Horacio Maldonado Lorca, MSc.

Transcripción

1 ENZIMAS Horacio Maldonado Lorca, MSc. Laboratorio de Comunicaciones Celulares Instituto Milenio de Neurociencia Centro de Estudios Moleculares de La Célula Facultad de Medicina Universidad de Chile

2 ACCIÓN Las enzimas son biocatalizadores complejos de gran especificidad y eficiencia, producidas por las células de organismos vivos, que aumentan la velocidad de las reacciones biológicas a través de vías bien definidas y cuya actividad está sujeta a regulación

3 CARACTERÍSTICAS DE LAS ENZIMAS Las enzimas son agentes catalizadores de los sistemas biológicos Todas las enzimas son proteínas excepto las ribozimas Aumenta la velocidad de una reacción hasta por un factor de Son altamente específicas Son más eficientes Muchas enzimas presentan regulación de su actividad

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7 COMPARACIÓN DE UNA REACCIÓN CATALIZADA ENZIMÁTICAMENTE CON UNA NO CATALIZADA ENZIMÁTICAMENTE. CAMBIO DE CAMINO DE LA REACCIÓN AUMENTA EL FACTOR ENTÁLPICO

8 CINÉTICA

9 CINÉTICA Vmax o Vm: velocidad máxima de la reacción, sustrato saturante Km: constante de Michaelis, conc de S para semisaturar a la enzima

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12 Expresión de una actividad enzimática Como no siempre se dispone de una enzima pura, la concentración de una enzima se expresa en UNIDADES ENZIMATICAS Unidad enzimática: es la cantidad de enzima que produce la transformación de un mol/mmol/µmol de sustrato en producto por unidad de tiempo (h, min, s), bajo condiciones definidas. Actividad específica: Unidades/mg proteína Actividad total: Unidades x volumen

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18 CLASIFICACIÓN GENERAL 1. Oxidorreductasas: Oxidación-Reducción Ejemplo: Lactato deshidrogenasa

19 2. Transferasas: Tranferencia de grupos deuna molécula a otra (amino, carboxilo, metilo,fosforilo, etc.)

20 3. Hidrolasas: Ruptura hidrolítica de enlaces químicos (C=O, C-N, C-C)

21 4. Liasas: ruptura de enlaces (C-C, C-S, C-N, se excluye el enlace peptídico) pero no por hidrólisis se forma doble enlace

22 5. Isomerasas: Transforman de una forma isomérica a otra

23 6. Ligasas: Ligación de dos sustratos a expensas de hidrólisis de ATP Reacción: Amino acid + ATP aminoacyl-amp + PP i Aminoacyl-AMP + trna aminoacyl-trna + AMP

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25 CLASIFICACIÓN EN ALIMENTOS

26 Esterasas Carbohidrasas Proteasas HIDROLASAS Lipasas Fosfatasas Clorofilasas Pectinoesterasa Hexosidas as Poliasas Proteinasas Peptidasas Catepsinas Renina, Quimosina

27 Oxidasas Deshidrogenasas DESMOLASAS Oxidasas Férricas Xantino Oxidasas Oxidasas Cúpricas Lipoxidasa

28 ACCIÓN EN LOS ALIMENTOS Todo Alimento Constituye un complejo sistema biológico, cuyas células contendrán después de la muerte o cosecha el conjunto de enzimas que eran necesarias para su metabolismo. Por Tanto existirán enzimas que provoquen efectos deseados, como algunas que provoquen efectos no deseados en los alimentos

29 EFECTOS BENEFICIOSOS Rigidez cadavérica y posterior maduración de la carne. Preparación de malta o cebada germinada La elaboración de la masa del pan por acción de enzimas del cereal y levadura. La maduración de la crema y el queso. La maduración de Frutas. Enzimas que intervienen en la elaboración del té negro (polifenoloxidasas). Fermentación de las semillas del cacao Etc.

30 EFECTOS NO DESEADOS Pardeamiento de alimentos. (tirosinasa, catecolasa, lacassa, abcorbico-oxidasa, polifenol-oxidasas) Destrucción de Nutrientes Ej: Lipoxidasa : Destruye a los carotenos y a la vitamina A de Frutas y hortalizasas (actua sobre doble enlace de compuestos insaturados) Tiaminasa: Destruye a la tiamina y se encuentra en mariscos.

31 INHIBICIÓN DE ENZIMAS EN LOS ALIMENTOS Inactivación por calor (HT-ST, Escaldado o Blanching) Inactivación por microondas y ultrasonido Inhibición por aditivos (ácidofórmico, ácido monocloro, ácido bórico, amonio cuaternario, etc) Inhibición por componentes de los alimentos (Factor anititriptico, aglucagon)

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37 REGENERACIÓN ENZIMÁTICA Enzimas que se han inactivado pueden recuperar su actividad, tal es el caso de Peroxidasas, Fosfatasas, entre otras. La investigación de la peroxidasa ha sido usada para evaluar la eficiencia del escaldado o blanqueo de verduras y también en el control de pasteurización de la leche. Así, a la temperatura de pasteurización, la lactoperoxidasa se inactiva, pero se regenera; en cambio, si la leche es sobrecalentada (más de C) la peroxidasa pierde su actividad en forma definitiva.

38 USO INDUSTRIAL

39 DE DONDE SE OBTIENEN? Las principales fuentes de enzimas usadas en la industria son: 1. Vegetal: Lipasas, amilasas pectinoesteras, proteasas, peroxidasas. 2. Animal: Renina, Pepsina Tripsina, Catalasa, lispasas. 3. Microbiano: Proteasas, Carbohidrasas. Catalasa.

40 USOS INDUSTRIALES

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42 COMO SE OBTIENEN? Uso de extractos o caldo fermentado Adsorción selectiva Por precipitación Diálisis Ultrafiltración Electroforesis Fraccionamiento Cromatográfico Producción de enzimas recombiantes.

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45 ULTRAFILTRACIÓN

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53 ENZIMAS INMOVILIZADAS

54 MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN Retención física Sin formación de enlaces covalentes Inmovilización química Con formación de enlaces covalentes Adsorción Atrapamiento o inclusión Unión covalente Entrecruzamiento

55 Inmovilización por Adsorción Métodos de Inmovilización Interacción física, no específica (puentes de hidrógeno interacciones hidrofóbicas, interacciones iónicas, interacciones de van der Waals) entre la proteína enzimática y el soporte. El método más sencillo De aplicación general Coste moderado Uniones Reversibles No covalentes Estabilidad limitada, se requiere un control riguroso de las condiciones de trabajo para evitar pérdidas de enzima por desorción. Alumina, carbón activo, vidrio Resinas cambiadoras

56 Métodos de Inmovilización Atrapamiento o inclusión en un gel, polímero o matriz porosa Formación de un polímero altamente entrecruzado en presencia de la enzima. Esta queda atrapada en los poros de la matriz polimérica formada. Se requiere controlar las condiciones de polimerización para que no se produzcan alteraciones en la molécula enzimática Se puede perder proteína lentamente Se pueden obtener membranas con enzimas inmovilizadas De aplicación general Gel de poliacrilamida Polímeros conductores

57 Métodos de Inmovilización Métodos Químicos no polimerizantes- Unión covalente Formación de enlaces covalentes entre el enzima y el soporte pero no entre las moléculas de enzima. El tipo de soporte determina la química de la inmovilización Soporte Enzima Activación para obtener grupos funcionales reactivos Grupo funcional -CONH 2 -COOH -NH 2 -OH -Si(OH) 3 Soporte Poliacrilamida Carboxymetilcelulosa Poliestireno, nylon Celulosa, agarosa, sephadex Vidrio poroso Unión a través de las cadenas laterales de los aminoácidos de la secuencia polipeptidica de la proteína -NH 2 Lisina -OH-Ph Tirosina -COOH Aspartato Glutamato -SH Cisteina -OH Serina -N imidazol Histidina Asegurar que el centro activo de la enzima no se ve afectado por los reactivos empleados en el proceso de inmovilización. Se puede proteger el centro activo con un análogo del sustrato o un inhibidor competitivo durante el proceso de inmovilización.

58 Métodos de Inmovilización Entrecruzamiento Formación de enlaces covalentes intermoleculares (entre moléculas de enzima) y entre estas y el soporte Cantidades altas de proteína inmovilizada resistentes a condiciones extremas de ph y temperatura Las redes de moléculas entrecruzadas que se forman dificultan el acceso del sustrato al centro activo Pérdidas de actividad tras la inmovilización altas Reactivos bifuncionales más utilizados CHO (CH 2 ) 3 N 2 N 2 ICH 2 O C H N (CH 2 ) 6 H N O C CH 2 I CHO Glutaraldehido Diazobenzidina O O N O C (CH 2 ) 2 S S Hexametileno-bis(iodoacetamida) O O (CH 2 ) 2 C O N O O Bis(N-hidroxysuccinimidyl)ditiopropionato

59 PROPIEDADES DE LAS ENZIMAS INMOVILIZADAS Las propiedades de las enzimas inmovilizadas difieren de las de las enzimas en disolución debido a efectos del material soporte y a cambios conformacionales de la enzima Inmovilización Efectos sobre la estabilidad Efectos en las propiedades cinéticas

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61 ENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA

62 INDUSTRIA PANADERA Alfa y Beta amilasa mejora el valor panificador de harinas adecuado y mantenido desprendimiento de anhídrido carbónico C 12 H 22 O 11 +H 2 O >2 C 6 H 12 O 6 Maltosa Agua Glucosa C 6 H 12 O 6 > 2 CH 3 CH 2 OH + 2 CO 2 Glucosa Etanol Dióxido de carbono

63 Proteasas Depende de la harina y otros ingredientes de la masa, utilizada en harinas de trigo duro, ricas en gluten. Producen mayor extensibilidad y elasticidad de la masa. Ej. Papaína se usa 15 a 20 minutos en el reposo de la masa.

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69 ALIMENTOS AZUCARADOS Invertasa o sacarasa hidrólisis de la sacarosa en glucosa y fructosa Aplicación: transformación lenta y parcial de la sacarosa en azúcar invertido que tiene mayor poder edulcorante, mayor carácter humectante, mayor solubilidad y, por lo tanto, menor tendencia a cristalizar y endurecer.

70 Glucoamilasa Hidroliza los enlaces 1,4 y 1,6 del almidón (tanto amilosa como amilopectina) Aplicación: Se usa para la elaboración enzimática de jarabe de glucosa y de glucosa a partir de almidón

71 o Glucoisomerasa Cataliza la isomerización de glucosa en fructosa. Aplicación: se puede transformar la glucosa resultante mediante la glucosa-isomerasa para lograr jarabes de alto poder edulcorante a partir de almidón de maíz o de papa (16). o Celulasas Se trata de un complejo de por lo menos 3 enzimas, que en conjunto son capaces de desdoblar la celulosa hasta glucosa. Aplicación: laboración futura de glucosa y productos azucarados a partir de residuos celulósicos de bajo costo y abundante disponibilidad

72 INDUSTRIA DE LA CARNE Y DERIVADOS Papaína Bromelina Ficina Proteasas microbianas Todas estas proteasas hidrolizan gran número de proteínas diferentes a través de polipéptidos hasta aminoácidos; también desdoblan amidas y ésteres de aminoácidos. Aplicación: Durante el proceso de maduración de la carne que sigue al de rigidez cadavérica. La maduración natural suele ser prolongada (12 días), se puede acelerar artificialmente mediante la adición de proteasas extrañas para así aumentar la ternura de la carne (meat tenderizer). Al atacar por proteólisis las fibras musculares y /o los componentes del tejido conectivo ( colágeno, elastina, actomiosina) se logra un relajamiento de los enlaces peptídicos de las proteínas y con ello el ablandamiento de la carne.

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74 INDUSTRIA LECHERA Renina, Quimosina o fermento Lab Enzimas Coagulantes de origen microbiano Enzimas Auxiliares de la maduración de quesos. Lactasa

75 REACCIONES ENZIMÁTICAS CUAJADA QUESOS Se basa en el empleo de una enzima proteolítica como la renina o quimosina, producida en el abomaso de los rumiantes lactantes, como terneros o cabritos. Las enzimas actúan cuando las condiciones de la "leche sustrato" son adecuadas, éstas atacan (proteólisis limitada) a la caseína κ, la cual junto con las caseínas α y ß forman la micela. Éstas últimas se vuelven "precipitables" por el ión Ca ++ del suero, iniciándose así la formación de una red o malla tridimensional de fosfo-caseinato de calcio que es el origen de la cuajada y el calcio.

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79 FRUTAS Y HORTALIZAS Pectino-estereasa: Produce la hidrólisis de la pectina, pérdida de las características de turbidez de algunos jugos y néctares. (clarificación) Pectinasa, Poligalacturonidasa Desdoblamiento hidrolítico de los enlaces glucosídicos de las cadenas de pectina. Clarificación. Enzima del aroma o flavorasas Conjunto de enzimas que participan en el aroma y sabor Glucosa oxidasa Evita destrucción de aromas y pigmentos

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81 INDUSTRIA CERVECERA Y LICORERA Las enzimas α y β amilasas naturalmente presentes en el grano actúan sobre el almidón produciendo dextrinas y maltosa, que sirven como sustratos para la fermentación posterior. Las proteasas degradan proteínas formando aminoácidos y péptidos. En General se usan para: Mejorar la licuefacción del almidón, Regular el contenido de azúcar y nitrógeno Mejorar la extracción, Facilitar la filtración Controlar la turbidez En General se usan para: NO OLVIDAR EL PROCESO DE FERMENTACIÓN

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