técnicas de transferencia tanto en ovinos como en caprinos (Rajchapel-Messai, 1998). En los trabajos iniciales la técnica consistía en la sincronización y superovulación de los animales donantes utilizando progesterona y PMSG (gonadotropina sérica de yegua preñada) posteriormente las hembras donantes eran inseminadas 5

9 artificialmente o por monta directa, después de siete días se colectaban los embriones por medio de laparotomía y se transferían a hembras receptoras o eran congelados. En estudios posteriores se empezaron a utilizar la FSH porcina (1980) y años después la FSH ovina. En los últimos años se han desarrollado diversos trabajos que están llevando al conocimiento y aceptación de dichas técnicas (Cognie, 1999). La propuesta del uso de transferencia de embriones y la ovulación múltiple en los programas de mejoramiento genético fue una idea planteada por el Dr. Nicolás en los años de 1979 y 1983 concibiéndolo para emplearlo en hembras bovinas productoras de leche. A partir de entonces se han hecho modificaciones de acuerdo a las especies. La técnica hace posible aumentar la prolificidad, contribuyendo a mejorar el valor genético. Este esquema según consenso a conducido a una ganancia genética anual extra del orden de % (Ortiz, 2000) FISIOLOGÍA DE LA REPRODUCCIÓN OVINA Comportamiento reproductivo de la oveja pelibuey. Los ovinos son poliéstricos con ciclos estrales que van de 16 a 17 días. El establecimiento de la actividad reproductiva durante la pubertad está íntimamente ligado con la estacionalidad, nutrición y factores físicos (Frandson- Spurgeon, 1995). Algunas razas son estaciónales, especialmente aquellas que se originan en las regiones más frías del hemisferio (como las europeas). Las razas que se desarrollan en climas donde no hay cambios extremos, se observa un tipo de reproducción no estacional ( entre las que se incluye la raza pelibuey) ( MacDonald, 1986). Una de las características de la raza pelibuey es que disminuye su actividad reproductiva durante los meses de marzo a mayo, aunque la nutrición sea buena. La época del año afecta la prolificidad de la oveja; ésta es mayor cuando las hembras se aparean durante el otoño, pero las que paren durante los primeros meses del año generalmente presentan periodos de anestro posparto e intervalos entre partos más prolongados que las que paren durante el verano o el otoño. Así mismo se ha demostrado que independientemente de la nutrición y de su peso corporal, los corderos que nacen durante la primavera alcanzan la pubertad a una edad más joven que las que nacen en el verano o en el otoño. La época del año afecta así también la actividad ovárica de la oveja pelibuey (Martínez, 1998). 6

10 Al igual que en las ovejas especializadas en producción de lana, la presencia de ovulación sin estro es un fenómeno que también se presenta en las ovejas pelibuey durante el primer ciclo posparto, la cual ocurre alrededor de los 20 a 30 días, mientras que el primer estro es observado más comúnmente entre los 40 y 55 días después del parto (Cortés, 1993) Maduración de los folículos ováricos y de los oocitos. Desde el nacimiento los ovarios de la hembra contienen todos los futuros ovocitos de la vida reproductiva, no volviéndose a producir más después del nacimiento. En el caso del macho, estos producen espermatozoides durante su vida reproductiva. A diferencia de las células sexuales masculinas que forman cuatro espermatozoides a partir de cada célula sexual primaria, la maduración de la célula sexual primaria femenina da por resultado sólo un óvulo (huevo u oótide) y tres células rudimentarias llamadas cuerpos polares o polocitos (Fradson - Sporgeon, 1995). Tanto en la ovogénesis como en la espermatogénesis se producen células haploides (27 cromosomas) en la oveja, lo que en la fecundación la unión de los gametos (huevo y espermatozoide) restablecen el número diploide (54 cromosomas en la oveja) (Evans, 1990). Las ovogonias contenidas en los ovarios de los fetos hembras son células diploides, se multiplican por división mitótica antes del nacimiento, después sufren un período de crecimiento para pasar luego a su primera división meiótica, después de esto sufre un descanso temporal, formándose así lo que se conoce como ovocito primario, el cual se encuentra rodeado por una capa de células planas que forman un folículo primario; estos últimos permanecen inactivos hasta la madurez sexual de la hembra. En la madurez sexual uno de ellos comienza a crecer, se alarga y se recubre por una capa externa transparente que recibe el nombre de zona pelúcida. El folículo primario aumenta de tamaño y llega a convertirse en folículo secundario y posteriormente en folículo terciario provisto de antro. Continúa un proceso de maduración convirtiéndose así en folículo de Graff de hasta 1 cm. de diámetro, situado en la superficie del ovario (Evans ACO, Duffy P., 2000). Al final de la maduración del folículo se completa la división meiótica, separándose el primer cuerpo polar en el ovario conteniendo exceso de cromosomas, 7

11 es ahora conocido con el nombre de oocito secundario, siendo este estadio cuando se rompe y se libera el ovocito en el proceso llamado ovulación (Evans, 1990) Ciclo estral. Los principales acontecimientos del ciclo estral de la oveja pueden dividirse en aquellos relacionados con el crecimiento folicular que comprende los periodos de pro estro (cuya duración es de 2 días) y estro (con un promedio de 24 a 48 h ). Esta fase folicular se caracteriza por el crecimiento del folículo el cual está bajo el control de las dos hormonas gonadotrópicas liberadas en la adenohipófisis, llamadas hormona folículo estimulante (FSH) y hormona luteinizante (LH). La primera (FSH) estimula el crecimiento temprano de los folículos y la (LH) es necesaria para completar las últimas fases de crecimiento y de maduración del folículo y del ovocito. Además las gonadotropinas hacen que el folículo secrete hormonas sexuales femeninas como los estrógenos que se liberan al torrente circulatorio, al principio los niveles son relativamente bajos, existe una retroalimentación en la hipófisis teniendo un efecto negativo o inhibitorio sobre la secreción de gonadotropinas. Cuando el nivel de estrógenos es alto se dispara la oleada de LH a partir de la hipófisis, llamándose a esto oleada preovulatoria de LH, produciendo cambios en la pared del folículo que conduce a la ruptura y liberación del óvulo. La oleada preovulatoria ocurre al principio del estro entre las 4 y 6 horas de iniciado (Bearden y Fuquay, 1980). Los estrógenos circulantes en la corriente sanguínea durante la fase folicular son los responsables de la inducción del comportamiento estral de las hembras. El nivel de estrógenos en la sangre se eleva y alcanza el máximo justamente antes de la aparición del estro, el cual tiene un rango de duración que va de 18 a 72 h., dependiendo de la raza, edad, situación geográfica, estado nutricional y contacto con el macho. En general se maneja un rango de 24 a 48 horas, con un promedio de 36 horas (Uscanga, 1990). Se ha encontrado que el estro es más corto en animales jóvenes que en animales maduros, así también se relaciona a hembras con períodos cortos con menos fertilidad que las que presentan un período largo, lo que puede también estar relacionado con el número de ovulaciones, hembras con períodos cortos raramente presentan ovulaciones dobles (Rangel, resultados no publicados). 8

12 Además de los estrógenos, los folículos que maduran producen también la hormona inhibina que suprime la secreción de FSH por la adenohipófisis, al limitar la secreción de FSH evita el crecimiento folicular (Hafez, 1993). Hacia la mitad y el final de la fase folicular del ciclo tiene lugar el estro, que es el período durante el cual la hembra manifiesta un comportamiento de actividad sexual, es el único tiempo de recepción del macho. Las manifestaciones de estro son influenciadas por los altos niveles de estrógenos circulantes en el torrente sanguíneo. Estas manifestaciones son: enrojecimiento de la vulva y vagina con descarga de moco, inquietud, elevación constante del rabo, frotamiento conjunto con el macho, micción continua. Cabe señalar que en la oveja las manifestaciones externas de estro son menos pronunciadas que en otras especies, para poder detectar el celo en la oveja se puede utilizar machos celadores y/ o marcadores (vasectomizados o con mandil). El único signo seguro del estro es si la hembra acepta y se está quieta cuando la monta el macho (reflejo de quietud), el macho detecta a la hembra en estro por el olor tan característico de la secreción vaginal (Uscanga, 1990). Hacia el final del estro ocurre la ovulación, este es el proceso mediante el cual se rompe el folículo maduro y se libera el óvulo, la ovulación es espontánea ocurre en presencia o ausencia del macho. En la oveja puede haber dos o tres ovulaciones en el mismo período. La ovulación ocurre a las 20 a 24 horas del pico ovulatorio de LH (Bearden y Fuquay, 1980). Cuando maduran dos o más folículos en el mismo ciclo estral, los ovocitos se liberan con 2 a 3 horas de diferencia entre ellos. Toda la fase folicular comprende un promedio de 3 o 4 días (McDonald, 1986). Después de la ovulación tiene lugar la fase luteal que comprende los períodos de metaestro y diestro y cuyo tiempo se prolonga unos 13 días aproximadamente. Una vez llevada a cabo la ruptura del folículo de Graff, la cavidad se llena por un coagulo de sangre formándose así lo que se conoce como cuerpo hemorrágico. Por la influencia de la oleada de LH, las células de la granulosa, en la pared del folículo roto proliferan y se transforman en células luteínicas que posteriormente llenan al antro del folículo. A los 4 o 5 días el cuerpo hemorrágico se transforma en cuerpo amarillo sólido, denominándose cuerpo lúteo. Conociéndose todo este proceso como luteinización (Frandson-Spurgeon, 1995). El cuerpo lúteo tiene como función producir la progesterona, hormona que prepara al útero para recibir al óvulo fecundado o al embrión. Después de unos 6 días la progesterona alcanza niveles máximos en sangre, permaneciendo así hasta la 9

13 gestación. Al estar en sus niveles más altos la producción de progesterona hay inhibición de la secreción de gonadotropina (FSH), lo cual no permite que haya más maduración de folículos. Si no hay gestación transcurridos días en la oveja, el cuerpo lúteo disminuye su tamaño, empalidece formándose lo que conocemos como cuerpo albicans y comienza a descender la secreción de progesterona. La inhibición del cuerpo lúteo se debe a la presencia de una sustancia lúteolítica conocida como prostaglandina F2 alfa que se produce en el útero entre el día 14 o 15 del ciclo estral después de la prolongada exposición a la progesterona (Hafez, 1993; Leild, 1976). Al inhibirse o al llevarse a cabo la regresión del cuerpo lúteo, baja la secreción de progesterona y se da origen a una nueva secreción de gonadotropina (FSH), por ende una nueva onda de crecimiento folicular y el inicio de un nuevo ciclo estral (Uscanga, 1990) SELECCIÓN DE DONADORAS: El éxito de cualquier programa de inseminación artificial ó transferencia de embriones depende en gran medida de las características tanto físicas como fisiológicas de las hembras utilizadas como donadoras ya que de ellas se obtendrá el potencial genético que se desea transferir. La selección de hembras donadoras debe basarse en las siguientes características 1.- Calidad genética y productiva.- Se deben seleccionar aquellas hembras que tengan la más alta calidad genética y productiva de un hato. 2.- Condición corporal.- El nivel de nutrición y en especial de la condición corporal tienen en el aspecto reproductivo gran relevancia, a través de estudios se ha demostrado una tendencia ha aumentar la prolificidad cuando hay una mejor condición corporal y una mejor respuesta en la sincronización de estros y en la inducción a la superovulación (Albueno y Peirón, 1996; Cruz et al., 1999). Con respecto al peso se ha sugerido que hembras con pesos arriba de los 30 kilogramos o próximos a estos es reflejable en una mejor respuesta al tratamiento. Las ovejas primíparas o nulípara pueden ser utilizadas siempre que alcancen al menos un 70% del peso de las adultas. 3.- Edad.- La edad de la oveja marca el comportamiento reproductivo; es decir, se ha estudiado y reportado niveles de fertilidad bajos en ovejas jóvenes (primíparas) 10

14 en relación con ovejas adultas (multíparas), la prolificidad en estas últimas es mayor como resultado de su tasa de ovulación en forma natural (Bunge et al., 1993, Moses et al., 1997). Se ha encontrado a través de estudios altas tasas de ovulación en ovejas de más de 18 meses comparativamente con ovejas de 6 7 meses de edad. La edad nos da por consecuencia el tamaño del útero, así como la capacidad de producir altas tasas de ovulación (Rangel et al, resultados no publicados). 4.- Clínicamente sanas.- Que no tengan problemas reproductivos SELECCIÓN DE RECEPTORAS.- La selección de receptoras se lleva a cavo de la misma manera que las donadoras a partir de su estado fisiológico, buena condición corporal y clínicamente sanas, considerando que serán las portadoras de embriones provenientes de hembras donantes de alto valor genético, por tanto de su selección y preparación dependerá en gran parte del éxito de la transferencia (Ramón 1999) METODOS DE SINCRONIZACION.- Dentro de los programas de transferencia de embriones, los métodos utilizados de sincronización de estros son tan importantes como los subsecuentes métodos ya que la sincronización es una técnica que permite trabajar un número deseado de hembras a un mismo tiempo y programar nacimientos y por consecuencia programar la producción. Independientemente de la técnica de sincronización utilizada esta debe ser eficiente y confiable ( Rangel, 1997). Técnica Eficiente.- El nivel de eficiencia de una técnica de sincronización se determina tomando en consideración el porcentaje de animales que responden al tratamiento, así como a la distribución de los calores (Rangel,1997). Técnica Confiable.- Por lo general un promedio de % de los animales tratados durante la época normal de reproducción (otoño e invierno para razas estaciónales) muestran celo entre dos o tres días después de la remoción de esponjas, la respuesta puede verse afectada por factores como la raza, la edad de la oveja, la época del año, la condición corporal y el nivel nutricional (Cognie, 1990). 11

15 La sincronización de celo se logra afectando y controlando la vida funcional del cuerpo lúteo del ovario ya sea mediante la inducción de lúteolisis (solo durante la estación reproductiva), aplicando prostaglandina F2 alfa o sus análogos durante el diestro entre los 9 y 13 días del celo en la oveja (si se conoce la fecha del celo anterior) o de 7 a 11 días si no se conoce la fecha del celo anterior (Willadson S.M. 1979; Baril et al., 1993). Así también se puede sincronizar mediante la inducción de una fase luteal artificial, lograda en base a la aplicación vía dispositivos intra vaginales de progesterona como el (CIDR-G) o progestágenos con esponjas intra vaginales (FGA, acetato de fluorogestona) y (MAP, acetato de medroxiprogesterona), para imitar la fase luteal del ciclo estral (Corteel et al.,1988; Crosby et al., 1991; Ainsworth y Wolynetz,1982). La progesterona y los progestágenos pueden administrarse también en forma de inyecciones diarias o como implantes subcutáneos pero es menos práctico. En la oveja un tratamiento de 10 a 12 días es suficiente (Corteel et al., 1998) Mecanismo de acción de los métodos de sincronización. En condiciones naturales el mecanismo básico que preside el cese de la maduración de folículos en el ovario radica en el bloqueo de producción de FSH por la progesterona y quizá por estrógenos procedentes del cuerpo lúteo de la gestación o de la placenta. En consecuencia en la sincronización de estros se utiliza la administración de estas hormonas esteroideas o sus derivados con el fin de imitar los efectos naturales del cuerpo lúteo (McDonald, 1996). Casi todos los productos hormonales comerciales hasta la fecha actúan fundamentalmente a nivel ovárico, de manera que su eficacia se sustenta en su acción directa a nivel folicular o luteal o bien en la retroacción positiva o negativa que ejercen los esteroides ováricos (progesterona y estradiol) sobre el eje hipotálamo hipofisario (Forcada, 2003). En ovejas se utilizan los dispositivos intravaginales (CIDR-G) que contienen progesterona, así como el uso de esponjas intravaginales que pueden contener (FGA acetato de fluorogestona) o (MAP acetato de medroxiprogesterona). Los progestágenos aplicados mediante esponjas intravaginales permiten inducir una fase 12

16 luteal artificial, sincronizando los ciclos sexuales ( en ovejas cíclicas) o para inducir la ciclicidad en ovejas en anestro (Forcada, 2003). La aplicación de progestágenos durante un periódo de 12 a 14 días es suficiente; a la remoción del dispositivo intravaginal el cuerpo lúteo ha sido destruido por efecto de la progesterona exógena y se suceden las fases de proestro, estro y la ovulación, en la secuencia normal pero con ciertas variaciones en la duración de algunos eventos fisiológicos. El intervalo de tiempo desde la remoción del dispositivo vaginal o suspensión del tratamiento, a la presentación del estro receptivo es la característica más afectada y es más corto en el caso de los CIDRs que con el uso de las esponjas intravaginales. En la oveja el estro aparece entre las 48 y 72 horas de retirado el tratamiento y la ovulación ocurre en promedio a las 55 horas postratamiento (Cognie, 1987; Baril y Vallet, 1990). En el primer estro generalmente la fertilidad suele ser baja (30 y 60 %), pero al segundo tratamiento la fertilidad suele aumentar hasta un 70% (Hunter,1982). En la sincronización de estros se utiliza también la prostaglandina F2α, su acción teolítica (lisis del cuerpo lúteo) hace que tenga una aplicación clara en la sincronización de los ciclos sexuales. Se ha aceptado generalmente como un agente luteolítico que termina con la corta vida del cuerpo lúteo cíclico de los ovinos al final del diestro. La regresión del cuerpo lúteo resulta en una caída brusca de los niveles de progesterona en la sangre, que a su vez, permite la liberación de las gonadotropinas de la hipófisis anterior y el animal regresa al estro. Por lo tanto, la administración de PGF2 alfa o sus análogos sintéticos, resultan en luteolisis durante el diestro, lo cual es seguido por una secuencia normal de eventos endocrinos y fisiológicos que preceden el estro (Manríquez, 1990) Sincronización con dispositivos intravaginales de progesterona (CIDR-G). Se ha demostrado que el uso de progesterona es menos potente que los progestágenos, se recomienda aplicar en hembras donantes 2 dosis de CIDRS por oveja, reemplazando la primera a los 8 días después de la inserción del primer CIDR y antes de iniciar las inyecciones de gonadotropinas, esto por que suelen algunas ovejas presentar celo aún estando con el CIDR, debido a la baja en el nivel de 13

17 progesterona en la sangre a partir del día 8 después de la inserción, al reemplazar el CIDR el día 8, se restablece un alto nivel de progesterona (Corteel et al.,1988). En el caso de las receptoras en que no se usan altos niveles de gonadotropinas, con un solo CIDR por oveja es suficiente. La ventaja de utilizar CIDRS radica en que son más fáciles de aplicar y el porcentaje de pérdidas de CIDRS es muy bajo comparado al de las esponjas intra vaginales de progetágenos, observándose menos adherencias vaginales, hemorragias, secreciones pútridas (Walker et al., 1989) Método de sincronización con la utilización de esponjas intravaginales con progestágenos (FGA acetato de fluorogestona). Esta técnica consiste en la utilización de esponjas intra vaginales impregnadas con algún progestágeno. Las esponjas Chronogest contienen 30, 40, ó 45 mg. de acetato de fluorogestona (FGA), como progestágeno sintético. Se ha sugerido que 30 mg de (FGA) puede ser utilizada en ovejas con anestro, las de 40 mg. en hembras en la estación reproductiva y para hembras vírgenes, 45 mg. Para cabras en todas las épocas (Álvarez, 1997). Este tratamiento actúa de la misma forma que un cuerpo lúteo suprimiendo la liberación de gonadotropinas hipofisiarias. Al retirar el tratamiento con los progestágenos, la hipófisis incrementa la liberación de gonadotropinas, lo que estimula el crecimiento folicular y la ovulación. El tratamiento con progestágenos no afecta la función del cuerpo lúteo. Para la sincronización efectiva este método debe tener una duración de 12 a 14 días en la oveja (Evans, 1990). Las esponjas intravaginales se insertan dentro de la vagina con ayuda de un aplicador, este debe estar formado por un tubo de plástico y una varilla, este aplicador debe ser cubierto con una solución antiséptica lo que le permite lubricar la vagina y a la vez desinfectar. La esponja se sitúa en el extremo ancho del aplicador y se va empujando con la varilla hacia el extremo angosto dejando el cordel que sujeta la esponja dentro del aplicador. Se coloca la esponja a una profundidad de 10 a 15 cm. con menor profundidad en hembras vírgenes). La hembra debe estar en posición natural o elevando los miembros posteriores, al retirar el aplicador se debe asegurar que el cordel cuelgue unos centímetros. Transcurridos 12 o 14 días se retiran las esponjas, sujetando del cordel y tirando ligeramente hacia abajo y afuera. El retiro de la esponja puede acompañarse de la salida de un líquido fétido, esto es normal salvo que el líquido venga acompañado de pus o sangre que seria un signo 14

18 de infección. Una vez retiradas las esponjas, la mayoría de las hembras presentan estro a 2 a 3 días (Evans, 1990) METODOS DE SUPEROVULACIÓN: Se han estudiado diversos métodos encaminados a producir superovulación en animales domésticos, concentrados generalmente en el empleo de gonadotropinas (PMSG o ecg y FSH, ya sea porcina u ovina). Estos son estimuladores del crecimiento folicular su uso se asocia al tratamiento previo con progestágenos (Forcada, 2003). Los tratamientos de superovulación tienen la finalidad de aumentar la tasa ovulatoria de las hembras a través de la utilización de hormonas gonadotrópicas. El origen biológico de las gonadotropinas utilizadas en los tratamientos de inducción a la superovulación es de dos tipos: Hipofisiario y Coriónico. Entre las de origen hipofisiario destacan el extracto hipofisiario equino (HAP) o la hormona folículo estimulante (FSH) ya sea porcina u ovina (Ramón, 1999). Entre las de origen coriónico las de mayor difusión son: la gonadotropina de suero de yegua preñada (PMSG) y la gonadotropina coriónica humana (hcg). La vida media de las gonadotropinas es variable, por ejemplo: mientras la vida media de la PMSG es larga (de 40 a 125 h.), la de la FSH es corta (110 minutos), debido a esta propiedad los protocolos de estimulación superovulatoria obligan a realizar administraciones únicas o repetidas según sea el caso, a fin de mantener las concentraciones optimas de estímulo (Hunter, 1980). Por otra parte la relación FSH-LH es un factor determinante en la variabilidad de la respuesta ovulatoria (Picazo, 1992). La purificación y disponibilidad comercial de FSH porcino (FSH-P Folltropin; Stimufol; Super-Ov) y ovino (Embryo-S., Ovagen) marcaron la iniciación de nuevas estrategias superovulatorias. Las inyecciones de FSH ya sea en niveles constantes o decrecientes, iniciándose por lo general 3 días antes de la suspensión de tratamiento progestacional siendo la ultima inyección dada ya sea al momento de la suspensión del tratamiento progestacional o 12 horas más tarde (Maxwell et al., 1990). Los tratamientos repetidos de FSH ocasionan una disminución en la respuesta ovulatoria en ovejas. Otro punto de discusión ha sido referente a la forma de aplicar la FSH en inyecciones constantes o decrecientes, recomendándose más las inyecciones decrecientes (Torres et al., 1987). Así también se ha estudiado el uso de 15

19 la relación LH y FSH y se ha observado que mientras mas bajo es el nivel de LH es mejor, existen algunos productos nuevos que no contienen LH pero cuando se usa FSH (Folltropin-V) que contiene 5% de LH la respuesta ovulatoria es muy baja. Al introducir PMSG en los tratamientos de FSH se esta introduciendo un producto con una alta actividad de LH. Cuando se aplica una dosis de FSH temprano en el ciclo durante la fase luteal 4 días después de la inserción del CIRD imitando el pico de FSH que se produce en forma natural en la fase temprana del diestro han dado resultados poco satisfactorios (Rangel, 1991). Es conocido que es la FSH y no la LH la que es necesaria para desarrollar los folículos primarios por lo que se plantea que el reclutamiento de folículos del grupo de folículos sensitivos a gonadotropinas y su desarrollo tiene que estar basado en la utilización de FSH. Se ha estudiado también el uso de la PMSG al momento de la primera aplicación de FSH los cuales estarían induciendo una maduración y/o luteinización folicular muy temprana (Draincourt, 1993). Se ha estudiado que si se aplica PMSG al momento de la remoción del tratamiento progestacional se imita el nivel creciente de LH durante el proestro. La aplicación exógena de FSH y PMSG decrecen la secreción endógena de FSH y los pulsos endógenos de LH, el pico ovulatorio de LH sin embargo, ya que es producido como respuesta a los altos niveles de estrógenos que se generan en el pro-estro e inicio del estro y que son aún más altos en el caso de superovulación (Bevers, 1988). Existen distintos protocolos para la realización de la superovulación. Los primeros tratamientos se basan en la utilización de progestágenos y de ecg la cual se inyecta a una dosis de UI, 1 ó 2 días al final del tratamiento progestágeno. Esta técnica se ha utilizado por años y se ha ido perfeccionando con el tiempo (Nishikawa, 1963). La ecg es muy utilizada en tratamientos superovulatorios. Sin embargo, se han encontrado tres inconvenientes: uno es la alta producción de folículos no ovulatorios y que secretan una gran cantidad de estradiol que es ocasionada por la larga vida media de ecg y hace que se dificulte el transporte de gametos y puede provocar luteólisis prematura. El segundo problema que se presenta es activación prematura de la meiosis por su fuerte acción como LH y el tercero y más importante es la aparición de anticuerpos contra ecg que se producen después de tratamientos consecutivos y provocan una disminución de la eficacia del tratamiento (Baril,1998; Cognie, 2002). 16

20 Las superovulaciones inducidas con FSH han mostrado mejor respuesta que los animales tratados con ecg en términos de tasa de ovulación, fertilización y calidad embrionaria. Existen dos tipos de FSH en el mercado la FSH porcina (pfsh) y la FSH ovina (ofsh). Se ha comprobado que el uso continuo de pfsh provoca la aparición de anticuerpos en caprinos, por lo que es recomendable después de aplicar 3 tratamientos de pfsh al mismo animal, cambiar a ofsh o directamente utilizar esta última, pero tiene la desventaja de que es más cara y difícil de conseguir. Su administración es continua debido a su corta vida media (pfsh=5h), por lo cual la FSH se debe administrar en 6-8 inyecciones, cada 12 horas 3 o 4 días antes de terminar el tratamiento con progestágeno. Existe la alternativa de administrar la FSH en dosis decrecientes y combinarla con LH para inducir el pico preovulatorio y de esta forma aumentar la respuesta ovulatoria. También es posible mezclar FSH con una dosis reducida de ecg ( UI) para disminuir los efectos indeseables de ambas (Cognie, 1999) COLECCIÓN DE EMBRIONES.- La colección de embriones se realiza del día 6 al 7 después de la aparición del servicio de monta en ovinos, por medio de lavados de los cuernos uterinos. En las cabras se realiza al día 7 ú 8, ya que hay un mayor porcentaje de blastocistos y el embrión se encuentra dentro de la zona pelúcida (Baril, 1993). La colección de embriones se puede ejecutar por distintos métodos: laparotomía, laparoscopia y por vía vaginal (Romano, 2002). Laparotomía.- Fue de las primeras técnicas utilizadas para la colección de embriones. para llevarla a cabo es necesaria la anestesia del animal, después de tener la zona de incisión desinfectada se procede a hacer una incisión de 8 a 10 cm sobre la línea alba delante de la ubre y se exteriorizan los cuernos uterinos y se evalúan los ovarios. Se hace una punción en la base del cuerno uterino a nivel del ligamento intercorneal para introducir la sonda Folley (número 8) en la luz uterina y se infla el globo para evitar la salida del líquido, en el extremo opuesto cerca de la unión útero-tubárica se realiza otra punción donde se coloca un catéter de 1-2 cm y se fija con un clamp vascular para obstruir la luz. Se inyecta el líquido de colección (40-50 ml. de PBS a 37 C) en el extremo superior del cuerno y se colecta por el lado contrario, luego el líquido se coloca en un tubo Falcón y se introduce en un baño María a 37 C. Después de realizar el lavado de ambos cuernos, se introduce una solución con antibiótico (1millon de UI de penicilina) en la cavidad abdominal y se recomienda seguir con el 17

21 tratamiento por 3 días por vía sistémica. Por último se sutura y se espera la recuperación del animal. La laparotomía presenta un alto porcentaje de recuperación de embriones (70-90%), pero el mayor inconveniente es la presencia de adherencias que afectan las recolecciones posteriores por lo que sólo se puede realizar 3 recolecciones por hembra, sin embargo es la técnica más utilizada por tener la ventaja de ser fácil y rápida (Baril,1989). Laparoscopía.- Esta técnica se comienza a aplicar en cabras a partir de La recuperación de los embriones es de un 10% a un 15% menor que en la laparotomía, pero permite la recolección repetida de las hembras al disminuir las adherencias (Baril,1995). El animal se anestesia y se coloca en la mesa, se rasura y se limpia el vientre, después se realiza una pequeña punción a 4-5cm delante de la ubre y a 10-15cm a la izquierda de la línea alba para insertar la cánula para introducir el endoscopio, se inyecta aire y se realiza otra punción a 5cm de la línea alba al lado opuesto de la primera, donde se introduce la pinza atraumática y se cuentan los cuerpos lúteos de cada ovario. Se realiza una tercera punción al costado de la línea alba donde se introduce la sonda de colección de 3 vías y se hace una punción cerca de la bifurcación uterina para introducir la sonda al cuerno, luego se infla el globo de la sonda para obstruir la luz uterina. A continuación se introduce el catéter por dentro de la sonda y se lleva hasta lo más cerca posible de la unión útero-tubárica. Con una pinza atraumática se fija sobre el istmo para evitar la salida del líquido. El líquido de recolección se introduce por la sonda (40-50ml por cuerno) y se recupera por el catéter en el caso de la sonda de 3 vías (Baril, 1989, Baril, 1995). Via vaginal.- Este método es ampliamente utilizado en bovinos pero en los pequeños rumiantes se dificulta por razones anatómicas. Sin embargo, los estudios de Pereira muestran que la vía de recolección transcervical con un catéter especial es posible, pero tiene la desventaja que no todas las hembras pueden ser colectadas por diferencias intraespecie o por ser nulíparas y se necesita más tiempo y manejo por animal (Pereira, 1998). Después de la colecta por cualquiera de los métodos mencionados se buscan los embriones obtenidos y se colocan en una caja de Petri con PBS y 0.4%BSA o 10% de suero ovino o caprino. Se hace el examen morfológico en el cual se evalúa la integridad de la zona pelúcida, el grado de desarrollo embrionario y su apariencia según el estado de desarrollo. Por último se transfieren o se crioconservan por medio de los métodos existentes (Baril, 1995). 18

22 2.8.- RESULTADOS DE LA TRANSFERENCIA DE EMBRIONES EN OVINOS La Sociedad Internacional de Transferencia de Embriones ( IETS por sus iniciales en inglés), realiza encuestas a nivel mundial entre sus afiliados para conocer el número de donadoras recolectadas, embriones obtenidos in vivo e in vitro, embriones congelados, embriones transferidos en fresco o después de descongelar, en bovinos, ovinos, caprinos, búfalos, equinos, porcinos y otras especies (incluyendo humanos). Los resultados de estas encuestas muestran que a nivel mundial se transferían anualmente 200,000 embriones bovinos a finales de la década de 1980, en los primeros años de la década de 1990 aumentó de 250,000 a 300,000, manteniéndose en constante aumento hasta 1996, en que se llegó a pasar de 400,000, el 1997 disminuyó a 360,000, pero en los últimos años de la década se recuperó para llegar a más de 500,000. En los primeros años del siglo XXI ha seguido en aumento la cifra alcanzando los 600,000 embriones de bovinos transferidos anualmente. De las mismas encuestas se desprende que alrededor del 50% de las transferencias son con embriones frescos y el otro 50% con embriones congelados. La gran mayoría son embriones producidos in vivo. En cuanto a la distribución por regiones, en América del Norte se transfiere el 38% del total, 25% en Europa, 18% en Sudamérica, 10% en Asia, 8% en Oceanía y 1% en África. Los principales países exportadores de embriones son Estados Unidos con 25,000 embriones al año y Canadá con 15,000. México participa con el 1% de los embriones transferidos a nivel mundial. A finales de la década de 1990 se reportaron a la IETS 390 donadoras recolectadas y 4,000 embriones transferidos anualmente. En los primeros años de nuestro siglo las cifras han aumentado llegándose a transferir alrededor de 6,000 embriones bovinos. Su aplicación en nuestro país presenta fluctuaciones debidas a la situación económica general, al desconocimiento de las ventajas del procedimiento y a los resultados obtenidos con anterioridad. En algunos casos ya se tienen varios años trabajando con la técnica y se ha llegado a la conclusión de que los ganaderos la consideran la mejor y más barata herramienta para multiplicar y comercializar la genética élite ganadera, donde se compran recolecciones de donadoras en 8, 10 y hasta 13 mil dólares, garantizando sólo 6 embriones viables, sin ninguna garantía de gestación, pagando el comprador los gastos de superovulación y recolección; son muchos los ganaderos mexicanos que participan en dichas subastas. En Centro y Sudamérica están comprando embriones congelados procedentes de México, de varias razas, principalmente brahmán y Sardo Negro y varias de B. Taurus (Memoria, Shering- Plogh). 19

23 Estudios realizados en México en ovejas pelibuey han reportado los siguientes resultados; en un trabajo experimental se estudio la taza de ovulación en relación al tamaño de útero en 9 ovejas; 5 ovejas con un útero chico tuvo una taza de ovulación (media) 13.2 con un rango de mientras que en 4 hembras con útero grande se observó una taza de ovulación (media) 15.0 y un rango de , traduciéndose esto en el numero de embriones ; para las hembras con útero chico la media de embriones totales fue de 1.6 y el rango de 0-5., mientras que para las 4 hembras con útero grande la media fue de 14.0 embriones con un rango de 9 a 18 (Rangel, 1991). En otro estudio se trabajó con 7 donadoras de raza Dorper, observándose una taza de ovulación de 10.14, 5 embriones transferibles promedio, un % de gestación y una sobrevivencia embrionaria de (Rangel, 1991). En un programa de superovulación y transferencia de embriones, se trabajó con 15 vientres pelibuey, obteniéndose los siguientes resultados: El 93% de un total de 14 hembras respondieron al tratamiento superovulatorio con un promedio de 19.6 cuerpos lúteos y 14.4 cuerpos lúteos por donadora, se obtuvieron un total de 100 embriones viables con un promedio de 7.7 embriones por donadora (Ramón, 1991). 20

24 III.- MATERIAL Y METODOS ZONA DE ESTUDIO.- La presente investigación se realizó en la Posta Ovina del rancho San Francisco, propiedad de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Autónoma de Chiapas, que se ubica a la altura del kilómetro 8.5 de la carretera Terán - Vicente Guerrero, en el municipio de Tuxtla Gutiérrez, Chiapas, el cual se encuentra dentro de las coordenadas 16º 44 de latitud norte, 93º 16 de longitud oeste, a una altura de 550 msnm y a una temperatura media anual de 24.2º C en primavera y de 20º C en invierno, con una precipitación pluvial de mm. La zona se encuentra geográficamente dentro de la depresión central del Estado de Chiapas, ocupando el 50% del total de valles del estado y está en los márgenes de los ríos y arroyos que conforman la cuenca del río Grijalva. Su suelo se clasifica mayormente como arcilloso, arenoso y arcillo-arenoso (García, 1988) METODOLOGÍA.- Para el presente estudio se seleccionaron un lote de 12 borregas de la raza Pelibuey, con un promedio de peso de 28 kilogramos, y en edades que fluctúan de los 12 a 18 meses, Se formaron dos grupos de animales de 6 hembras cada uno, el grupo testigo y experimental. Después de la selección, las hembras fueron identificadas con aretes que contienen un número progresivo y separadas en los dos grupos de estudio, para posteriormente ser colocadas en corraletas en donde estuvieron estabuladas durante 20 días, administrándoles una alimentación balanceada a base de rastrojo de sorgo molido, sorgo molido, concentrado comercial al 40 %, melaza, sales minerales y agua a libre acceso, con un porcentaje de proteína cruda del 16 %. También durante este tiempo fueron desparasitadas, utilizando para ello un endectocida de amplio espectro 21