T E S I S QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRÍA EN CIENCIAS EN BIOMEDICINA MOLECULAR

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1 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE MEDICINA Y HOMEOPATÍA SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN MAESTRÍA EN CIENCIAS EN BIOMEDICINA MOLECULAR Evaluación de la actividad antitumoral de diferentes extractos de varias especies de Kalanchoe en una línea celular de Cáncer de Próstata T E S I S QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRÍA EN CIENCIAS EN BIOMEDICINA MOLECULAR P R E S E N T A: ARIAS GONZÁLEZ IVÁN DIRECTOR DE TESIS: DRA. CYNTHIA ORDAZ PICHARDO México, D. F., Diciembre del

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4 ÍNDICE PÁGS. RESUMEN I ABSTRACT III 1 INTRODUCCIÓN CÁNCER CARACTERÍSTICAS DEL CÁNCER Señalización proliferativa continua Evasión de los supresores de crecimiento Resistencia a muerte celular Inmortalidad replicativa Inducción de angiogénesis Activación de la invasión y metástasis Reprogramación de la energía metabólica Evasión de la respuesta inmune Microambiente tumoral APOPTOSIS Características morfológicas de la apoptosis Necrosis Mecanismos de apoptosis Características bioquímicas de la apoptosis Caspasas Vía extrínseca Vía intrínseca Regulación de la apoptosis por la familia bcl Regulación de la apoptosis por IAPs EPIDEMIOLOGÍA DEL CÁNCER A NIVEL MUNDIAL Y EN MÉXICO LA PRÓSTATA Cáncer de próstata Desarrollo del cáncer de próstata Bases moleculares del cáncer de próstata FACTORES DE RIESGO 30 4

5 1.7 SINTOMATOLOGÍA ESTADIOS Y DIAGNÓSTICO Grado Gleason TRATAMIENTO MEDICINA TRADICIONAL 38 2 ANTECEDENTES MEDICAMENTOS COMERCIALES OBTENIDOS DE PLANTAS OTROS ESTUDIOS REALIZADOS CON PLANTAS CON PROPIEDADES ANTICANCERÍGENAS COMPUESTOS NATURALES QUE INDUCEN APOPTOSIS EN CÉLULAS CANCEROSAS FAMILIA Crassulaceae GÉNERO Kalanchoe ESTUDIOS REALIZADOS AL GÉNERO Kalanchoe 46 3 JUSTIFICACIÓN 47 4 HIPÓTESIS 49 5 OBJETIVO GENERAL OBJETIVOS ESPECÍFICOS 49 6 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL 50 7 MATERIALES Y MÉTODOS OBTENCIÓN DE LA INFORMACIÓN ETNOBOTÁNICA, COLECTA E IDENTIFICACIÓN TAXONÓMICA DE Kalanchoe sp Obtención de la información etnobotánica Colecta de la planta Identificación taxonómica de Kalanchoe sp Elaboración de los extractos de diferentes polaridades de Kalanchoe sp. 52 IDENTIFICACIÓN DE ALGUNAS DE LAS FAMILIAS DE LOS METABOLITOS POR CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA Cromatografía de capa fina EVALUACIÓN DE LA CITOTOXICIDAD DE LOS EXTRACTOS EN UNA LÍNEA CELULAR DE CÁNCER DE PRÓSTATA (PC3) Y EN UN CULTIVO PRIMARIO NO CANCEROSO (LINFOCITOS) Cultivo celular 55 5

6 7.3.2 Almacenamiento y congelamiento Evaluación de la citotoxicidad Técnica de MTT Procedimiento Técnica de cristal violeta Procedimiento Análisis de resultados EVALUACIÓN DE LA GENOTOXICIDAD DE LOS EXTRACTOS Prueba de ames Técnica de incorporación (procedimiento) Análisis de los datos SELECCIÓN DEL EXTRACTO DETERMINACIÓN DE LOS EFECTOS APOPTÓTICOS DEL EXTRACTO Proteína Anexina V FITC procedimiento Análisis en el citómetro de flujo EXPRESIÓN DE MARCADORES DE MUERTE CELULAR POR WESTERN BLOT Determinación de la concentración de proteínas Análisis de la expresión de las proteínas Preparación de las muestras Preparación del gel Electroforesis Electrotransferencia Bloqueo e incubación con anticuerpos Revelado 64 8 RESULTADOS OBTENCIÓN DE LA INFORMACIÓN ETNOBOTÁNICA, COLECTA E IDENTIFICACIÓN TAXONÓMICA Identificación taxonómica Información etnobotánica Colecta Rendimiento de cada uno de los extractos de diferentes polaridades de Kalanchoe sp. 69 6

7 8.2 IDENTIFICACIÓN PRELIMINAR DE ALGUNAS FAMILIAS DE METABOLITOS PRESENTES EN Kalanchoe POR CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA 8.3 ENSAYOS DE CITOTOXICIDAD Citotoxicidad en células de cáncer de próstata PC Citotoxicidad en células mononucleares de sangre periférica ENSAYOS DE GENOTOXICIDAD ANÁLISIS DE APOPTOSIS POR CITOMETRÍA DE FLUJO ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS APOPTÓTICAS Vía intrínseca de la apoptosis Vía extrínseca de la apoptosis Reguladores de apoptosis DISCUSIÓN CONCLUSIONES PERSPECTIVAS BIBLIOGRAFÍA ANEXOS 123 7

8 ÍNDICE DE FIGURAS PÁGS. Figura 1. Características del cáncer 2 Figura 2. Características emergentes del cáncer 2 Figura 3. Microambiente tumoral 8 Figura 4. Apoptosis y necrosis 9 Figura 5. Representación esquemática de los eventos apoptóticos 11 Figura 6. Activación de caspasas mediadas por receptor 12 Figura 7. Activación de caspasa mediada por la formación del apoptosoma 14 Figura 8. Regulación de la apoptosis por la familia Bcl-2 15 Figura 9. Tasa de incidencia de cáncer en el mundo 17 Figura 10. Valores de incidencia de cáncer en hombres a nivel mundial 18 Figura 11. Valores de incidencia de cáncer en mujeres a nivel mundial 18 Figura 12. Incidencia y mortalidad del cáncer en hombres y mujeres a nivel 20 mundial Figura 13. Incidencia y mortalidad del cáncer en hombres y mujeres en México 20 Figura 14. Anatomía de la próstata 21 Figura 15. Zonas de la próstata donde se desarrolla el cáncer 22 Figura 16. Distribución mundial del género Kalanchoe 45 Figura 17. Esquema de la estrategia experimental de la investigación 50 Figura 18. Ubicación geográfica del estado de tabasco 52 Figura 19. Transformación del MTT a formazán. Espectro de absorción del 56 formazán en disolución con el DMSO, presentando un máximo de absorbancia a 570 nm Figura 20. Representación gráfica de un cuadrante con datos de una de las 61 características de la apoptosis obtenido por citometría de flujo Figura 21. Kalanchoe pinnata 66 Figura 22. Kalanchoe gastonis-bonnieri 67 Figura 23. Kalanchoe flammea 67 Figura 24. Colecta de Kalanchoe flammea 69 Figura 25. Integridad de proteínas totales de la línea celular PC3 en un gel 97 de poliacrilamida al 15% Figura 26. Análisis de la expresión de β-actina (proteína constitutiva) 97 Figura 27. Análisis de la expresión de procaspasa-9 98 Figura 28. Análisis de la expresión de la expresión de procaspasa-3 98 Figura 29. Análisis de la expresión de la expresión de procaspasa-8 99 Figura 30. Análisis de la expresión de la expresión de procaspasa Figura 31. Análisis de la expresión de XIAP 101 Figura 32. Análisis de la expresión de la expresión de PKCε 101 8

9 ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Resumen de estadísticas de incidencia y mortalidad por cáncer 19 Tabla 2. Comparación entre las diferentes razas en incidencia y mortalidad de CaP 31 Tabla 3. Tratamientos del cáncer de próstata con base al estadio 31 Tabla 4. Información etnobotánica de plantas usadas contra el cáncer en el estado de 35 Tabasco Tabla 5. Rendimientos de los extractos a partir de 1 kg de planta 69 Tabla 6. Fase móvil usada en la cromatografía en capa fina de los extractos de las tres 70 especies de Kalanchoe Tabla 7. Resultado del estudio fitoquímico preliminar del extracto etanólico de K. 71 pinnata Tabla 8. Resultado del estudio fitoquímico preliminar del extracto con acetato de etilo 72 de K. pinnata Tabla 9. Resultado del estudio fitoquímico preliminar del extracto hexánico de K. 73 pinnata Tabla 10. Resultado del estudio fitoquímico preliminar del extracto etanólico de K. 74 gastonis-bonnieri Tabla 11. Resultado del estudio fitoquímico preliminar del extracto con acetato de etilo 75 de K. gastonis-bonnieri Tabla 12. Resultado del estudio fitoquímico preliminar del extracto hexánico de K. 76 gastonis-bonnieri Tabla 13. Resultado del estudio fitoquímico preliminar del extracto etanólico de K. 77 flammea Tabla 14. Resultado del estudio fitoquímico preliminar del extracto con acetato de etilo 78 de K. flammea Tabla 15. Resultado del estudio fitoquímico preliminar del extracto hexánico de K. 79 flammea Tabla 16. Grupos químicos mayoritarios identificados en las tres especies de Kalanchoe 80 Tabla 17. Ic 50 obtenidos por la técnica de MTT 82 Tabla 18. Ic 50 obtenidos por la técnica de cristal violeta 84 9

10 ÍNDICE DE GRÁFICAS Gráfica 1. Porcentaje de viabilidad de células pc3 expuestas a diferentes extractos de K. pinnata con la técnica de MTT Gráfica 2. Porcentaje de viabilidad de células pc3 expuestas a diferentes extractos de K. gastonis-bonnieri con la técnica de MTT Gráfica 3. Porcentaje de viabilidad de células pc3 expuestas a diferentes extractos de K. flammea con la técnica de MTT Gráfica 4. Porcentaje de viabilidad de células pc3 expuestas a diferentes extractos de K. pinnata con la técnica de CV Gráfica 5. Porcentaje de viabilidad de células pc3 expuestas a diferentes extractos de K. gastonis-bonnieri con la técnica de CV Gráfica 6. Porcentaje de viabilidad de células pc3 expuestas a diferentes extractos de K. flammea con la técnica de CV Gráfica 7. Porcentaje de viabilidad obtenido por diferentes extractos de K. pinnata con la técnica de MTT en PBMC Gráfica 8. Porcentaje de viabilidad obtenido con diferentes extractos de K. gastonisbonnieri con la técnica de MTT en PBMC Gráfica 9. Porcentaje de viabilidad obtenido con diferentes extractos de K. flammea con la técnica de MTT en PBMC Gráfica 10. Porcentaje de viabilidad obtenido con diferentes extractos de K. pinnata 86 con la técnica de CV en PBMC Gráfica 11. Porcentaje de viabilidad obtenido con diferentes extractos de K. gastonisbonnieri con la técnica de CV en PBMC 87 Gráfica 12. Porcentaje de viabilidad obtenido con diferentes extractos de K. flammea con la técnica de CV en PBMC 87 Gráfica 13. Efectos de los extractos con hexano de K. pinnata, K. gastonis- bonnieri y K. flammea en la cepa TA98 que detecta mutágenos por corrimiento 88 de pares de bases Gráfica 14. Efectos de los extractos con acetato de etilo de K. Pinnata, K. gastonisbonnieri y K. flammea en la cepa TA98 que detecta mutagenos por 89 corrimiento de pares de bases Gráfica 15. Efectos de los extractos con etanol de K. pinnata, K. gastonis- bonnieri y K. flammea en la cepa TA98 que detecta mutagenos por corrimiento 89 de pares de bases Gráfica 16. Efectos de los extractos de hexano con K. pinnata, K. gastonis- bonnieri y K. flammea en la cepa ta100 que detecta mutágenos por sustitución de 90 pares de bases Gráfica 17. Efectos de los extractos con acetato de etilo de K. pinnata, K. gastonisbonnieri y K. flammea en la cepa TA100 que detecta mutágenos por 91 sustitución de pares de bases Gráfica 18. Efectos de los extractos de etanol de K. pinnata, K. gastonis-bonnieri y K. flammea en la cepa TA100 que detecta mutágenos por sustitución de 91 pares de bases

11 Gráfica 19. Efectos de los extractos con hexano de K. pinnata, K. gastonis- bonnieri y K. flammea en la cepa TA102 que detecta mutágenos por la acción de 92 radicales libres Gráfica 20. Efectos de los extractos con acetato de etilo de K. pinnata, K. gastonisbonnieri y K. flammea en la cepa TA102 que detecta mutágenos por la 92 acción de radicales libres Gráfica 21. Efectos de los extractos de etanol de K. pinnata, K. gastonis-bonnieri y K. flammea en la cepa TA102 que detecta mutágenos por la acción de 93 radicales libres Gráfica 22. Células sin tratamiento 94 Gráfica 23. Células con DMSO 0.1%. 24 h 94 Gráfica 24. Células con Taxol (4.26 μg/ml) 24 h 94 Gráfica 25. Células con Perezona (24.8 μg/ml) 24 h 94 Gráfica 26. Células con el extracto con acetato de etilo de Kalanchoe flammea 3h 95 Gráfica 27. Células con el extracto con acetato de etilo de Kalanchoe flammea 6 h 95 Gráfica 28 Células con el extracto con acetato de etilo de Kalanchoe flammea 12 h 95 Gráfica 29. Células con el extracto con acetato de etilo de Kalanchoe flammea 24 h 95 Gráfica 30. Efecto del extracto con acetato de etilo de Kalanchoe flammea en las células PC

12 RESUMEN El cáncer es una enfermedad en la cual las células experimentan un desbalance en la homeostasis de los valores de división y muerte celular, proceso que a su vez procede de una inestabilidad genómica causada por múltiples factores, originando así la capacidad de adquirir múltiples habilidades que finalizan en la progresión de la enfermedad, desarrollo tumoral y su posterior diseminación a diferentes órganos, cuando estos cambios ocurren en células del tejido prostático se origina el Cáncer de Próstata (CaP). El cáncer es una de las enfermedades más predominantes en el mundo. En particular el CaP es uno de los más incidentes y es la primera causa de mortalidad por cáncer en la población masculina en nuestro país. Aunque existen diversos tratamientos para tratar el CaP, éstos tienen elevados costos y muchos de ellos no son muy efectivos, ya que se genera resistencia a las diversas terapias, provocando diferentes condiciones, como la condición hormono independiente, un estado en el cual las células prostáticas se tornan más resistentes a la muerte celular por alteraciones múltiples de mecanismos de señalización molecular. Los productos naturales juegan un papel importante ante dicha situación, porque se ha demostrado que éstos modulan la inducción de la apoptosis, suprimiendo la proliferación celular, inhibiendo la invasión y la angiogénesis. Es por ello que la búsqueda de metabolitos secundarios ha sido un recurso atractivo para encontrar nuevos compuestos anticancerígenos. En la medicina tradicional, diversas especies del género Kalanchoe se han utilizado para tratar el cáncer; por lo que en la presente investigación se estudiaron tres diferentes tipos extractos de Kalanchoe pinnata, K. gastonis-bonnieri y K. flammea (Etanólico, con acetato de etilo y hexánico). Primero, se realizó un estudio fitoquímico preliminar para identificar grupos químicos funcionales de metabolitos presentes en los diferentes extractos por cromatografía de capa fina y métodos colorimétricos, los resultados indicaron que los extractos tienen metabolitos secundarios de interés medicinal como lo son terpenos y alcaloides entre otros. Posteriormente se realizaron estudios de citotoxicidad para evaluar el efecto de los extractos sobre la viabilidad en una línea celular de cáncer de próstata hormono independiente (PC3), y en un cultivo primario de linfocitos (células no cancerosas) por las técnicas de MTT y CV. En este caso encontramos que los extractos etanólicos y con acetato de etilo de las tres especies ejercen un efecto dosis respuesta a las 24 h de exposición, obteniendo IC 50 de 5 hasta 50 µg/ml, y ninguno de los extractos fue citotóxico en las células no cancerosas. Por otro lado, se hizo una evaluación genotóxica con la prueba de Ames utilizando el método de incorporación en diferentes cepas de S. typhimurium TA98, TA100 y TA102 que 12 I

13 detectan diferentes mecanismos de mutagenicidad, esto para evidenciar que los extractos podrían ser usados de manera segura. Los datos obtenidos nos indicaron que los extractos con etanol y acetato de etilo de las tres especies de Kalanchoe evaluadas no inducen mutaciones en las diferentes cepas de S. typhimurium a las concentraciones de 50 a 200 µg por placa. El siguiente estudio fue evidenciar el proceso de muerte celular inducido por el extracto que mejor efecto citotóxico mostró en las células cancerosas y que no fue tóxico; el extracto con acetato de etilo de Kalanchoe flammea fue elegido, ya que inhibió a una IC 50 de μg/ml. Primer, se evidenció una de las características que se producen durante la muerte celular por apoptosis (Translocación de la fosfatidilserina hacia la cara externa de la membrana plasmática), para ello se utilizó el kit de Anexina V. Los resultados mostraron que este extracto es capaz de inducir este proceso a la concentración de μg/ml en 24 h, descartando un proceso de muerte celular por necrosis. Por la evidencia anterior, finalmente se evaluó otro de los eventos que se producen durante la activación de la apoptosis, que es la activación de cistein proteasas denominadas caspasas, así que se realizó una Inmunodetección de proteínas obtenidas de células tratadas con el extracto con acetato de etilo de K. flammea a una IC 50 (24 h) para evidenciar el procesamiento en las diferentes caspasas que inducen dos de las principales vías de este proceso (extrínseca e intrínseca), así como la expresión relativa de proteínas que se encuentran sobreexpresadas en CaP, y que contribuyen al mecanismo de resistencia a la apoptosis (XIAP y PKCε). Los resultados obtenidos nos indicaron que el proceso apoptótico es posiblemente mediado por la activación de la vía intrínseca o mitocondrial, ya que hubo activación de caspasas involucradas en esta vía (Caspasa-9) mediando probablemente la activación de la caspasa efectora 7, puesto que no hubo activación de caspasa-3, y por otro lado, tampoco hubo activación en aquellas correspondientes a la vía extrínseca (Caspasa-8 y -10). Cabe destacar que para elucidar un mecanismo más preciso sería necesario evaluar más proteínas involucradas en este proceso, para definir el efecto molecular que ejerce el extracto con acetato de etilo de Kalanchoe flammea, así como otros tipos de pruebas que evidencien su efecto tanto in vitro como en modelos in vivo, y de esta manera se pueda proponer como candidato para el tratamiento del cáncer de próstata. 13 II

14 ABSTRACT Cancer is a disease in which cells undergo an homeostasis imbalance of cell division and death rates, a process resulting in turn of a genomic instability caused by multiple factors, giving rise to the ability to acquire multiple skills ending in the progression of the disease, tumor development and further spread to different organs, when these changes occur in cells of the prostate tissue originates prostate cancer (CaP). Cancer is one of the most prevalent diseases in the world. In particular, the CaP is one of the most incidents and is the leading cause of cancer death among males in our country. Although there are many treatments for CaP, they involve high costs and many of them are not very effective, because they produce resistance to the therapies, leading toward different conditions, such as the hormone independence, a condition in which prostate cells become more resistant to cell death by multiple altered molecular signaling mechanisms. Natural products play an important role in this circumstance, because they have been shown to modulate the induction of apoptosis, suppressing cell proliferation, inhibiting the invasion and angiogenesis. That is why the search for secondary metabolites has been an attractive resource for finding new anticancer compounds. In traditional medicine, various species of the genus Kalanchoe have been used to treat cancer. So, in the present investigation we studied three different extracts of Kalanchoe pinnata, K. gastonis-bonnieri and K. flammea (ethanol, ethyl acetate and hexane dissolvents). A phytochemical study was performed to identify functional chemical groups in the different extracts employing thin layer chromatography and colorimetric methods. It was, concluded that these ones may contain secondary metabolites of medical interest such as terpenes, alkaloids, among others. Later, cytotoxicity studies were realized to evaluate the effect of extracts on the viability of a hormone independent prostate cancer cell line (PC3), and in a primary culture of lymphocytes cells (healthy cells) by MTT and CV assay. In this case we found that the ethanol and ethyl acetate extracts of the three species exert a dose depending response at 24 h of exposure, resulting IC 50 from 5 to 50 µg/ml, and none of them produced cytotoxicity to healthy cells. Moreover, a genotoxic evaluation was carried out with the Ames test using three strains (TA98, TA100 and TA102) to detect different point mutation mechanisms. The aim of this proposal was demonstrate the safely use of the extracts, the data obtained indicated that the extracts with ethanol and ethyl acetate of the three species tested do not induce genotoxic effects on the Ames test. III 14

15 The subsequently study was to demonstrate the process of cell death induced by the extract with better cytotoxic effect on cancer cells, no cytotoxic in healthy cells and no genotoxic, choosing the ethyl acetate extract of Kalanchoe flammea because it has the lowest inhibition value with a IC 50 value of µg/ml. We first demonstrated one of the characteristics that occur during cell death by apoptosis (translocation of phosphatidylserine to the external face of the plasma membrane), we used Annexin V kit, the results of this objective showed that the extract can induce this process to the concentration of µg /ml in time of 24 h, ruling out a process of cell death by necrosis. Beside the above mentioned results, it was other events which occur during the activation of apoptosis, activation of cysteine proteases known as caspases were evaluated. So we did a Immunodetection of protein derived from cells treated with the ethyl acetate extract K. flammea at IC 50 at 24 h to demonstrate the activation of different caspases capable of induce the two major pathways of apoptosis (extrinsic and intrinsic pathway) and also evaluate the relative expression of proteins which are overexpressed in CaP and contribute to the mechanism resistance to apoptosis (XIAP and PKCε). The results obtained suggested an apoptotic process mediated by activation of intrinsic (mitochondrial pathway), since there was caspase activation involved in this pathway (caspase-9) and probably mediate the activation of effector caspase-7, since there was no activation of caspase-3, and on the other hand, there was no activation in those corresponding to the extrinsic pathway (caspase-8 and -10). It must be stated out that it is still necessary to evaluate more proteins involved in these process, to define the molecular effect exerted by the ethyl acetate extract of Kalanchoe flammea and other types of biochemical and molecular tests to demonstrate its effect both in vitro and in vivo models, in order to propose Kalanchoe flammea as a candidate in the treatment of prostate cancer. 15 IV

16 1. INTRODUCCIÓN Actualmente vivimos una época de transición epidemiológica y de salud pública, caracterizada por el incremento de enfermedades no transmisibles relacionadas de manera muy estrecha con cambios en el genoma, tal como lo es el cáncer. Ésta es una de las enfermedades más prominentes en seres humanos, y en la actualidad hay mucho interés científico y comercial en el continuo descubrimiento de nuevos agentes anticancerígenos provenientes de productos naturales. El potencial de usar estos últimos como agentes contra el cáncer, ha sido reconocido por muchas organizaciones en el mundo, y desde entonces, se ha logrado hacer muchas contribuciones en el descubrimiento de nuevos fármacos para contrarrestar esta enfermedad, como los que actualmente existen (The American Cancer Society Inc., 2002). 1.1 CÁNCER En todo el organismo multicelular adulto debe de existir un equilibrio entre la generación o proliferación y la desaparición o muerte de las células que lo componen, con el fin de mantener la homeostasis. La alteración de este equilibrio conduce a situaciones patológicas como el cáncer, en donde la proliferación se encuentra aumentada (Jordán, 2003). El cáncer se origina de la acumulación de múltiples mutaciones genéticas. Además, de que algunas mutaciones pueden ser heredadas, incrementando el riesgo o susceptibilidad de desarrollar esta enfermedad, sin embargo, tales síndromes son sólo una minoría en los cánceres en seres humanos (Yu et al., 2005). Este tipo de mutaciones se presentan en genes relacionados con el control del ciclo celular. Durante este proceso de transformación de las células normales a células cancerosas ocurren varias alteraciones genéticas dando lugar a una pérdida del control de los mecanismos de replicación y reparación del ADN, así como la segregación del material genético (Kastan et al., 2004). Referido a lo anterior, el cáncer es un desorden hiperproliferativo celular, que involucra una transformación morfológica, desregulación de la apoptosis, proliferación celular incontrolada, invasión, angiogénesis y metástasis (Hanahan et al., 2000). 1.2 CARACTERÍSTICAS DEL CÁNCER El cáncer comprende seis características biológicas que son manifestadas durante el desarrollo de un tumor. Éstas constituyen un principio de organización para razonar la complejidad de esta enfermedad neoplásica. Incluyen una constante señalización proliferativa, evasión de señales supresoras de crecimiento, resistencia a la muerte celular, inmortalidad 1

17 replicativa, inducción de angiogénesis y activación de invasión y metástasis (Hanahan et al., 2011) (Figura 1). Hannahan, 2011 Figura 1. Características del cáncer Detrás de estas características, la inestabilidad genómica es la que genera la diversidad genética que les facilita su adquisición, y la inflamación, la cual fomenta muchas de las demás funciones. El avance en los últimos años ha sumado dos nuevas características en las células cancerosas, la reprogramación de su energía metabólica y la evasión de la destrucción por la inmunidad (Figura 2). Figura 2. Características emergentes del cáncer Hannahan,

18 Aparte de las células cancerosas, los tumores exhiben otra dimensión de complejidad: poseen un amplio reclutamiento de células aparentemente normales, las cuales contribuyen a la adquisión de un microambiente tumoral. Reconocer la generalidad de éstos conceptos afecta cada vez más el desarrollo de nuevos medios para tratar el cáncer humano (Hanahan, 2011) SEÑALIZACIÓN PROLIFERATIVA CONTÍNUA Podría decirse que el rasgo fundamental de las células cancerígenas es su capacidad de sostener una proliferación crónica. Los tejidos normales cuidadosamente controlan la producción y liberación de señales que promueven el crecimiento que instruyen la entrada y progresión a través del crecimiento y ciclo celular, asegurando la homeostasis del número de células y así mantener la arquitectura normal del tejido y su función. Las células cancerosas al desregular estas señales se llegan a controlar su propio destino. La activación de estas señales es lograda en gran parte por factores de crecimiento que se unen a receptores de la superficie celular, típicamente aquellos que contienen un dominio intracelular de tirosin cinasas. Este último emitirá señales a través de una cascada de señalización que regulará la progresión a través del ciclo celular, así como del crecimiento celular (que es, incrementar el tamaño celular); frecuentemente estas señales también influencian otras propiedades biológicas de la célula, tales como la energética de su metabolismo y su sobrevivencia. La biodisponibilidad de los factores de crecimiento es regulada por su reclutamiento en el espacio pericelular y la matriz extracelular, y por la acción de una compleja red de proteasas, sulfatasas y posiblemente de otras enzimas que se liberan y las activan, aparentemente con alta especificidad y comportamiento localizado. Sin embargo, la precisa identidad y recursos de las señales proliferativas que operan dentro de un tejido normal es poco entendido actualmente (Hanahan, 2011). Las células cancerosas pueden obtener su capacidad proliferativa de diferentes maneras: Pueden producir factores de crecimiento para sí mismas, para lo cual pueden responder expresando sus receptores correspondientes, resultando de una estimulación proliferativa autocrina. Por otro lado, las células cancerosas pueden enviar señales para estimular células normales adyacentes, y de esta manera proveerles con factores de crecimiento. Otro punto importante dentro de esta característica son las mutaciones somáticas que activan vías de señalización adicionales (Cheng et al., 2008). 3

19 1.2.2 EVASIÓN DE LOS SUPRESORES DE CRECIMIENTO Además de mantener las señales estimulatorias de crecimiento, las células cancerosas deben de eludir los programas que regulan negativamente la proliferación celular, muchos de estos programas dependen de la acción de genes supresores de tumores. Muchos supresores de tumores que operan de diferentes maneras para limitar el crecimiento celular y la proliferación, se ha descubierto que se encuentran de manera inactiva de varias formas en muchos cánceres. Los dos supresores de tumores típicos son los que codifican las proteínas RB y TP53; éstos operan como nodos de operación central dentro de dos claves complementarias de circuitos regulatorios que gobiernan las decisiones de las células a proliferar o alternativamente a activar la senescencia y los programas apoptóticos. Aunque estos dos supresores de la proliferación TP53 y RB tienen una prominente importancia en regular la proliferación celular, varias líneas de evidencia indican que cada uno opera por distintas vías de una larga red que redunda en funcionalidad (Hanahan et al., 2011) RESISTENCIA A MUERTE CELULAR El concepto de que la muerte celular programada por apoptosis sirve como una barrera natural para el desarrollo del cáncer, ha sido bien establecida por estudios concluyentes sobre su función en las últimas dos décadas. La elucidación de los circuitos de señalización que regulan el programa de apoptosis ha revelado como ésta se desencadena en respuesta a varias tensiones fisiológicas y que las células cancerosas experimentan durante el curso de la tumorgénesis o como un resultado de la terapia anti cáncer. La maquinaria apoptótica está compuesta por componentes reguladores que censan las señales, tanto externas como internas en la célula (Adams et al., 2007). Éstos reguladores a su vez, son divididos en dos grandes vías, una que es censada y procesada extracelularmente y que es inducida por señales de muerte (programa apoptótico extrínseco, que involucra receptores como Fas ligando/fas receptor), y la otra censando e integrando una variedad de señales de origen intracelular (programa apoptótico intrínseco), con lo cual la célula es progresivamente desensamblada y finalmente consumida por células fagocíticas especializadas. Las células tumorales involucran una variedad de estrategias para limitar o evitar la apoptosis. La más comúnmente conocida es la pérdida de la función del supresor de tumores PT53. Aunque también estas células pueden lograr esta finalidad con el incremento de la expresión de proteínas antiapoptóticas reguladoras (Bcl-2, Bcl-X L., o por señales de sobrevivencia (Igf1/2), o por bajo regular factores proapoptóticos, entre otros. La multiplicidad de evadir los mecanismos apoptóticos presumiblemente refleja la diversidad de 4

20 señales de apoptosis que la población de células cancerosas encuentra durante la evolución hacia un estado de malignidad (Hanahan et al., 2011) INMORTALIDAD REPLICATIVA Se ha aceptado ampliamente que las células requieren de un potencial replicativo ilimitado para generar tumores macroscópicos. Esta capacidad se encuentra en marcado contraste al comportamiento de la mayoría de linajes celulares normales en el cuerpo, los cuales son capaces de pasar a través de un limitado número de crecimiento y ciclos celulares. Esta limitación ha sido asociada con dos distintas barreras de la proliferación: La senescencia, una típica e irreversible entrada a un estado viable de no replicación, y a una fase de crisis que involucra la muerte celular. La eventual inmortalización de las variantes celulares que proceden a formar tumores ha sido atribuida a su capacidad para mantener el ADN telomérico a longitudes suficientes para evitar la senescencia o apoptosis, lo cual es logrado comúnmente por sobre regular la expresión de la telomerasa o, menos frecuente, un mecanismo de mantenimiento de los telómeros basado en una vía de recombinación alternativa. Así, el acortamiento de los telómeros ha llegado a ser como un cronómetro que determina el potencial replicativo de las células normales y por lo tanto que debe de ser superado por las células cancerosas (Hanahan et al, 2011) INDUCCIÓN DE ANGIOGÉNESIS Al igual que en los tejidos normales, los tumores necesitan de sustento en nutrientes y oxigeno, así como de la habilidad de desechar residuos metabólicos y bióxido de carbono. El proceso de neovasculatura generada por tumores es denominado angiogénesis, con el cual cumplen estas necesidades. Durante la progresión tumoral un interruptor angiogénico está siempre activo, causando vascularización para generar continuamente nuevos vasos que ayudan a sustentar el crecimiento neoplásico (Hanahan et al., 1996). Hay completa evidencia que indica que este interruptor angiogénico se rige por factores compensatorios que pueden tanto inducir como evitar la angiogénesis (Baeriswyl et al., 2009). Algunos de éstos reguladores angiogénicos son proteínas de señalización que se unen para estimular o inhibir receptores de superficie celular de células endoteliales vasculares. Los factores involucrados tanto para la inducción como inhibición de la angiogénesis son el factor de crecimiento endotelial vascular-a (VEGF-A) y la trombospondina 1 (TSP-1), respectivamente. Anteriormente la angiogénesis era concebida para ser importante solo cuando se formaba rápidamente el tumor macroscópico, pero datos más recientes indican que la angiogénesis 5

21 también contribuye a la fase premaligna microscópica de la progresión neoplásica (Hanahan et al., 2011) ACTIVACIÓN DE LA INVASIÓN Y METÁSTASIS El proceso de invasión y metástasis se ha esquematizado como una secuencia de pasos discretos, frecuentemente denominado como cascada de invasión metástasis (Talmadge et al., 2010). Las células cancerosas típicamente desarrollan alteraciones en su forma, así como en su adhesión a otras células y a la matriz extracelular (MEC). La alteración involucrada más característica es la pérdida de E-caderinas en las células cancerosas, la cual es una molécula clave en la adhesión célula-célula. Mediante la formación uniones adherentes con células epiteliales adyacentes, E-caderinas ayudan a ensamblar en capas el epitelio celular y mantienen el orden de las células dentro de estas capas. El incremento en la expresión de E-caderinas fue establecido como un antagonismo de la invasión y la metástasis, así la reducción de su expresión fue relacionada a potenciar estos fenotipos. La frecuente baja expresión y a veces ocasional inactivación de E-caderinas en cánceres humanos provee de información fundamental para involucrarlo como clave en esta característica (Berx et al., 2009). Un concepto adicional, involucra la facilidad con el que las células cancerosas invaden gracias a la ayuda de células inflamatorias que se reúnen en los límites tumorales, produciendo enzimas que degradan la MEC y otros factores que habilitan el crecimiento invasivo; un ejemplo son los macrófagos que se localizan en la periferia tumoral y que proveen de metaloproteinasas y cistein catepsin proteasas, este proceso se cree es mediado por las células tumorales que secretan IL-6 (Kessenbrock et al., 2010). Esta función puede obviar la necesidad de las células cancerosas para producir quimioatrayentes que reclutan células inflamatorias en vez de producir ellas mismas estas enzimas (Qian et al., 2010). La metástasis puede dividirse en dos fases: La diseminación física de las células cancerosas desde un tumor primario a tejidos distantes y la adaptación de estas células en microambientes de tejidos diferentes que resulta en la colonización exitosa (Talmadge et al., 2010) REPROGRAMACIÓN DE LA ENERGÍA METABÓLICA La frecuente y descontrolada proliferación celular que representa la esencia de una enfermedad neoplásica involucra no solo desregular el control del ciclo celular, sino también ajustar la energía del metabolismo en orden para impulsar el crecimiento y la división celular. Bajo condiciones aeróbicas, el metabolismo de la glucosa en las células normales es primero hacia piruvato por la vía de la glucólisis en el citosol y posteriormente hacia dióxido de carbono, 6

22 bajo condiciones anaeróbicas, la glucólisis es favorecida y relativamente poco piruvato es enviado a las mitocondrias. Actualmente se sabe que una característica anómala de las células cancerosas es que aún en presencia de oxígeno, puede reprogramar su metabolismo de la glucosa, y así producir energía, por limitar su metabolismo energético dentro de la glucólisis, llevando a un estado el cual ha sido denominado glucólisis anaeróbica (Hanahan et al., 2011). Curiosamente, se ha encontrado que algunos tumores tienen dos subpoblaciones de células cancerosas que difieren en sus vías de obtención de energía. Una población de ellas son dependientes de glucosa (efecto Warburg) que secretan lactato, y la otra población preferencialmente importan y utilizan el lactato producido por las células vecinas para así mantener su recurso energético, empleando parte del ciclo del ácido cítrico para hacerlo (Kennedy et al., 2010). Estas dos poblaciones evidentemente funcionan de manera cooperativa: Las células cancerosas hipóxicas dependen de la glucosa como energía y así secretan lactato como residuo, el cual es importado y preferencialmente usado como combustible por sus células vecinas mejor oxigenadas. Aunque este mecanismo simbiótico no ha sido generalizado aún, la cooperación entre secretar lactato y utilizar el lactato por otras células para impulsar el crecimiento tumoral no es una invención de las células tumorales, sino el reflejo de cooptación de un mecanismo fisiológico normal (Kennedy et al., 2010). Además es cada vez más evidente que la oxigenación que va desde normoxia a hipoxia, no es necesariamente un proceso estático en los tumores, y a su vez fluctúa temporal y regionalmente (Hardee et al., 2009); probablemente este es el resultado de la inestabilidad y la caótica desorganización de la neovasculatura en los tumores (Hanahan et al., 2011) EVASIÓN DE LA RESPUESTA INMUNE Hay poca evidencia en el posible rol del sistema inmune en la limitación de la formación de más del 80% de los tumores con etiología no viral. Sin embargo, en los últimos años se ha incrementado la evidencia de que el sistema inmune opera como una barrera importante para la formación y progresión de un tumor, al menos en los cánceres no inducidos por virus (Hanahan et al, 2011). Se sabe que las células cancerosas evaden el sistema inmune por deshabilitar los componentes del sistema inmune que han sido enviados para eliminarlas. Por ejemplo, las células cancerosas pueden paralizar la infiltración de Linfocitos T citotóxicos (CTL) y células Natural Killer (NK cells), mediante la secreción de TGF-β u otros factores inmunosupresivos (Yang et al., 2010). Mecanismos más sutiles operan a través del reclutamiento de células inflamatorias que son activamente inmunosupresores, incluyendo células T regulatorias y células supresoras derivadas 7

23 de mieloide (MDSCs). Ambas pueden suprimir la acción de los linfocitos T citotóxicos (Mougiakakos et al., 2010) MICROAMBIENTE TUMORAL Un ensamble de distintos tipos celulares constituyen la mayoría de tumores sólidos. Tanto el parénquima como el estroma de los tumores contienen distintos tipos y subtipos celulares que colectivamente permiten el crecimiento tumoral y la progresión (Figura 3). Figura 3. Microambiente tumoral Hanahan et al, APOPTOSIS Tal como se mencionó anteriormente, la muerte celular o apoptosis es una función que es parte de los procesos fisiológicos que resultan necesarios para el funcionamiento normal de un organismo. El término apoptosis es de origen griego, su significado evoca a la caída de los arboles en otoño. En condiciones fisiológicas, las células que se encuentran dañadas o que están sujetas a recambio, al igual que las senescentes se eliminan a través de este proceso; o bien, cuando las células están sometidas a estrés por radiación ionizante o por compuestos químicos mutagénicos, etc. (Jordán, 2003). La apoptosis ha sido de esta manera, reconocida y aceptada como un importante modo de muerte celular programada, que involucra la determinada eliminación de células. Sin embargo, es importante destacar que otras formas de muerte celular programada han sido descritas y otras formas de muerte celular pueden ser todavía descubiertas (Elmore, 2007) CARACTERISTICAS MORFOLÓGICAS DE LA APOPTOSIS Las células apoptóticas pueden ser reconocidas por cambios morfológicos estereotípicos: La célula se encoje, muestra deformación y pierde contacto con las células a su alrededor. La 8

24 cromatina se condensa y se margina a la periferia de la membrana nuclear, se generan también unas estructuras a modo de pequeñas evaginaciones esféricas surgidas a partir de la membrana, que se denominan blebs, finalmente la célula es fragmentada en estructuras membranosas compactas y cerradas denominadas cuerpos apoptóticos los cuales contienen el citosol, la cromatina condensada y organelos. Los cuerpos apoptóticos son fagocitados por macrófagos y de esta manera son eliminados del tejido sin causar una respuesta inflamatoria. Estos cambios morfológicos son una consecuencia de las características moleculares y eventos bioquímicos que ocurren dentro de una célula apoptótica, lo más notable es la activación de enzimas proteolíticas las cuales median la ruptura del ADN en fragmentos oligonucleosomales, así como la escisión de múltiples proteínas que usualmente determinan la integridad y forma del citoplasma y organelos (Elmore, 2007) NECROSIS La apoptosis es el contraste de la necrosis, el cual es un modo de muerte celular en el cual las células sufren un mayor daño, resultando en la pérdida de la integridad de la membrana plasmática, hinchamiento y disrupción de las células. Durante la necrosis, el contenido celular es liberado incontroladamente al ambiente celular provocando un daño a las células circundantes, que finaliza en una respuesta inflamatoria en el tejido (Elmore, 2007) (Figura 4). Figura 4. Apoptosis y necrosis Pearson Education, Inc & Nature Reviews,

25 1.3.5 MECANISMOS DE APOPTOSIS Los mecanismos de apoptosis son altamente complejos y sofisticados, que involucran una cascada de eventos moleculares que son dependientes de energía. Hasta la fecha, las investigaciones indican que existen dos principales vías de apoptosis: La vía extrínseca o vía de receptores de muerte y la vía intrínseca o vía mitocondrial (Elmore, 2007). Sin embargo hay evidencia que las dos vías están ligadas y que las moléculas en una vía pueden influenciar a otras (Igney et al., 2002). Hay una vía adicional que involucra citotoxicidad mediada por linfocitos T y otra vía mediada por granzima /perforina. En la vía granzima/ perforina se induce apoptosis, ya sea por granzima B ó granzima A. Las vías extrínsecas, intrínsecas y granzima B convergen en la misma vía de ejecución que finaliza en la fragmentación del ADN, degradación del citoesqueleto y proteínas nucleares y otras características previamente mencionadas (Elmore, 2007). La vía de la granzima B activa una vía independiente de caspasas que finaliza en daño al ADN (Martinvalet et al., 2005) (Figura 5) CARACTERISTICAS BIOQUIMICAS DE LA APOPTOSIS Las células apoptóticas presentan varias modificaciones bioquímicas, tales como proteólisis de proteínas, entrecruzamiento de proteínas, ruptura del ADN y reconocimiento fagocítico, que culmina en los eventos anteriormente descritos (Elmore, 2007) CASPASAS Las caspasas son proteínas claves en la transducción y ejecución de la señal apoptótica inducida por la diversidad de estímulos, son ampliamente expresadas en forma de zimógenos inactivos o pro enzimas, a su vez nombrándoles procaspasas y una vez activadas activan a otras procaspasas, iniciando de ésta manera la cascada de proteasas. Algunas caspasas pueden agregarse o bien auto activarse. Esta cascada proteolítica, en la cual una caspasa activa a otra caspasa, amplifica la vía de señalización apoptótica y así produce la rápida muerte celular (Elmore, 2007). 10

26 Figura 5. Representación esquemática de los eventos apoptóticos Elmore, 2007 El término de Caspasa es derivado de proteasas específicas de aspartato dependiente de cisteína (Cystein- dependent aspartate- specific proteases) su actividad catalítica depende de un residuo crítico de cisteína dentro de un sitio activo pentapéptido altamente conservado, y su acción proteolítica es específica dentro de un residuo de aspartato. Éstas tienen un residuo N terminal donde se encuentra su pro dominio seguido de una subunidad grande y otra pequeña, los cuales son a veces separados por un péptido vinculador. Las procaspasas son activadas por un procesamiento proteolítico entre la subunidad grande y la pequeña, el pro dominio es frecuentemente removido, sin embargo no es necesaria durante la activación. La caspasa activa 11

27 es entonces formada por un heterotetrámero que está formado por dos subunidades pequeñas y dos grandes (Elmore, 2007). Actualmente han sido identificadas diez caspasas humanas y han sido categorizadas como iniciadoras (Caspasa -2, -8, -9, -10), las cuales tienen un pro dominio largo. Las caspasas -8 y -10 poseen un dominio de muerte efector (DED) y un dominio de reclutamiento (CARD) en el caso de las caspasas -9 y -2. Éstas son reclutadas por este pro dominio para luego ser activadas en complejos por la acción de un ligando en los receptores de muerte en la superficie celular (Elmore, 2007) (Figura 6). Las caspasas efectoras (-3, -6, -7) tienen un pro dominio corto y caspasas inflamatorias (- 1, -4, -5) (Cohen, 1997). Sin embargo han sido identificadas otras caspasas (-11, -12, -13, -14) que están involucradas en otros procesos más específicos y en ciertas especies animales (Elmore, 2007). Elmore, 2007 Figura 6. Activación de caspasas mediadas por receptor VIA EXTRÍNSECA Como ya se mencionó, la vía extrínseca de la apoptosis es mediada por la activación de los llamados receptores de muerte, los cuales se encuentran en la superficie de la membrana celular y transmiten señales apoptóticas producida por la unión de un ligando específico. Los receptores de muerte, pertenecen a la familia de los receptores de factor de necrosis tumoral (TNFR), una superfamilia de genes, que incluyen TNRF-1, Fas/CD95 y los receptores TRAIL como 12

28 DR-4 y DR-5 (Ashkenazi, 2002). Todos los receptores miembros de la familia TNFR tienen un subdominio extracelular rico en cisteína que le permite reconocer a su ligando con especificidad, dando como resultado la trimerización y activación del respectivo receptor de muerte (Naismith et al., 1998). La señalización subsecuente es mediada por su fragmento citoplásmico del receptor, el cual contiene una secuencia conservada denominada dominio de muerte (DD). Existen moléculas adaptadoras como FADD y TRADD las cuales poseen sus propios DDs por el cual son reclutados hacia los DDs del receptor activado, formando el complejo denominado DISC. Además de su DD, el adaptador FADD también contiene un dominio efector de muerte (DED), el cual a través de una interacción homotípica secuestra a la procaspasa-8 hacia el complejo DISC (Elmore, 2007) (Figura 6). La concentración local de varias moléculas de procaspasas-8 en el complejo DISC lleva a la activación auto catalítica y posterior liberación de caspasa-8. Ésta última a su vez, procesa caspasas efectoras las cuales subsecuentemente activarán sustratos específicos que finalizarán en la muerte celular. Un tipo diferente de vía extrínseca es aquel que no genera una señalización por caspasas, debido a que ésta puede no ser lo suficientemente fuerte para producir la muerte celular. En este caso, la señal necesita ser amplificada por una vía apoptótica dependiente de la mitocondria, que es proveído por un miembro de la familia Bcl-2 llamado Bid. Este es proteolizado por caspasa 8 y en su forma trunca (tbid) se transloca a la mitocondria donde actúa a la par con Bax y Bak que al igual son miembros de la familia Bcl-2, que finalmente inducen la liberación de una proteína denominada Citocromo C y otros factores proapoptóticos hacia el citosol (Luo et al., 1998) VÍA INTRÍNSECA Esta vía involucra a la procaspasa -9, la cual es activada por eventos proapoptóticos mitocondriales que forman el apoptosoma, el cual es un complejo proteico de señal de muerte dependiente de ATP, que se forma en el citosol debido a la liberación de Citocromo C desde el espacio intermembranal de la membrana mitocondrial (Salvensen et al., 2002). En este caso, es la dimerización de la procaspasa- 9 en este complejo que da como resultado la activación de la caspasa-9 (Denault et al., 2002). Una vez que la caspasa iniciadora es activada, puede activar proteolíticamente a caspasas efectoras como procaspasa -3, -6, -7, las cuales subsecuentemente proteolizan a diferentes sustratos proteicos, incluyendo a las mismas procaspasas, de esta manera amplifican la señal de muerte que finaliza con la ejecución de la muerte celular y sus características bioquímicas usualmente observadas (Earnshaw et al., 1999) (Figura 7). 13

29 Elmore, 2007 Figura 7. Activación de caspasa mediada por la formación del apoptosoma REGULACIÓN DE LA APOPTOSIS POR LA FAMILIA Bcl-2 Las proteínas de la familia Bcl-2 son aquellas proteínas que son definidas por la presencia de una secuencia motivo conservada conocida como dominio de homología Bcl-2 (BH1 a BH4). En los mamíferos, más de 30 proteínas han sido descritas como pertenecientes al grupo de éstas proteínas, las que inducen a la sobrevivencia celular, y otro al grupo de los miembros proapoptóticos. El grupo de proteínas proapoptóticas de la familia Bcl-2 pueden ser divididas en dos grupos: La subfamilia Bax que consta de Bax, Bak y Bok, los cuales poseen los dominios BH1, BH2 y BH3, y subfamilia BH3 (Only BH3 protein) que consta de Bad, Bid, Bik, Blk, BimL, PUMA, NOXA, BMF, HRK (Cory et al., 2002). En las células viables, los miembros de la familia proapoptótica Bcl-2 como Bax, Bak y las proteínas con un único dominio BH3, son antagonizados por los miembros antiapoptóticos tales como Bcl-2. En respuesta a un estímulo apoptótico, las proteínas con un solo dominio BH3, son activadas mediante una sobre regulación (Bax, Noxa, Puma), o bien por relocalización subcelular (Bim, Bmf), por desfosforilación (Bad), o por proteólisis (Bid). Éstas al activarse evitan la inhibición de miembros apoptóticos por los antiapoptóticos. Además, ellos pueden directamente inducir a un cambio conformacional de Bax y Bak, los cuales por consiguiente oligomerizan y se insertan en la membrana mitocondrial donde pueden formar poros por sí mismos o por asociarse con el complejo de poros de la permeabilidad transicional. En consecuencia, factores proapoptóticos son liberados desde la membrana interna mitocondrial hacia el citosol, tales como Citocromo C el 14

30 cual contribuye a la formación del apoptosoma y la subsecuente activación de caspasas (Elmore, 2007). Figura 8. Regulación de la apoptosis por la familia Bcl-2 Elmore, REGULACIÓN DE LA APOPTOSIS POR IAPS Se sabe que los niveles de expresión de las proteínas antiapoptóticas tales como Bcl-2, Bcl-X L, entre otras, son regulados por el factor de transcripción NF-κB, el cual a pesar de ser un regulador de la respuesta inmune innata adaptativa, es descrito comúnmente como un factor de transcripción antiapoptótico, aunque bajo ciertas circunstancias puede contribuir positivamente a la inducción de la apoptosis. A pesar de inducir la expresión de proteínas Bcl-2 antiapoptóticas, NF-κB adicionalmente transactiva otros genes de proteínas antiapoptóticas, como las IAPs (proteínas inhibidoras de apoptosis) (Elmore, 2007). Las IAPs son una familia de proteínas antiapoptóticas las cuales originalmente fueron descritas en los baculovirus de lo cual muchos homólogos conservados han sido encontrados dentro de muchas especies. No obstante, se han identificado 8 IAPs homólogas en humanos NAIP, c-naip, c-iap1, c-iap2, XIAP y survivina. Todos los IAPs contienen un dominio IAP repetido de baculovirus (BIR), que consta de 70 aminoácidos, los cuales son esenciales para las propiedades antiapoptóticas de las IAPs (Takahashi et al., 1998) las cuales son llevadas a cabo por la interacción del domino BIR y las caspasas, lo que le confiere la actividad antiapoptótica. Se ha postulado que XIAP, c-iap1 y c-iap2 inhiben directamente a las caspasas -3, -7, y -9 (Salvesen et al., 2002), en el 15

31 caso de XIAP, es su dominio BIR3 el que directamente se une a la pequeña subunidad de caspasa - 9, y su dominio BIR2 es el que interactúa con el sitio activo de caspasa -3 y -7 (Huang et al., 2001). Además los dominios BIR de c-iap1, c-iap2 y XIAP contienen un dominio RING altamente conservado en su amino C terminal, el cual posee una actividad E3 ubiquitin ligasa. Por medio de este dominio, las IAPs son capaces de catalizar su propia ubiquitinación y de esta forma degradarse por proteasoma (Suzuki et al., 2001). Por otra parte, se sabe que Smac/Diablo el cual se sitúa en el espacio intermembranal de la mitocondria, actúa como un regulador negativo de IAPs, deshabilitando sus capacidades apoptóticas al unirse y así desplazar a la caspasa unida a XIAP para habilitar su activación (Du et al., 2000). 1.4 EPIDEMIOLOGÍA DEL CÁNCER A NIVEL MUNDIAL Y EN MÉXICO El cáncer es una de las enfermedades que lidera las más altas tasas de mortalidad en el mundo, principalmente en países en desarrollo. En ellos se han reportado cerca de 12.7 millones de muertes y conforme ha pasado el tiempo se ha incrementado el número de nuevos casos de cáncer (Moorthi et al., 2011) (Figura 9). El cáncer de mama es el más frecuentemente diagnosticado y la principal causa de muerte entre las mujeres, que representan el 23% del total de casos de cáncer y el 14% de las muertes por cáncer. El cáncer de pulmón es el principal en los hombres, de los cuales el 17% del total de nuevos casos de cáncer y el 23% de las muertes totales por cáncer. Hoy en día el cáncer de mama es también la principal causa de muerte por cáncer entre las mujeres en los países en vías de desarrollo económico, anteriormente durante el la década pasada la causa más común de muerte era el de cáncer de cuello uterino. Aunque las tasas globales de incidencia de cáncer en el mundo son la mitad de las observadas en los países desarrollados en ambos sexos, las tasas de mortalidad por cáncer en general son generalmente similares. Por otro lado, la supervivencia del cáncer tiende a ser menor en países en desarrollo, muy probablemente debido a una combinación de una fase avanzada al momento del diagnóstico y el acceso limitado al tratamiento oportuno y estándar (Jemal et al., 2011). Se prevé que a nivel mundial, la mortalidad por cáncer aumentará un 45% entre 2007 y 2030 (pasará de 7,9 millones a 11,5 millones de defunciones), debido en parte al crecimiento demográfico y al envejecimiento de la población. En las estimaciones se han tenido en cuenta las ligeras reducciones previstas de la mortalidad por algunos tipos de cáncer en países con grandes 16

32 recursos. Se estima que durante el mismo periodo el número de casos nuevos de cáncer aumentará de 11,3 millones en 2007 a 15,5 millones en Figura 9. Tasa de incidencia de cáncer en el mundo GLOBOCAN, 2008 En la mayor parte de los países desarrollados el cáncer es la segunda causa principal de mortalidad después de las enfermedades cardiovasculares, y los datos epidemiológicos muestran el comienzo de esta tendencia en el mundo menos desarrollado, en particular en los países «en transición» y países de ingresos medianos, por ejemplo en América del Sur y Asia. Más de la mitad de los casos de cáncer se registran ya en países en desarrollo (Figura 10 y 11). El cáncer de pulmón mata a un mayor número de gente que cualquier otro tipo de cáncer, y se prevé un aumento de esta tendencia hasta 2030 a menos que se intensifiquen mucho las actividades de control mundial del tabaquismo. Algunos tipos de cáncer, como los de próstata, mama y colon, son más frecuentes en los países desarrollados. Otros tipos de cáncer, como los de hígado, estómago y cuello uterino, son más frecuentes en los países en desarrollo (OMS, 2008). 17

33 Figura 10. Valores de incidencia de cáncer en hombres a nivel mundial GLOBOCAN 2008 GLOBOCAN, 2008 Figura 11. Valores de incidencia de cáncer en mujeres a nivel mundial 18

34 EN EL MUNDO Hombres Mujeres Ambos sexos Población Nuevos casos Riesgo de contraer cáncer antes de los 75 años (%) Número de muertes por cáncer Riesgo de morir por cáncer antes de los 75 años (%) CANCERES MÁS FRECUENTES Pulmón Mama Pulmón Próstata Colon Mama Colon Cérvico uterino Colon Estómago Pulmón Estómago Hígado Estómago Próstata TABLA 1. Resumen de estadísticas de incidencia y mortalidad por cáncer GLOBOCAN 2008 Según la OMS, hasta el 2008 tanto el cáncer de pulmón y el cáncer de próstata lideran la incidencia de canceres en hombres a nivel mundial, y en cuanto a mujeres la mayor incidencia son el cáncer de mama y el cérvico uterino (Figura 12). 19

35 OMS, 2008 Figura 12. Incidencia y mortalidad del cáncer en hombres y mujeres a nivel mundial Al igual que a nivel mundial, entre los cánceres que lideran la incidencia y mortalidad en hombres en México, se encuentra el de próstata y pulmón y en mujeres el cáncer de mama y cérvico uterino (Figura 13). Figura 13. Incidencia y mortalidad del cáncer en hombres y mujeres en México OMS, 2008 En esta investigación nos enfocaremos al tratamiento del cáncer de próstata, razón por la cual a continuación mostraremos la siguiente información. 20

36 1.5 LA PRÓSTATA La próstata es un órgano glandular del aparato genitourinario masculino, localizada enfrente del recto, debajo y a la salida de la vejiga urinaria (Figura 14). La glándula prostática está compuesta por una unidad epitelial o glandular que contiene: Las células secretorias y las secretorias luminales que corresponden al 90%, las células basales que dan origen a las anteriores, corresponden a un 10% y son andrógeno independientes, puesto que no tienen receptores hormonales, células madres que hacen parte del compartimiento basal y tienen una función de reserva en la próstata adulta, y células neuroendocrinas que son parte del sistema APUD (Amine Precursor Uptake Descarboxilase) éstas son menos del 1% y permiten a la próstata la producción de substancias como serotonina, TSH, calcitonina y somatostanina. Las separa una membrana basal, una capa de tejido conectivo y una capa de glicosa-minoglicanos, polisacáridos y glicolípidos que conforman la matriz extracelular. Dicha matriz tiene una función conectora y de comunicación que es fundamental. La segunda unidad es la estromal que contiene los siguientes elementos: 1. El músculo liso, colágeno y los fibroblastos que conforman el estroma 2. Las terminales nerviosas 3. Los vasos sanguíneos 4. Las células del sistema inmune Por cada cinco unidades epiteliales existe una unidad estromal. Esta particular conformación parece tener el objetivo de que el estroma deba comprimir el epitelio glandular en el momento de la eyaculación para secretar su contenido a la luz de la glándula (Uribe, 2005). Figura 14. Anatomía de la próstata 21

37 La próstata es entonces un órgano andrógeno dependiente y las acciones están mediadas por la interacción entre el receptor androgénico (AR) y los andrógenos que viajan por el torrente sanguíneo. El receptor androgénico (AR) es miembro de una superfamilia de factores de transcripción nuclear dependiente de su ligando (andrógenos) que median la acción de hormonas esteroideas y tiroideas. El receptor androgénico está situado en el cromosoma X, en el núcleo de células estromales y epiteliales, en la posición q Consta de tres sectores diferentes: Un sector para activación de respuestas gen-específicas que tiene el dominio de la actividad transcripcional desde el núcleo, un sector de unión específica del ADN y un sector de unión hormono específica a los andrógenos. Las hormonas son mediadores de la influencia estromal sobre el epitelio glandular. La que tiene mayor importancia es la testosterona que difunde por la membrana y actúa sin canales específicos sobre el receptor androgénico a través de su metabolito activo, la dihidrotestosterona (DHT). Esta conversión de testosterona en DHT necesita de 5-alfa reductasa, isoenzima 2 que se produce en el estroma prostático y en menor cantidad en las células basales del epitelio. Ella actúa en forma autocrina en el estroma y en forma paracrina en el epitelio glandular. Un segundo grupo de substancias mediadoras son los estrógenos, cuyo receptor estrogénico alfa esta solo en el estroma y cuyo receptor estrogénico beta, está en las células secretorias luminales del epitelio. Los estrógenos cobran importancia con la edad, puesto que los estrógenos pueden ser aromatizados a andrógenos en una reacción irreversible; esta es parte de la génesis de la Hiperplasia Prostática Benigna (HPB), pero también del Adenocarcinoma de próstata. El tercer grupo de mediadores son los factores de crecimiento (FC), que necesitan de receptores específicos. El efecto mitogénico de los andrógenos en el crecimiento prostático está mediado por la acción de factores de crecimiento, que son péptidos solubles que actúan en forma autocrina (epitelial) que es la vía secundaria en el tejido normal prostático, pero la principal en el cáncer, o paracrina (estromal que es la vía principal en el tejido normal), iniciando una compleja cascada de eventos que incluyen cambios conformacionales, de fosforilación, disociación de proteínas, dimerización o alteración de la trascripción a genes específicos (Uribe, 2005) CÁNCER DE PRÓSTATA El cáncer de próstata es una malignización de lento desarrollo que se caracteriza por un desbalance en los valores de división y muerte celular de las células prostáticas (Krajewska et al., 2003). Este se desarrolla en un 90% en la zona periférica, y otro 10% se desarrolla en la zona transicional y la zona central (Figura 15). Más del 90% del cáncer de próstata son adenocarcinomas que provienen de las células epiteliales secretoras (CEP). Estas contienen receptores de andrógenos en su superficie, por tanto como se mencionó anteriormente son andrógeno dependientes (Burgos et al., 2007). 22

38 Figura 15. Zonas de la próstata donde se desarrolla el cáncer DESARROLLO DEL CÁNCER DE PRÓSTATA El ciclo celular se realiza de una manera especial en las células prostáticas. La mitosis es dependiente de elementos agonistas como los andrógenos (en especial DHT) y de los factores de crecimiento (FC) excepto específicamente el Factor transformante de crecimiento tipo B TGF-B, que es antagonista del crecimiento en condiciones normales. En la próstata, específicamente en el estroma, el complejo receptor androgénico-dihidrotestosterona (AR-DHT) activa la secreción de los factores de crecimiento, que cruzan la membrana basal hacia el compartimiento epitelial que contiene células basales y secretorias luminales, aquí los factores de crecimiento se unen a receptores de membrana plasmática especificas e inician la señal para la proliferación y supervivencia de las células epiteliales secretorias. Una vez que se inicia la señal, los factores de crecimiento actúan como efectores positivos o negativos de los procesos celulares (proliferación, diferenciación y muerte celular del tejido tanto normal y canceroso). La transmisión de señales desde los receptores de membrana específicos crea la síntesis de una cascada de proteínas y la activación o represión de un número de genes blanco. Cuando se desarrolla el cáncer, se utilizan esas proteínas y genes a su favor (Uribe, 2005). Existen cuatro familias de factores básicos de crecimiento que se consideran activadores y que tienen en común un dominio para la unión, dependiente de un tipo de cinasa específica denominada la tirosin cinasa y un factor de crecimiento cuya cinasa específica de unión es la serina - treonina cinasa. Entre éstos se encuentran: 23

39 Factor de crecimiento epidérmico: Éste induce la proliferación de todos los tipos celulares normales. Es el principal factor de crecimiento en la HPB y en tejido normal. En el Cáncer de Próstata (CAP) incrementa las líneas andrógeno sensibles, sugiriendo una vía autocrina para las células del tumor que son epiteliales. Originalmente es autocrino, solo de las células del estroma, que desaparecen cuando existe cáncer. En esta familia se incluye el Factor de crecimiento transformante alfa TGF alfa, no relacionado con TGF-Beta (Uribe, 2005). Factor de crecimiento relacionado con la insulina: Es un sistema de dos proteínas: Tipo I y II. Aumenta la proliferación celular. Se secreta estromal y actúa epitelial, como es la regla con los FC. Es antiapoptótico y mitogénico. A mayor nivel más posibilidad de cáncer (Uribe, 2005). Factor de crecimiento derivado de las plaquetas: Se secreta en muchos tejidos del sistema urinario. Es un fuerte factor mitogénico y proliferativo. Tiene relación directa con la inflamación y es muy importante en la génesis de HPB (Uribe, 2005). Factor de crecimiento relacionado con los fibroblastos: Es una familia de péptidos relacionados con la angiogénesis, la diferenciación y la motilidad presentes en la próstata normal. Incluye otros como el factor de crecimiento endotelial y el osteoblástico. Activa el gen andrógeno dependiente aún sin andrógenos convirtiéndose en una vía de insensibilidad a los mismos. Se eleva mucho también en HPB. En esta familia de factores de crecimiento se incluye el KGF (FGF-7) que es producido en el estroma de la glándula prostática y que es el mayor candidato a ser el eje mediador entre el estroma prostático y el epitelio glandular (Uribe, 2005). Factor de crecimiento transformante tipo β: Los factores de crecimiento pueden ser inhibidores del crecimiento. Su dominio de unión es en la serina-treonina quinasa a diferencia de los anteriores que lo tienen en la tirosin-cinasa. El TGF-β es en realidad una superfamilia con 5 isoformas que incluyen: Activina, Inhibina, proteínas morfogénicas óseas (TGF β1 y TGF β3) y Factor inhibidor del Müller. La TGF-β activa el crecimiento estromal e inhibe o frena el crecimiento epitelial en el tejido normal. En cáncer de próstata funciona de manera inversa, las células pierden la habilidad de ser inhibidas por esta familia de factores. En el CaP, el TGF-β se encarga de promover la angiogénesis y limitar la respuesta inmune contra el tumor. Por sus ventajas para el tumor es sobrexpresado (Uribe, 2005). En condiciones normales la función vital del epitelio glandular prostático es secretar PSA (Prostatic Specific Antigen) que es fundamental para la reproducción de la especie y otras substancias secundarias, pero cuando existe una transformación maligna, se producirá una vía aberrante de producción de los mismos factores de crecimiento, de predominio autocrino y 24

40 siempre a favor del crecimiento del tumor, con tal número de divisiones que tenderá a la inmortalidad. El tumor usará la DHT disponible que sin embargo ya no es indispensable. Para el paso de testosterona a DHT en el tumor intervendrá la 5-α reductasa-isoenzima-1; la 5-α reductasa isoenzima-2 del estroma, el cual permanece de manera sana en la glándula y el tumor será capaz de retroalimentarse en forma autocrina con factores de crecimiento sintetizados para favorecerse y al igual de otras substancias como andrógenos suprarrenales, estrógenos y progesterona, que antes eran de menor importancia que la DHT. Cuando ocurre la transformación a cáncer, los mecanismos paracrinos de acción en el receptor androgénico son reemplazados por un mecanismo autocrino emergente, las células cancerosas son cada vez menos dependientes de los factores celulares estromales (Uribe, 2005) BASES MOLECULARES DEL CÁNCER DE PRÓSTATA El cáncer de próstata es caracterizado por una heterogeneidad biológica y clínica, lo que ha complicado sus estudios moleculares y epidemiológicos, por esta razón es necesario un entendimiento profundo de los cambios moleculares que inician y dirigen el CaP, aunque en la actualidad no se conocen los mecanismos exactos por los cuales se desarrolla esta enfermedad se han identificado alteraciones genéticas específicas y caracterizado su rol dentro del CaP en los varios estadios donde pueden ser importantes (Yu et al., 2005). Receptores de andrógenos: Los receptores de andrógenos (RA) y proteínas relacionadas a las cascadas de señalización que éstos activan son críticos para el desarrollo y diferenciación de un epitelio prostático normal. Sin embargo, esta señalización también conlleva al CaP y su progresión. Los andrógenos usualmente en forma de DHT, se une a su receptor en el citoplasma. El complejo formado por esta unión se transloca al núcleo, donde promueve elementos de respuesta a andrógenos en las regiones promotoras de genes. Aquí el complejo altera los genes de transcripción que directa o indirectamente estimulan la proliferación. La función crítica mitogénica de la señalización de los RA forma la base de una de las terapias para el CaP, sin embargo cuando éste es tratado con antiandrógenos, las células tumorales se convierten en andrógeno independiente, lo que lleva consigo a mutaciones en los RA. Algunas de éstas mutaciones alteran la especificidad del ligando, dando como consecuencia un RA mutante que es activo cuando se une a un Antiandrógeno. Otro factor que coopera con los RA para causar la malignización del CaP es el microambiente tumoral (Yu et al., 2005). 25

41 Oncogenes y Receptores de factores de crecimiento: En la etapa temprana del desarrollo de una malignización, las mutaciones acontecidas en las células usualmente activan proto-oncogenes y conllevan a la transformación maligna. En contraste los genes supresores de tumor codifican proteínas que sirven como reguladores negativos del crecimiento celular y la proliferación (Yu et al., 2005). En cánceres de próstata, la activación de oncogenes y el producto de su expresión ha sido particularmente decepcionante, ya que los estudios realizados no han correlacionado ningún oncogén que pueda ser un marcador para la detección de la maligniciencia prostática o para identificar una ruta en particular que conlleve al desarrollo del CaP o la predicción de alguna manera en un fenotipo predecible (Foster et al., 1999). Aunque la familia de proto-oncogenes RAS ha sido encontrada en muchos tipos de canceres humanos, mutaciones en RAS no son relativamente comunes en CaP y no ofrecen utilidad en el pronóstico de éste. Sin embargo RAS juega un rol importante en la transducción de señales de los receptores de factores de crecimiento (GFRs), lo que sugiere que la vía de señalización realizada por estos receptores está implicada en el desarrollo, crecimiento y metástasis del CaP. Los factores de crecimiento epidérmico (EGFR) actúan como mitógenos para las células epiteliales normales de la próstata; de tal manera que son expresados en altos niveles en el CaP. El epitelio normal y el de CaP expresan EGFR, los cuales activan la vía de señalización de las MAPK cuando esta es activada por factores de crecimiento epidérmico (EGF) o factores de crecimiento transformantes (TGF-α). La activación de a señalización de EGFR está ligada a la proliferación celular, transformación maligna y la progresión (Yu et al., 2005). Genes supresores de tumor: Un segundo grupo de genes reconocidos que son considerados importantes moduladores de un fenotipo maligno son los genes supresores de tumor (TSGs). Aunque las funciones normales de la secuencia de estos genes no son bien definidas, es probable que ellos estén involucrados en promover la diferenciación celular, además de mediar el arresto celular en la proliferación mediante citocinas inhibidoras de crecimiento. Algunos de los TSGs candidatos son el gen de Retinoblastoma (RB) localizado en el cromosoma humano 13q, del cual en algunos estudios se ha confirmado la presencia de mutaciones de este gen en una subpoblación de cánceres de próstata humano, lo que soporta la probabilidad de que la mutación de estos genes responsables de la supresión tumoral puede ser un importante paso en la génesis de al menos algunos cánceres de próstata. La pérdida de la heterocigocidad (LOH) para RB ha sido mostrada en el 60% de pacientes con cáncer de próstata. Otro TSG es el gen p53, que se encuentra mutado en muchos cánceres humanos (Selivanova, 2001), el producto de este gen es una proteína nuclear que regula la entrada y progresión al ciclo celular. En células normales se encuentra en el citoplasma en asociación con el citoesqueleto; en células transformadas esta 26

42 proteína es usualmente localizada en el núcleo. La identificación de niveles altos de esta proteína indica que p53 se encuentra mutado, debido que a que éste en su forma normal tiene una vida media corta. Un tercer gen supresor de tumores es KAI1, que se encuentra localizado en el cromosoma 11p11.2, el cual parece estar activo en algunos canceres de próstata. La proteína de este gen se encuentra reducida en líneas celulares derivadas de cánceres de próstata metastásicos. De la proteína codificada por el gen de KAI1 aun no se ha confirmado su función, su localización membranal y su excesiva glicosilación sugiere que tiene función en la interacción célula célula e interacciones célula con la matriz extracelular, y que son importantes en invasión y metástasis. Además de KAI1, la expresión de genes como MRP-1 y ME491, que son otros dos genes de la misma familia, también ha sido correlacionada con la metástasis (Foster et al., 1999). Otros genes supresores de tumores que se encuentran alterados en CaP son el Glutatión S-Transferasa, el cual cataliza la conjugación de glutatión con componentes electrofílicos, protegiendo al ADN de daño oxidativo y el Homólogo de la fosfatasa y tensin (PTEN) el cual es una fosfatasa que actúa en la tirosina de fosfoproteínas y en los sustratos fosfolípidos de la cinasa de fosfoinositol trifosfato (PI3K), donde la pérdida de la expresión de PTEN activa la vía de señalización de AKT, la cual se encuentra asociada con el incremento de la sobrevivencia celular. En CaP, el gen de PTEN esta mutado y silenciado por hipermetilación, además de que esta pérdida de expresión correlaciona con el estado avanzado y alto grado de maligniciencia en los tumores de CaP (Yu et al., 2005). Índices de proliferación: La evaluación de la proporción de células proliferando dentro de un tumor puede predecir la probable progresión hacia una tumoración. La expresión de la una proteína como Ki67 es necesaria a lo largo de todo el ciclo celular, por consiguiente al disminuir su expresión se inhibe la proliferación celular. Se ha comprobado que existe una significativa correlación entre la expresión de esta proteína y el grado de maligniciencia en todos los tumores de próstata (Foster et al., 1999). Apoptosis: Mucha atención ha sido enfocada al control molecular de la apoptosis y los métodos para alterar el balance hacia potenciar la muerte celular en el tumor con terapia anti-cáncer. Los valores de apoptosis llegan a ser alterados durante la iniciación, progresión y metástasis de los canceres de próstata humano. El tratamiento con ablación androgénica primero produce una reducción en la densidad tumoral, pero es seguido por una proliferación continua de células andrógeno independiente resultado en cáncer, el cual no responde por mucho tiempo a la terapia antiandrógeno. El mecanismo(s) por el cual las células adquieren andrógeno independencia puede 27

43 suceder a través de defectos en la producción autocrina, y/ o en respuesta a citocinas TGF- β1 (Foster et al., 1999). Bcl-2 y productos de genes relacionados: La proteína oncogénica Bcl-2 y su familia de genes relacionados ocupan un rol central en la regulación de la apoptosis. Bcl-2, Bcl-X L, Bcl-w y Mcl-1 son antagonistas de la muerte celular, mientras que Bax, Bak, Bcl-Xs, Bad y Bik son agonistas. Las proporciones de éstos influencian la respuesta al estimulo apoptótico tales como la ablación androgénica, la pérdida del anclaje a proteínas de la matriz extracelular, y fármacos anticancerígenos. Bax se encuentra presente tanto en células basales y luminales expresado en altos niveles en las células secretorias, al igual que Mcl-1, mientras que Bcl-x es igualmente expresado en ambos también. Es reconocido que el radio de expresión de antagonistas y agonistas determina si una célula responde a una señal apoptótica. Este radio puede ser afectado por muchos estímulos diferentes que incluyen proteínas de la matriz extracelular, Raf-1 y p53 en su forma normal. Se ha demostrado que la expresión de Bcl-2 es un marcador de pronóstico independiente en células de CaP, y niveles altos de ésta proteína han sido encontradas en el CaP hormono refractario, dando una explicación a la supervivencia de este tipo de células, de lo cual se ha relacionado a esta proteína como un blanco terapéutico potencial, ya que se ha demostrado que incrementa la resistencia a la muerte celular tanto por quimioterapia y por radioterapia, así como de reducir el anclaje celular a proteínas de la matriz extracelular, el cual puede facilitar la diseminación tumoral, al igual la expresión de Bcl-2 correlaciona con el incremento de la andrógeno independencia, lo que sugiere que la sobreexpresión de esta proteína puede brindar progresión tumoral y resistencia a quimioterapéuticos. También se ha publicado que los andrógenos median la resistencia al tratamiento con Etopósido por el incremento de la expresión de Bcl-2, y de esta manera inhibe la apoptosis mediada por esta droga. La proteína p53 ha mostrado un papel importante en la modulación de la apoptosis, la cual regula la expresión de Bcl-2 y de Bax. Cuando p53 se encuentra normal, media la inducción de apoptosis por irradiación y por tratamiento con drogas citotóxicas. En próstata, la apoptosis inducida por ablación androgénica no parece involucrar a p53, sugiriendo de esta manera que p53 no es esencial para que la respuesta apoptótica acontezca. Otros protooncogenes tales como ras, c-myc y c-jun han mostrado incremento de su expresión en células PC-3 que son resistentes a drogas terapéuticas que inducen apoptosis. Estas investigaciones indican que varios y distintos mecanismos moleculares pueden ser inducidos o suprimidos, para lograr la muerte celular programada en células de CaP. Tales mecanismos pueden estar involucrados en la eliminación de cánceres dependientes de andrógeno por ablación hormonal, prevención de la transición de éstas últimas a ser andrógeno independiente por bloqueo de la 28

44 expresión Bcl-2 y la erradicación de células de cáncer metastásicas independientes de andrógeno con nuevos inductores de apoptosis (Foster et al., 1999). Factores de crecimiento: En CaP, los niveles de ARNm de TGF-β1 están incrementados mientras que los niveles de TGF-β3 se encuentran recíprocamente reducidos. Las células de CaP desarrollan poca sensibilidad a los efectos antiproliferativos/inhibitorios de TGF-β1 y de ésta manera la progresión tumoral continúa. Los niveles de ARNm de TGF-β1 no siempre correlacionan con los correspondientes niveles de su proteína. Las células de CaP pierden susceptibilidad inhibitoria a TGF-β1 y TGF-β2. Los efectos de la sobreproducción de TGF-β1 benefician la malignidad por medio de la supresión de la inmunidad humoral y celular, promoviendo la angiogénesis, estimulando la formación de la matriz estromal, modulando la expresión dependiente de factores de crecimiento por células estromales y así potenciando la motilidad celular y metástasis de las células de CaP (Foster et al., 1999). Mensajeros Intracelulares: La familia de las protein cinasa C (PKC) de al menos 12 distintas serina/treonina cinasas ocupan un papel importante en el control de la proliferación celular, diferenciación y apoptosis. PKC es el mayor mediador intracelular de los efectos de muchos factores de crecimiento, operando por medio de segundos mensajeros a través del sistema fosfatidilinositol. La activación de PKC por ésteres de forbol ha mostrado una inhibición dosis dependiente de la proliferación celular y de la inducción de la apoptosis. PKCs α y δ parece que son cruciales para la diferenciación celular, mientras que PKC β está involucrado en la proliferación y apoptosis. Se ha sugerido que PKC ε actúa como un oncogén e incrementa la proliferación, mientras que PKC Ϛ parece que disminuye mientras los tumores se van haciendo más agresivos. Se ha comprobado que PKC β se encuentra perdido en etapas tempranas de CaP, de igual manera los niveles de PKC ε se encuentran recíprocamente aumentados, de tal manera que se ha propuesto que el desbalance de los niveles de PKC ayuda a explicar el crecimiento maligno del epitelio prostático. Recientemente se ha comprobado que la inhibición total de PKC previene la proliferación de células de CaP in vitro (Foster et al., 1999). Genes implicados en metástasis e invasión: La migración celular es un proceso complejo que involucra un desprendimiento de la matriz extracelular y re-adhesión a la misma, los cuales están mediados por receptores heterodiméricos transmembranales, o integrinas los cuales forman complejos con la matriz extracelular. Las integrinas median la adhesión e inician una cascada de señalización que tiene como resultado la fosforilación de una cinasa de adhesión focal (FAK) lo cual crea un sitio de unión de alta afinidad con proteínas de la familia de las cinasas Src. Al formarse el complejo FAK/Src se regula la fosforilación de múltiples proteínas efectoras, que 29

45 finalizará en la regulación de la adhesión y la migración. Las líneas de CaP que exhiben agresividad, comportamiento invasivo, como lo son PC3 y DU-145, tienen altos niveles de expresión de FAK que tienden a incrementar la tumorigenicidad, migración y habilidad metastásica. Otras proteínas implicadas son la E-caderina, la cual es una glicoproteína transmembranal que regula la adhesión célula-célula por medio de la interacción homotípica con otras E-caderina en otra superficie celular opuesta y β-catenina, la cual ayuda a formar un complejo con la E-caderina para unirse intracelularmente a la actina y de esta manera ayudar a estabilizar el complejo entero junto con el citoesqueleto. La reducción o ausencia de la expresión de E-caderina ha sido asociada con algo grado de malignidad de tumores de CaP al igual que en células de metástasis a hueso de CaP, lo cual sugiere que la pérdida de ésta, se encuentra involucrada en el desarrollo de CaP, quizás promoviendo un fenotipo más invasivo, sin embargo el mecanismo por el cual ésta proteína promueve la progresión del CaP no está esclarecido por completo (Yu et al., 2005). 1.6 FACTORES DE RIESGO Actualmente no se conoce una exacta causa que origine el cáncer de próstata, sin embargo se han determinado ciertos factores que pueden incrementar el riesgo de padecer cáncer de próstata. Sin embargo, tener un factor de riesgo no significa que necesariamente desarrollará cáncer en la próstata. Entre estos factores se encuentran: Edad: Es el factor de riesgo más importante, ya que es inusual que se presente en hombres menores de 45 años, y es muy frecuente en mayores de 65 años, aumentando en paralelo con la edad (Uribe, 2005). Dieta: Algunos estudios sugieren que los individuos que consumen dietas ricas en grasa animal o carnes rojas tienen un mayor riesgo de padecerlo que aquellos que no la consumen. Además algunas dietas ricas en frutas y verduras pueden tener un efecto protector (Campuzano, 2007). Raza: El cáncer de próstata es más frecuente en hombres de raza negra, que en los de raza blanca y es menos frecuente en hombres asiáticos o indígenas (Uribe, 2005) (Tabla 2). 30

46 Uribe, 2005 Tabla 2. Comparación entre las diferentes razas en incidencia y mortalidad de CaP Antecedentes familiares: La hipótesis de Knudson postula que se necesitan 2 eventos (Hits), negativos independientes para inactivar un gen dado. En los CaP hereditarios, un evento ocurrió desde la formación del genoma y sólo se necesita activar un evento más esporádico o adquirido para que se genere el cáncer. En este tipo de cáncer un equivalente a tres familiares directos con CaP equivale a 11 veces el riesgo de desarrollar esta enfermedad (Uribe, 2005). 1.7 SINTOMATOLOGÍA A pesar de que la mayoría de los cánceres de próstata no producen signo o síntoma alguno, cuando éstos aparecen son similares a los que se presentan cuando ocurre un aumento de tamaño de la próstata, como lo son: Dificultad para orinar, micción débil, urgencia frecuente para orinar, especialmente durante la noche, micción dolorosa o con sensación de quemadura y sangre en la orina (Giménez, 2003). 1.8 ESTADÍOS Y DIAGNÓSTICO En el cáncer de próstata se describen los siguientes estadíos: Estadío I: Cáncer restringido únicamente a próstata. También se denomina estadío A1. Estadío II: El cáncer está más avanzado que en el estadío I, pero aún no se ha extendido fuera de la próstata. El cáncer de próstata en este estadío también se denomina estadío A2, B1 o estadío B2. Estadío III: El cáncer se ha extendido más allá de la capa externa de la próstata hasta los tejidos vecinos. Afecta a vesículas seminales. También llamado estadío C. 31

47 Estadío IV: El tumor se ha extendido a ganglios linfáticos cerca o lejos de la próstata o a otras partes del cuerpo como recto, vejiga, pulmón o hueso (metástasis). También se denomina D1 o D2 (Dueñas et al., 2006) GRADO GLEASON El sistema de puntuación histológico de Gleason gradúa a los tumores de 1 a 5 basado en el grado de diferenciación glandular y la arquitectura estructural. El grado 1 representa el aspecto más diferenciado y el grado 5 el más pobremente diferenciado. Una puntuación primaria y una puntuación secundaria son reportadas, según los 2 patrones más comunes encontrados. El cáncer más diferenciado tiene una puntuación de 1+1 o 2; y el más indiferenciado una puntuación de 5+5 o 10. La puntuación combinada (puntuación primaria y secundaria) de 2, 3, o 4 usualmente representa cánceres bien diferenciados; puntuación de 5, 6, o 7 representa cánceres moderadamente diferenciados; y puntuación de 8, 9, o 10 representa cánceres pobremente diferenciados. El pronóstico está directamente relacionado a esta puntuación (Rees et al., 1997). Sistema de graduación: 1. Glándulas únicas redondeadas, en masas redondeadas muy juntas con bordes bien definidos. 2. Glándulas únicas redondeadas, algo separadas, masas redondeadas con bordes menos definidos. 3A. Glándulas únicas de mediano tamaño con forma irregular y espacio irregular con bordes infiltrantes indefinidos. 3B. Muy similar a 3A, pero glándulas pequeñas a muy pequeñas que no forman cadenas o cordones. 3C. Epitelio papilar y cribiforme, rodeado de cilindros y masas; no necrosis. 4A. Glándulas grandes, medianas o pequeñas combinadas en cordones, cadenas, o masas infiltrantes. 4B. Muy similar a 4A, pero principalmente con células grandes claras, algunas veces se asemejan al "hipernefroma." 5A. No diferenciación glandular, cordones, células únicas, o nidos sólidos de tumor con necrosis central. 5B. Adenocarcinoma anaplásico. 32

48 El cáncer de próstata puede detectarse antes de que el hombre tenga síntomas; para ello se utilizan las siguientes pruebas: Examen rectal digital: El médico inserta un dedo con un guante lubricado dentro del recto y palpa la próstata en busca de áreas duras o abultadas. Determinación en sangre de antígeno prostático específico (PSA): Es una sustancia producida por la próstata; una pequeña parte de este PSA pasa a la sangre y es el que se mide para el diagnóstico, pronóstico y seguimiento del cáncer de próstata. Los niveles de PSA en los varones sanos son muy bajos, y se elevan en la enfermedad prostática. Los niveles normales de PSA varían según el laboratorio, aunque los valores normales se sitúan en torno a 4 ng/ml, aunque estos niveles normales también aumentan con la edad del paciente. El nivel del PSA en sangre es la prueba más sensible para detectar precozmente el cáncer de próstata, ya que se eleva en el 65% de los casos. Sin embargo, los niveles de PSA pueden estar elevados en varones que padecen una infección o una inflamación en la próstata o una hiperplasia prostática benigna, sin padecer cáncer de próstata, y hombres con niveles normales de PSA pueden tener cáncer de próstata. La unión de ambas pruebas puede detectar mejor el cáncer de próstata que si sólo se realiza una de ellas. Ecografía prostática transrectal: Se realiza cuando el tacto rectal es positivo o cuando el PSA está elevado. Se inserta en el recto una sonda que tiene el tamaño aproximado de un dedo para examinar la próstata. El tumor de próstata y el tejido prostático normal reflejan ondas de sonido diferentes, por eso la ecografía transrectal también se utiliza para guiar la aguja de biopsia hacia el área exacta de la próstata donde se localiza el tumor y se toma una muestra para su análisis. Por lo tanto, la ecografía transrectal no se recomienda de rutina como prueba de detección precoz del cáncer de próstata, pero sí es el método más utilizado para guiar una biopsia de próstata. Si existen síntomas o los resultados de pruebas de detección precoz sugieren la posibilidad de un cáncer de próstata, es obligatorio realizar otras pruebas para ver si la enfermedad está presente. Biopsia prostática: Es la extracción de células o tejido de áreas sospechosas y de zonas al azar, que posteriormente serán examinadas al microscopio por un médico patólogo. El patólogo examina la muestra en busca de células cancerosas, y si existen les asigna un grado (puntuación Gleason). La puntuación Gleason varía de 1-10 y describe la posibilidad de diseminación del tumor. Cuanto más baja es la puntuación, menor es la probabilidad de que el tumor se disemine. 33

49 Para realizar la biopsia existen dos procedimientos: Biopsia transrectal: Consiste en la inserción de una sonda de ecografía en el recto, después se inserta una aguja a través del recto hasta la próstata para extraer tejido prostático. Biopsia transperineal: Se inserta una aguja fina a través de la piel entre el escroto y el recto hasta la próstata y la extracción de una muestra de tejido prostático. 1.9 TRATAMIENTO Una vez confirmado el diagnóstico, la etapa del cáncer de próstata (el estadío) es el factor más importante para elegir la opción de tratamiento más adecuada y predecir el pronóstico (posibilidad de recuperación) del paciente, (Tabla 3). Es necesario realizar más pruebas diagnósticas para saber la extensión del cáncer (si afecta a parte de la próstata, si involucra a toda la glándula o si se ha extendido a otras partes del organismo). El proceso que se emplea para definir si el cáncer se ha extendido dentro de la próstata o a otras partes del organismo es la clasificación por estadios (o estatificación). Es importante conocer el estadío de la enfermedad para planificar el tratamiento (Dueñas et al., 2006). Por lo tanto, el pronóstico y las opciones de tratamiento dependen de: El estadío del cáncer La edad y el estado general del paciente De la puntuación de Gleason Si el cáncer esta recién diagnosticado o ha recaído Para determinar el estadío en el que se encuentra el cáncer de próstata se realizan distintas técnicas: Gammagrafía ósea: Procedimiento para determinar la presencia de células que se dividen rápidamente en el hueso, como las células cancerosas. Se inyecta una pequeña cantidad de material radiactivo en una vena. El material radiactivo se deposita en los huesos y dichas zonas son detectadas por un escáner. 34

50 Exploración por Tomografía Computarizada: Procedimiento por el cual se toman fotos detalladas del interior del cuerpo, desde ángulos diferentes. Sirve para detectar lesiones en otras zonas del organismo. RMN (Resonancia Magnética Nuclear): Se utiliza un «imán» y una computadora para crear una serie de fotografías de zonas internas del cuerpo. Dueñas et al., 2006 Tabla 3. Tratamientos del Cáncer de Próstata con base al estadío Existen diferentes tipos de tratamiento para los pacientes diagnosticados con cáncer de próstata. Algunos tratamientos son estándar y otros están siendo probados en ensayos clínicos. El tratamiento se debe considerar cuidadosamente, teniendo en cuenta las ventajas e inconvenientes, según la edad, salud general y preferencias personales de cada paciente (Dueñas et al., 2006). Se distinguen cuatro tipos de tratamiento estándar: Observación o conducta expectante: Es la observación intensiva, sin administrar ningún tratamiento hasta que los síntomas se presenten o cambien. Suele emplearse en varones mayores y que presentan otros problemas de salud y con enfermedad tumoral en estadío bajo. El mantener una actitud expectante no significa que el paciente no va a recibir ningún seguimiento o cuidado médico. Se realizarán determinaciones de PSA en sangre y tacto rectal cada 6 meses y probablemente biopsia guiada por ecografía transrectal anualmente. Si aparece cualquier síntoma o el cáncer creciera, debería considerarse un tratamiento activo. Cirugía: Prostatectomía radical. Procedimiento quirúrgico para extirpar la próstata, el tejido circundante y las vesículas seminales. Existen dos tipos de Prostatectomía radical; ß Prostatectomía retropúbica: La extirpación de la próstata se realiza a través de una incisión en la pared abdominal, se pueden extirpar también los ganglios linfáticos cercanos. ß Prostatectomía perineal: Procedimiento quirúrgico en el que la próstata se extirpa a través de una incisión en periné (área entre el ano y el escroto). Resección 35

51 transuretral de la próstata. Se extirpa el tejido prostático mediante el uso de resectoscopio (tubo delgado iluminado, con un instrumento cortante que se introduce a través de la uretra). Se utiliza a veces para paliar síntomas causados por el tumor antes de seguir con otros tratamientos para el cáncer. La resección transuretral también se puede realizar en varones en los que no se puede practicar la Prostatectomía radical por su edad o enfermedades asociadas (Dueñas et al., 2006). Los posibles efectos secundarios de la cirugía son la incontinencia urinaria (incapacidad de contener la orina) y la impotencia (incapacidad de lograr la erección). Se están desarrollando nuevas opciones quirúrgicas para reducir los efectos secundarios de estos tratamientos; así, una opción es la Prostatectomía radical con preservación de la inervación, es decir, respeta los nervios que controlan la erección, conservando así la función sexual. Sin embargo, en pacientes que tienen tumores de gran tamaño o que por su localización se encuentren próximos a los nervios no son aptos para esta intervención (Dueñas et al., 2006). Radioterapia: Es un tratamiento en el que durante varias semanas se expone la zona afectada a pequeñas dosis de ondas de energía, que impiden que las células malignas se desarrollen y multipliquen. Existen dos tipos de radioterapia: Radioterapia externa, en las que la radiación parte desde una máquina situada fuera del cuerpo y es enviada hacia el área donde se encuentra el tumor y la Braquiterapia o radioterapia interna, en las que se utiliza una sustancia radiactiva sellada en agujas, semillas, alambres o catéteres que se sitúan directamente dentro o cerca del tumor, debido a que las semillas se encuentran muy cerca de las células cancerosas, éstas reciben más irradiación que el recto, vejiga, pene y otros tejidos circundantes, que reciben menos radiación. La utilización de una u otra técnica va a depender del estadío en que se encuentre el tumor. El tratamiento con radioterapia es indoloro, pero algunos pacientes sufren de diarrea, síntomas urinarios, así como sequedad de piel del área tratada. Puede causar pérdida del vello en la pelvis, que puede ser temporal o permanente según la cantidad de radiación utilizada. Tanto la radioterapia externa como la interna pueden causar impotencia en algunos hombres. La tasa de impotencia es similar a la de los pacientes que son sometidos a prostatectomía con preservación de la inervación. Ambos tipos de radiación tienen un pequeño riesgo de problemas en vejiga o recto que de aparecer, lo hacen a largo plazo (Dueñas et al., 2006). Hormonoterapia: El objetivo de la terapia hormonal es disminuir los niveles de hormonas masculinas, los andrógenos. El principal andrógeno es la testosterona. Como se mencionó anteriormente, los andrógenos producidos sobre todo en los testículos, promueven el 36

52 crecimiento de células CaP. Cuando los niveles de andrógenos son bajos, el cáncer de próstata se reduce y crece más lentamente. La hormonoterapia en el cáncer de próstata puede incluir: Agonistas de la hormona liberadora de la hormona luteinizante, que impiden que los testículos produzcan testosterona, por ejemplo leuprolide y goserelina. Antiandrógenos para bloquear la acción de los andrógenos, por ejemplo flutamida y biculutamida. Fármacos que impidan la producción de andrógenos por parte de las glándulas suprarrenales, como ketoconazol y aminoglutetimida. Los estrógenos (hormonas que producen los caracteres sexuales femeninos) pueden impedir que los testículos produzcan testosterona. Sin embargo, rara vez se utilizan en el tratamiento del cáncer de próstata debido al riesgo de efectos secundarios. La Orquiectomía es una técnica quirúrgica que extirpa uno o ambos testículos, que son la principal fuente de hormonas masculinas, con el fin de reducir la producción de estas hormonas. La hormonoterapia puede presentar efectos secundarios como rubor, pérdida del apetito sexual, debilidad de los huesos, deterioro de la función sexual. El tratamiento hormonal puede ser utilizado en varias situaciones como tratamiento inicial si el paciente no puede recibir cirugía o radioterapia o bien no puede recibir estos tratamientos porque el cáncer ha sobrepasado los límites de la próstata, después de cirugía o radioterapia si persiste enfermedad o hay recaída, junto con radioterapia como tratamiento inicial (terapia adyuvante) en pacientes con alto riesgo de recurrencia, si se están realizando ensayos de tratamiento hormonal previo a cirugía o radioterapia (tratamiento neoadyuvante) con el objetivo de reducir el cáncer y poder llevar a cabo un tratamiento más efectivo. Quimioterapia: Se administran fármacos que por vía endovenosa o vía oral pasan al torrente sanguíneo y alcanzan todas las partes del cuerpo, haciendo que este tratamiento sea potencialmente eficaz en los tumores que han desarrollado metástasis (se han extendido a órganos distantes de la próstata, fundamentalmente hueso y pulmón). Por ello, el uso de quimioterapia queda reducido a cáncer de próstata extendido fuera de la glándula prostática y si el tratamiento hormonal no es efectivo (hormonorresistencia). Se utilizan fármacos como taxanos, etopósido, vinorelbina y adriamicina. El objetivo de todos ellos es eliminar todas las células cancerosas para reducir el crecimiento tumoral y paliar el dolor. Las respuestas objetivas con quimioterapia están entre un 10-40%. No está indicada en el tratamiento del cáncer de próstata precoz. 37

53 Tratamiento paliativo: Los tratamientos anteriores tienen como objetivo eliminar o destruir las células cancerígenas o detener su crecimiento. Pero otro objetivo muy importante es «la calidad de vida» del paciente, que consiste en eliminar el dolor y otros síntomas que pudieran aparecer; así pueden ser tratados con: Analgésicos, especialmente los opioides, que son muy efectivos para el control del dolor oncológico; los bifosfonatos, que pueden aliviar el dolor causado por metástasis óseas y pueden enlentecer su crecimiento. El más utilizado es el ácido zoledrónico (Zometa ), así como algunos esteroides; del cual estudios sugieren que los esteroides como prednisona y dexametasona pueden aliviar el dolor óseo en varones con cáncer de próstata metastásica y la radioterapia, la cual puede contribuir al tratamiento del dolor óseo aplicándola en la zona donde se localiza la metástasis ósea (Dueñas et al., 2006) MEDICINA TRADICIONAL Los productos naturales pueden mostrar muchos efectos benéficos en las personas, por ello, estos han formado parte importante de nuestra dieta diaria, y desde hace más de años los seres humanos las han empleado para el tratamiento de diversos padecimientos, incluyendo en éstos, enfermedades como el Cáncer. Hoy en día la medicina tradicional es muy popular, ya que muchas personas de alguna u otra manera recurren a ella, ya sea al visitar quiroprácticos, naturistas y/o acupunturistas (Dreikorn, 2005). Actualmente se conoce que hay más de especies de plantas que se han reportado para el tratamiento de esta enfermedad (Graham et al., 2000). Las plantas son una fuente importante de sustancias anticancerígenas que son metabolitos secundarios, los cuales son compuestos orgánicos encontrados en éstas y que no están directamente involucrados en el proceso metabólico primario que le permite su crecimiento y desarrollo, los cuales parecen tener la función de defensa contra predadores y patógenos, y de esta manera proveer de ventajas para su propia reproducción. La mayoría de los metabolitos secundarios pueden clasificarse en grandes grupos: Terpenoides, alcaloides, y compuestos fenólicos (Rodney et al., 2000). El uso de plantas es significativo ya que de los 141 medicamentos contra el cáncer que existen en el mercado, el 67% de éstos provienen de origen natural. Estos medicamentos pueden clasificarse como: Productos de origen natural, productos de origen semisintético derivados de un producto natural, o productos sintéticos que se han empleado como modelo de un producto de origen natural (Newman et al., 2000). 38

54 2. ANTECEDENTES Las investigaciones en el área de la etnofarmacología han ido incrementado notablemente, esto debido a que los productos naturales son candidatos prometedores para el descubrimiento de fármacos, y esto aún continúa jugando un papel importante en el futuro de programas de desarrollo de nuevos compuestos orgánicos (Newman et al., 2000). Un hecho es la diversa cantidad de publicaciones en el área, que desde el 2003 al 2009 ya habían doblado y reflejando el continuo interés en este campo (Gertsch, 2009). Mucha de la información actual ha sido publicada en todo el mundo en revistas especializadas, y algunos ejemplos de ellos se describen a continuación. 2.1 MEDICAMENTOS COMERCIALES OBTENIDOS DE PLANTAS Por décadas, los compuestos naturales han atraído considerable atención como agentes quimiopreventivos y como terapéuticos. Muchos agentes anticancerígenos que se encuentran disponibles en el mercado el día de hoy se originaron de recursos naturales. Uno de los compuestos aislados fue la podofilotoxina, un compuesto obtenido de Podophyllum peltatum en 1944 (Imbert, 1998), el cual originalmente fue usado con un purgante y en el tratamiento de verrugas venéreas. Después, en 1974, se comprobó que actúa como un agente anticancerígeno por su unión irreversible a la tubulina. Los análogos semisintéticos de la podofilina son el Etopósido y el Tenipósido, además de que causan muerte celular por la inhibición de la topoisomerasa II, evitando así el desacople del complejo enzima- ADN arrestando el ciclo celular (Srivastava et al., 2005). Estos análogos son usados en el tratamiento de varios tipos de cánceres (Odwyer et al., 1985). La vincapervinca de Madagascar, Catharanthus roseus, es una planta miembro de la familia de Apocynaceae, la cual es importante por sus propiedades medicinales. Ésta contiene alcaloides dentro de los cuales se incluye a los alcaloides Vincristina y Vinblastina. Por décadas esta planta fue usada como remedio para la diabetes, ya que se creía que potenciaba la producción de insulina en el cuerpo. Tanto Vinblastina como Vincristina son conocidos por prevenir la división celular, inhibiendo la mitosis en este, además de que se unen irreversiblemente a la tubulina, bloqueando así la multiplicación celular y eventualmente causando muerte celular (Noble, 1990). De un extracto del árbol de tejo del Pacífico, Taxus brevifolia, se descubrió que éste poseía propiedades anticancerígenas en 1963, y su principio activo fue aislado en 1967 por 39

55 Monroe Wall y su colaborador Mansukh Wani (Jacoby, 2005). Ellos publicaron sus descubrimientos así como la estructura del principio activo, Paclitaxel (Taxol ), en 1971 (Wani et al., 1971). Susan B. Horowitz, una farmacóloga molecular, estableció el mecanismo de acción del Paclitaxel en En donde menciona que el Paclitaxel se une de manera irreversible a la β- Tubulina, promoviendo de esta manera su estabilidad (Schiff et al., 1979). El equilibrio del microtúbulo y la tubulina es esencial para la multiplicación celular, y así, si ésta es estabilizada causa muerte celular programada (Wilson et al., 1997). Los compuestos anteriores mencionados como Vinblastina, Vincristina y la Podofilotoxina se unen a la tubulina, pero previenen la formación microtubular en vez de promoverla. Paclitaxel fue el primer compuesto en ser descubierto que promovía la formación microtubular. Éste ha sido usado para el tratamiento de varios tipos de cánceres, pero más comúnmente para los cánceres de ovario, mama así como para cáncer de pulmón (Kinghorn et al., 1996). La Campotencina fue aislada del árbol caduco Camptotheca acuminata, el cual también es un agente anticancerígeno que cuenta con un solo mecanismo de acción. Éste es un inhibidor de la topoisomerasa I, y causa muerte celular por daño al ADN. La Campotencina es en sí muy insoluble para ser usada como medicamento, sin embargo existen análogos de esta que son solubles en agua como el Topotecan y el Irinotecan, los cuales han sido desarrollados como medicamentos efectivos (Oberlies et al., 2004). 2.2 OTROS ESTUDIOS REALIZADOS CON PLANTAS CON PROPIEDADES ANTICANCERÍGENAS Hirohisa y cols., en 1994, en Japón, evaluaron los efectos inhibitorios de la proliferación celular de carcinoma hepatocelular (KIM-1) y colangiocarcinoma (KMC-1) de una medicina herbal denominada Sho-saiko, la cual consiste de siete extractos de plantas (Bupleuri radix, Pinelliae tuber, Scutellariae radix, Zizyphi fructus, Ginseng radix, Glycyrrhizae radix y Zingiberis rizoma). El extracto mostró efectos inhibitorios dosis dependiente en ambas líneas con un ED 50 de ± 32.4 μg/ml para KIM-1 y ± 26.5 μg/ml para KMC-1. Al igual que se reportó evidencia de inducción de apoptosis por análisis de cambios morfológicos característicos de esta, además de arresto celular en la fase G 0 /G 1 (Hirohisa et al., 1994). Clément y cols., en 1998, en Singapur, evaluaron las vías de señalización que se producen en el evento de apoptosis con el Resveratrol, un agente quimiopreventivo derivado de las uvas (Vitis sp.), en una linea celular de leucemia promielocítica humana (HL60) y de mama (T47D), así como también los efectos citotóxicos en estas dos líneas y en linfocitos de sangre periférica. Concluyeron que el Resveratrol disminuye la viabilidad de estas líneas desde dosis de 4 a 32 40

56 μg/ml, siendo a la mayor concentración y mayor tiempo (48 h) cuando disminuye el 80% de la viabilidad y no tuvo efectos significativos en linfocitos normales de sangre periférica. Este también activa el proceso de apoptosis dependiente de la vía de señalización de CD95 (Clément et al., 1998). Li y cols., en el 2002, en Estados Unidos, evaluaron el potencial inhibitorio de la Genisteina, concluyeron que ésta es capaz de inhibir el crecimiento celular de células de adenocarcinoma prostático (PC3) a una concentración de 50 µm, sin afectar la viabilidad de células no tumorales de epitelio prostático (CRL-2221), además de que es capaz de inducir apoptosis, inhibir la activación de NF-κB, y la actividad cinasa de Akt (Li et al., 2000). Bektic y cols., en el 2005, hicieron una revisión de todos los estudios realizados a Genistein, un isoflavonoide encontrado en muchas plantas de la familia Leguminosae, en la cual estudios indican que éste flavonoide interfiere con los reguladores de la progresión del ciclo celular, causando arresto en la fase G1 ( 20 μmol/l), al igual que su habilidad de causar inhibición del crecimiento celular, del cual también se deriva la inducción de apoptosis por sobre expresión de Bax y baja regulación de Bcl-2. También se le han encontrado efectos regulatorios en la angiogénesis, invasión y metástasis (Bektic et al., 2005). En el 2006, Yang y cols., en Estados Unidos, evaluaron un triterpeno (Celastrol) aislado de la corteza del árbol Thunder God of vine (Tripterygium wilfordii Hook F.) en líneas de Cáncer de Próstata (LNCaP y PC3) para evaluar sus efectos in vitro e in vivo. Encontraron que este compuesto natural inhibe la actividad de quimiotripsina de proteasoma 20S in vitro (IC 50 = 2.5 µmol/l), in vivo (1.5 mg/kg/d), haciendo referencia a que esta actividad se encuentra asociada a la inducción de apoptosis y actividad antitumoral de este compuesto en ambas condiciones debido a la acumulación de proteínas proapoptóticas IκBα, Bax y p27 (Yang et al., 2006). En el 2008, Aziz y cols., en Estados Unidos, evaluaron el potencial inhibitorio de crecimiento e invasión de una Naftoquinona derivada de la planta medicinal Plumbago zeylanica, en Cáncer de Próstata hormono refractario (DU145). La naftoquinona inhibe la invasión e induce apoptosis (5 y 20 μmol/l) por la regulación de múltiples proteínas blanco de vías de señalización implicadas en la sobrevivencia celular (AKT, PI3K) y la inhibición de la unión de factores transcripcionales (AP-1, NF κb, y Stat3), así como el efecto inhibitorio del crecimiento tumoral en ratones atímicos (2 mg/kg) (Aziz et al., 2008). Chatelain y cols., en el 2008, en Estados Unidos, evaluaron los efectos inhibitorios de los extractos de las semillas de la uva y el arándano en una línea de carcinoma oral de células 41

57 escamosas (CAL27 y SCC25). En este estudio ellos evaluaron el potencial antiproliferativo, ensayos de adhesión celular así como viabilidad celular, de lo cual se comprobó que los extractos de arándano (40 μg/ml) y semillas de uva (70 40 μg/ml) reducen el crecimiento celular y la proliferación entre 30 y 55% en ambas líneas (Chatelain et al., 2008). En Italia, en el 2008, Barillari y cols., estudiaron el potencial citotóxico/apoptótico del extracto etanólico de Raphanus sativus L., en las líneas de Adenocarcinoma colorectal (HT-29, HCT-116 y LoVo) y en linfocitos T normales. Obteniendo efectos citotóxicos (30 y 50 μm por 24 h) en las 3 líneas analizadas, y sin efectos significativos en linfocitos T (30 y 50 μm por 6 días). Y ellos concluyeron que el evento de apoptosis es activado de manera mitocondrial, por efectos de disminución de Bcl-2 y activación de caspasa -9 y PARP, además de cambios en la membrana plasmática por exposición de fosfatidilserina (Barillari et al., 2008). Por otro lado, en México, en el 2010, Sánchez y cols., evaluaron la inducción de efectos citotóxicos y apoptóticos de la Perezona, un compuesto aislado de las raíces de Perezia spp. y la Isoperezona un isómero sintetizado a partir del anterior, en una línea celular de Leucemia (K562), concluyendo que la Perezona (50 µm) muestra mejores efectos citotóxicos que su derivado Isoperezona, además de que ambos muestran efectos característicos de la apoptosis como lo son translocación de fosfatidilserina, cambios en el potencial de membrana, así como la activación de caspasa 3 y el factor inductor de apoptosis (AIF), los datos revelaron activación de apoptosis a través de activación de caspasas y mecanismos independiente de ellas (Sanchez et al., 2010). Huiying Han y cols., en el 2011, evaluaron dos compuestos de origen natural (physalins A y B), los cuales son secoesteroides aislados de Physalisalkekengi var. franchetti en líneas andrógeno-independientes de Próstata (C42B y CWR22Rv1), en la cual encontraron que estos inhiben la proliferación a través de la activación de la apoptosis y bajo regulación de la expresión de receptores de andrógenos. Los resultados obtenidos fueron physalin B (IC 50 = 2-20 µm en C42B y de 3 25 µm en CWR22Rv1) fue más potente que el physalin A (IC 50 = 9 70 µm en C42B y de 14 a 85 µm en CWR22Rv1) a 24, 48 y 72 h respectivamente. Evidenciando que estos compuestos también producen activación de caspasa 3, y PARP proteínas claves en la inducción de apoptosis, así como activación de la vía de MAPKs a través de la fosforilación de proteínas implicadas y finalmente el efecto sobre la producción de PSA y receptores androgénico (RA), los cuales son claves en el proceso de resistencia a la ablación de andrógenos como terapia en CaP, comprobando que estos compuestos bajo regulan la expresión de AR y PSA (Han et al., 2011). 42

58 2.3 COMPUESTOS NATURALES QUE INDUCEN APOPTOSIS EN CÉLULAS CANCEROSAS Como se ha mencionado antes, las células cancerosas poseen múltiples mecanismos para resistir la inducción de muerte celular (apoptosis), la modulación de las vías de señalización apoptótica por los compuestos naturales ha sido demostrado que constituye un evento clave en estas actividades antitumorales. Se sabe que muy poca apoptosis puede promover tumorgénesis aún sin un incremento de la proliferación (Fulda, 2011). Algunos ejemplos de compuestos naturales que se ha establecido inducen apoptosis, así como su modo de acción en células cancerosas son: Ácido betulínico: Este es obtenido de la corteza del abedul, del cual se ha comprobado estimula la apoptosis a través de la mitocondria, ya que causa permeabilización de la membrana mitocondrial y liberación de Citocromo, siendo este un evento dependiente de Bcl-2 o Bcl-X L. También se ha reportado en varios modelos, que induce apoptosis independiente de p53, indicando que este puede evitar algunos tipos de resistencia a medicamentos (Fulda, 2011). Resveratrol: Como se ha mencionado antes, este es un compuesto natural presente en uvas y el vino rojo. Este pertenece al grupo de las fitoalexinas polifenólicas, su modo de acción es antagonizando proteínas anti-apoptóticas, así como sobrerregulación de p21 independiente de p53. p21 causa arresto celular y subsecuentemente una depleción de proteínas antiapoptóticas como Survivina, sensibilizando a las células cancerosas a sufrir apoptosis vía extrínseca. Se le ha atribuído también la habilidad de interferir con las vías de señalización MAPK y (PI-3K)/AKT, que son dos vías de señalización que se encuentran aberrantemente activadas en cánceres humanos (Fulda, 2011). Análogos de Vitamina E: Como por ejemplo el α- tocoferol succinato (α-tos), del cual se ha reportado que induce apoptosis vía mitocondrial en células cancerosas, así como su interacción con ambos sitios ubiquinona del complejo II respiratorio, llevando al desplazamiento de este complejo y subsecuentemente la generación de especies reactivas de oxigeno (ROS) (Fulda, 2011). Mencionado lo anterior, es evidente como a través de los años los compuestos naturales han atraído considerable atención como agentes terapéuticos contra el cáncer, debido principalmente a la modulación de la señalización apoptótica que estos poseen y así como sus propiedades antitumorales, debido a su demanda, se han realizado revisiones de las diversas 43

59 cantidades de plantas que poseen efectos anticancerígenos y que a su vez se tienen en cuenta como potenciales para proveer la base en el desarrollo de nuevos medicamentos. En el año 2000, Graham y colaboradores reportaron alrededor de 350 especies de plantas obtenidas de la base de datos NAPRALERT del Programa para la Colaboración de Investigación de las Ciencias Farmacéuticas en Estados Unidos, de las cuales no se tenían registro en un previo trabajo realizado por Hartwell (Hartwell, 1967) en la cual reportó más de especies de plantas que se conoce han alegado propiedades contra el cáncer, datos que fueron obtenidos de elementos publicados y no publicados. El reporte de Graham incluyó a la familia Crassulaceae dentro de la familia de plantas que poseen propiedades anticancerígenas (Graham et al., 2000). 2.4 FAMILIA Crassulaceae Las crasuláceas son una vasta familia de angiospermas del orden de las Saxifragales y se encuentran distribuídas en muchas partes de mundo. Se desarrollan muy bien en climas cálidos como México, Sudáfrica y el Suroeste de China. Estas plantas almacenan agua en sus hojas suculentas y existen alrededor de 1,400 especies en 33 géneros. 2.5 GÉNERO Kalanchoe Kalanchoe es un género de planta con alrededor de 125 especies de la familia Crassulaceae nativas de África, y se distribuyen en varias partes del mundo (Figura 16), la mayoría son arbustos o herbáceas perennes, la más grande puede alcanzar los 6 m de altura, sin embargo la mayoría no superan 1 m. Tienen hojas carnosas, de color verde medio a oscuro, con cubierta cérea. Los miembros del género se caracterizan por abrir sus flores haciendo crecer nuevas células en la superficie interior de los pétalos para forzarlas a salir y en la parte exterior para cerrarlas. Surgen en tallos florales formando grandes umbelas de colores rosa, rojo, purpúreo, amarillo o blanco, según la especie o la variedad. Florece desde comienzos del invierno hasta la primavera. Su taxonomía es la siguiente: 44

60 Figura 16. Distribución mundial del género Kalanchoe Varias especies de Kalanchoe han sido introducidas en nuestro país y de la misma manera han sido incluidas dentro de la medicina tradicional mexicana para el uso de diversos padecimientos incluyendo el cáncer. Algunas especies de Kalanchoe como K. pinnata (Lam.) Pers. son popularmente usadas en la medicina tradicional de regiones templadas del mundo y particularmente Sudamérica. En Guyana, las hojas son usadas como antiinflamatorio y antiséptico para el tratamiento de la tos, úlceras y llagas. Estudios previos han reportado que esta planta presenta actividades 45

61 antiulcerosas, antileshmanial, hepatoprotector, antidiabético y antinociceptivo (El Abdellaoui et al., 2010). 2.6 ESTUDIOS REALIZADOS AL GÉNERO Kalanchoe En 1988 y 1989, Yamagishi y cols, aislaron de la planta entera de Kalanchoe pinnata 3 bufadienólidos citotóxicos de un extracto acuoso que fueron citotóxicos en un panel de líneas celulares tumorales KB (Cérvix), A-549 (Pulmón), HCT-8 (Colon), P-388 (Leucemia) y L-1210 (Leucemia linfocítica de ratón) y también elucidaron la estructura de estos compuestos mediante el uso de resonancia magnética nuclear en 1D y 2D (Yamagishi et al., 1989). En el 2001 en Japón, Supratman y colaboradores aislaron 5 bufadienólidos de un extracto con MeOH de hojas de Kalanchoe pinnata y Kalanchoe daigremontiana x tubiflora, y se examinó su efecto inhibitorio contra el antígeno temprano del Virus de Epstein Barr (EBV-EA) activado en Células Raji, el cual fue inducido por un promotor tumoral conocido 13-acetato de 12-Otetradecanoilforbol. Todos los compuestos mostraron una actividad inhibitoria, por lo cual fue sugerida como un agente quimiopreventivo (Supratman et al., 2001). En el 2006 en China, Wu y colaboradores, aislaron 3 nuevos bufadienólidos y 5 compuestos ya conocidos en anteriores trabajos, ellos hicieron un extracto con MeOH de la parte aérea de Kalanchoe gracilis y determinaron sus estructuras químicas mediante métodos espectroscópicos. Además fueron probados en un panel de líneas celulares de cáncer, al igual que la inhibición de la replicación del virus del VIH. Los 8 compuestos exhibieron una citotoxicidad significativa a rangos nanomolares y solo uno de los compuestos presentó inhibición del virus del VIH en células H9 de linfocitos T (Wu et al., 2006). En el 2008 en China, Kuo y colaboradores purificaron fracciones de un extracto metanólico de Kalanchoe hybrida, de la cual obtuvieron tres compuestos bufadienólidos con el esqueleto básico de anillo abierto α-pirona, y otros 4 compuestos diferentes, los cuales fueron evaluados en las líneas celulares de MCF-7 (mama), NCI-H460 (pulmón) y SF-268 (Glioblastoma). Estos mostraron actividad citotóxica contra las líneas MCF-7 y NCI-H460 y un efecto menor pronunciado en la línea SF-268 (Kuo et al., 2008). 46

62 3. JUSTIFICACIÓN Actualmente existen alrededor de 12.7 millones de nuevos casos de cáncer y 7.6 millones de muertes por esta causa en 182 países, del cual 56% pertenecen a nuevos casos, así como un 63% de muertes ocurriendo en países menos desarrollados (Moorthi et al., 2011). Según datos estadísticos, el cáncer de próstata ocupa el segundo lugar de incidencia en cánceres que afectan a la población masculina, al igual que su índice de mortalidad, debido a la poca eficiencia y resistencia a los tratamientos que existen en la actualidad, esto es ocasionado principalmente a la habilidad de las células cancerosas de la próstata a activar vías intracelulares de sobrevivencia, mas el acoplamiento de su dinámica intracelular y la redundancia de vías antiapoptóticas, lo que lo convierte en un formidable oponente contra las más poderosas terapias citotóxicas, al igual que a tratamiento con ablación hormonal principalmente. Por otro lado, las plantas forman una parte importante de nuestra dieta, sus constituyentes y valor nutricional han sido intensivamente estudiados por décadas. Se sabe también que aproximadamente más de 3 millones de plantas o hierbas son reconocidas tanto por sus efectos quimiopreventivos como por su potencial quimioterapéutico, por ello ha habido un interés en el desarrollo de esa área, ya que aproximadamente el 80% de los medicamentos comerciales actuales, fueron originados de plantas o tuvieron que ver en el desarrollo de éstos. Otro hecho, es que el 11% de los 252 medicamentos considerados como básicos y esenciales por la OMS son exclusivamente derivados de plantas (Kirsi- Marja et al., 2004). Un ejemplo de ello es el medicamento comercial Paclitaxel, el cual es un anticancerígeno originalmente extraído de la corteza del árbol de tejo del pacífico (Taxus brevifolia). De esta manera, tomando ventaja de los metabolitos producidos por plantas se podrían tener algunas ventajas principalmente económicas y efectivas para combatir el cáncer. El número de plantas que quedan por evaluar es grande, y si pensamos en el tiempo y los recursos necesarios para realizar los estudios requeridos, es imperativo contar con estrategias que nos permitan elegirlas, obtener extractos, y a su vez evaluar la actividad de estos extractos en primera instancia. Si consideramos que el 56% de las plantas empleadas en la medicina tradicional no han sido estudiadas, estas representan al material inicial que pueden conducir al descubrimiento de nuevos compuestos con actividad potencial anticancerígeno, además de que se ha documentado que menos del 20% de todas las especies de plantas han sido evaluadas química y biológicamente (Cordell et al., 2003). 47

63 Descrito lo anterior, y con la creciente aceptación de que la diversidad química de los productos naturales es muy adecuado para proporcionar el andamiaje básico para futuros medicamentos, resulta importante evaluar las propiedades anticancerígenas de extractos provenientes de éstas, siendo esto último una ventaja, ya que se necesita más tiempo de inversión y por lo poco económico que resulta partir de productos aislados y estructuralmente caracterizados, lo que ha llevado a un interés muy alto en evaluar mezclas de componentes obtenidos de extractos. Las plantas del género Kalanchoe, han sido usadas como ornamentales las cuales crecen en África y en Asia, siendo muchas de sus especies usadas medicinalmente en éste ultimo continente, así como también son plantas populares usadas en la medicina tradicional de muchas otras regiones del mundo, como particularmente sucede en América del Sur, donde les han atribuído muchas propiedades medicinales dentro de ellas propiedades anticancerígenas, las cuales se han evaluado y demostrado en ensayos de laboratorio, sin embargo hay muchas de sus especies que se encuentran distribuídas en nuestro país y que aún no han sido evaluadas como tales. Por otro lado, tampoco se han realizado estudios moleculares para evaluar los eventos que conllevan a éste efecto citotóxico, por ello este trabajo pretende evaluar los efectos citotóxicos in vitro de algunas especies que no han sido estudiadas y que se encuentran en nuestro país, así como elucidar a grandes rasgos el mecanismo de acción que conlleva si se presentan los mismos efectos citotóxicos presentados por las otras especies. La búsqueda de nuevos fármacos contra el cáncer es necesaria ya que algunos de los compuestos aislados y que han sido evaluados, muchas veces en la etapa final de aprobación, no son empleados en la clínica, debido principalmente a problemas de solubilidad, toxicidad severa, etc., de lo cual podemos mencionar que la baja toxicidad es parte clave de este proceso, debido a que un nuevo fármaco no solo debe de presentar efectos citotóxicos contra las células cancerosas, si no que presenten los mínimos efectos secundarios en los seres humanos, ya que la mayoría de los medicamentos anticancerígenos que existen actualmente en el mercado, al ser administrados tienden a afectar células sanas, lo que lleva a producir ciertos efectos que deterioran la calidad de vida de las personas que padecen cáncer, algo muy común que sucede en pacientes con cáncer de próstata. Actualmente en el tratamiento de pacientes con CaP las terapias no son efectivas, ya que se genera resistencia a éstas, evolucionando la enfermedad a un estado de cáncer de próstata hormono refractario, lo cual es un punto a favor en la búsqueda de nuevos fármacos que produzcan menor toxicidad y sean efectivos contra el CaP de condición hormono refractario. Cabe enfatizar que una investigación como tal, siempre contribuye en el desarrollo de otras, como lo ha sido, el copiar moléculas base de un principio activo para que se 48

64 le realicen ciertas modificaciones químicas con la finalidad de la obtención de compuestos menos tóxicos y a su vez más potentes, y de esta manera ser candidatos a nuevos fármacos de gran utilidad en la lucha contra el cáncer. 4. HIPÓTESIS Si el género Kalanchoe tiene propiedades antitumorales, entonces las células cancerosas de próstata experimentarán procesos apoptóticos. 5. OBJETIVO GENERAL Evaluar la actividad citotóxica de varios extractos de diferentes especies de Kalanchoe en una línea celular de cáncer de próstata PC OBJETIVOS ESPECÍFICOS 1.-Obtención de la información etnobotánica, colecta e identificación taxonómica de Kalanchoe sp. 2.-Elaboración de extractos de diferentes polaridades de Kalanchoe sp. (Etanol, acetato de etilo y hexano) 3.-Identificación preliminar cualitativa de algunas familias de metabolitos por cromatografía de capa fina presentes en los extractos 4.-Evaluación de la citotoxicidad de los diferentes extractos en una línea celular de cáncer de próstata (PC-3) y en un cultivo primario no canceroso (linfocitos) 5.-Evaluación de la genotoxicidad de los extractos diferentes extractos 6.-Determinar el tipo de muerte celular inducida por los extractos 7.-Evaluar la expresión de proteínas moduladoras y activadoras de la apoptosis 49

65 6. ESTRATEGIA EXPERIMENTAL Para desarrollar la presente investigación, la estrategia experimental usada fue la siguiente: De acuerdo a los datos e información etnobotánica obtenida, las muestras fueron llevadas a su identificación taxonómica en el herbario. Una vez identificadas las especies, se realizaron los diferentes tipos de extractos con 3 disolventes de mayor a menor polaridad. A partir de los extractos se realizaron 4 diferentes estudios: 1.- Estudio fitoquímico preliminar por Cromatografía de capa fina, 2.- Estudios citotóxicos con las técnicas de MTT y CV en una línea celular de CaP andrógeno independiente y en un cultivo primario de linfocitos. 3.- Estudios genotóxicos por la técnica de incorporación de Ames. A partir de estos últimos dos, se seleccionó un extracto, con base en el mejor efecto citotóxico y sin efecto en células sanas, además de no inducir efectos mutagénicos. Finalmente se realizaron estudios moleculares para evaluar el efecto del extracto seleccionado en la inducción de apoptosis con la técnica de Anexina V y además del probable mecanismo de inducción de este proceso por Inmunodetección (Figura 17). Figura 17. Esquema de la estrategia experimental de la investigación 50

66 7. MATERIALES Y MÉTODOS De acuerdo al diagrama de la estrategia experimental, se utilizaron las metodologías y técnicas que a continuación se mencionan. 7.1 Obtención de la información etnobotánica, colecta e identificación taxonómica de Kalanchoe sp Obtención de la información etnobotánica La información etnobotánica se recaudó mediante una serie de entrevistas con personas que tradicionalmente hacen uso de plantas medicinales en diferentes municipios del Estado de Tabasco; localizado en la zona Sureste de México. A todas las personas entrevistadas se les preguntó lo siguiente: Nombre común de la planta Parte utilizada Tiempo de colecta Uso medicinal Preparación Dosis Colecta de la planta La colecta del vegetal se realizó en 3 municipios del Estado de Tabasco (Centro, Macuspana y Nacajuca) y se llevó a cabo entre los meses de mayo y junio del 2010, en los cuales hay mayor cantidad de material biológico según los datos proporcionados. La información del sitio de colecta es el siguiente: El Estado de Tabasco, se localiza al Sureste de México y se extiende por la llanura costera del Golfo de México, con su porción meridional sobre la Sierra del Norte de Chiapas, colinda al Norte con el Golfo de México, al Sur con el Estado de Chiapas, al Este con el Estado de Campeche y la República de Guatemala y al Oeste con el Estado de Veracruz (Figura 18). El clima es cálido-húmedo-seco. La temperatura durante la primavera puede llegar a superar los 40 C con una humedad relativa superior al 90%, durante el invierno el clima es mucho más seco y las temperaturas son mucho más bajas. Existen seis tipos de asociaciones vegetales en Tabasco, la selva tropical lluviosa, la sabana tropical, la selva mediana y baja, las formaciones bajas propias de la playa, la selva de mangles y la vegetación de pantano (Instituto Nacional de Estadística y Geografía). 51

67 Figura 18. Ubicación geográfica del estado de Tabasco Identificación taxonómica de Kalanchoe sp. La identificación taxonómica se llevó a cabo en el Herbario - Izta ubicado en la Facultad de Estudios Superiores Iztacala de la UNAM, con la ayuda de claves taxonómicas. Para mantener los ejemplares como muestra del herbario, estos fueron colocados en una prensa de madera, y posteriormente secados, donde se procuró conservar en buen estado las hojas, tallo, y flores, todos ellos libres de contaminantes. Una vez identificadas, fueron montadas en cartulina blanca y se le asignó un número de registro Elaboración de los extractos de diferentes polaridades de Kalanchoe sp. Para la elaboración de los extractos, el material vegetal (únicamente hojas) fue lavado con agua destilada y seleccionaron las que se encontraron en buen estado, frescas y libres de plaga. Una vez limpias, se cortaron en pedazos pequeños, se pesó 1 Kg y se manceró con cada uno de los diferentes disolventes de diferente polaridad (hexano, acetato de etilo y etanol). 52

68 Este procedimiento fue realizado con cada especie colectada con los tres diferentes disolventes. Las preparaciones se dejaron a temperatura ambiente, por 5 días, protegidas de la luz. Al término de este proceso el disolvente fue separado del material vegetal por medio de filtración y se conservó el disolvente para concentrarlo en un rotavapor (Bϋchi ) con la finalidad de eliminar el disolvente. Éste concentrado fue almacenado en viales a 4 C y protegidos de la luz, hasta su uso. 7.2 Identificación de algunas de las familias de los metabolitos por cromatografía de capa fina Para realizar este objetivo, se utilizó la técnica de cromatografía de capa fina Cromatografía de Capa Fina Ésta técnica es un método de separación relativamente rápido, basado en la distribución selectiva de los componentes a separar, entre dos fases inmiscibles, denominadas: Fase estacionaria y Fase móvil. Con base en lo anterior, la fase estacionaria, normalmente es un material sólido, poroso y adsorbente y la fase móvil un líquido constituído por un disolvente o mezcla de disolventes orgánicos. Estas características del sistema cromatográfico, lo hacen altamente eficiente para separar mezclas de sustancias que tienen gran semejanza en su estructura química y sean afines con las dos fases del sistema. La separación se fundamenta en diferentes principios como la absorción, adsorción, reparto y arrastre mecánico, de tal manera que se establece una competencia entre las dos fases por los componentes a separar, los cuales se fijan selectivamente sobre la fase estacionaria en función de sus diferentes velocidades de migración al ser llevados por la fase móvil a través de la estacionaria (Pecsok & Shields, 1970). Para realizarla, se usó como fase estacionaria, placas de sílica gel, de 1 cm x 5 cm (Merck No. de Cat ), marcando un punto de aplicación en la parte inferior de 0.5 cm y una marca correspondiente al frente del eluyente, en la parte superior, de 0.5 cm y como fase móvil se estandarizó el sistema con varios disolventes de diferentes polaridades, con la finalidad de separar el mayor número posible de componentes de la mezcla. La muestra se preparó con 1 mg de extracto por ml de disolvente correspondiente a su extracción. Esta se aplicó con un capilar en la fase estacionaria y se buscó el sistema adecuado de fase móvil que identificara la mayor cantidad de metabolitos posibles. En cámaras cromatográficas, se colocaron los sistemas de disolventes, los cuales se pusieron en contacto con la placa de sílica y la muestra de extracto, de manera que el sistema alcanzó el punto de aplicación, y este recorrió toda la placa por adsorción. Se retiró la placa del sistema en el momento en que llegó a la marca de frente del eluyente. Para comprobar si el 53

69 sistema separó los componentes se usó una lámpara de UV. Una vez encontrado el sistema, las placas se revelaron con los siguientes reveladores químicos que son usados comúnmente para identificar metabolitos tanto primarios como secundarios mediante reacciones químicas específicas. REVELADOR COMPUESTO IDENTIFICADO UV Sulfato Sérico Yodo Reactivo Citrobórico Vainillina e Hidróxido de Potasio Cromóforos Generales Compuestos insaturados Flavonoides Aminoácidos y aminas 2, 4-Dinitrofenilhidrazina Aldehídos y cetonas Reactivo Dragendorff Hidróxido de Potasio y Etanol Reactivo Borntrager Reactivo Liebermann Buchard Cloruro Férrico, Ferrocianuro de potasio Alcaloides Cumarinas Antracenos libres Triterpenos y esteroles Fenoles y esteroides fenólicos Una vez reveladas las muestras, se calculó la constante Rf, que es el factor de retención y es una manera de expresar la posición de un compuesto sobre una placa como una fracción decimal, mide la retención de un componente. Y por lo tanto es definido como: 54

70 El máximo valor de Rf que se puede alcanzar es de 1, lo ideal es un Rf entre 0.65 y 0.7 (Roberts et al., 1979). 7.3 Evaluación de la citotoxicidad de los extractos en una línea celular de cáncer de próstata (PC3) y en un cultivo primario no canceroso (linfocitos) Cultivo Celular El manejo del cultivo celular de la línea de Cáncer de Próstata PC3, fue realizado en condiciones de esterilidad en campana de flujo laminar, mantenida en medio de cultivo DMEM (Dulbecco s Modified Eagle Medium, Gibco. No. de Cat ), suplementado con 10% de suero fetal bovino (Invitrogen), 0.5% de antibiótico antimicótico (Gibco) a 37 C en incubadora de CO 2 al 5% con 95% de humedad. El cultivo primario de linfocitos fue obtenido de sangre periférica se seres humanos sanos, aislando estas células con el reactivo linfoprep, el cual separa a las células mononucleares; estas células fueron mantenidas en medio RPMI (Roswell Park Memorial Institute, Gibco) con 10% con suero fetal bovino (Hyclone Fetal Bovine Serum, Thermo Scientific, No. de Cat. SH ), 0.5% de antibiótico antimicótico (Gibco) a 37 C en incubadora de CO 2 al 5% con 95% de humedad Almacenamiento y congelamiento La línea celular fue congelada en medio con suero y DMSO (Dimetil Sulfóxido, Sigma, No. de Cat. D5879) al 10% a -70 C en crioviales de congelación. Para descongelar las células, el procedimiento se realizó a baño María a 37 C, y eliminando el DMSO por centrifugación a 1400 rpm por 5 minutos con PBS 1X y medio de cultivo suplementado Evaluación de la Citotoxicidad Esta evaluación citotóxica se realizó por medio de dos técnicas, y son las que se describen a continuación: Técnica de MTT El fundamento de ésta técnica, se basa en la reducción metabólica del Bromuro de 3-(4,5- dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol (MTT) realizada por la enzima mitocondrial succinatodeshidrogenasa, metabolizándola en su forma insoluble de color azul denominado formazán, permitiendo de ésta manera; determinar la funcionalidad mitocondrial de las células tratadas (Mossmann, 1983). El producto de la reacción (sales de formazán) quedan retenidos en las células y puede ser liberados mediante la solubilización con DMSO (Figura 19). De esta forma es 55

71 cuantificada la cantidad de MTT reducido mediante un método colorimétrico, ya que se produce como consecuencia de la reacción un cambio de coloración del amarillo al azul. Es por ello que éste método ha sido muy utilizado para medir supervivencia y proliferación celular frente a la exposición a un compuesto que se evalúa (extracto, fármaco, etc.), de tal manera que la cantidad de células vivas será proporcional a la cantidad de formazán producido (Eisenbrand et al., 2002). Figura 19. Transformación del MTT a formazán. Espectro de absorción del formazán en disolución con el DMSO, presentando un máximo de absorbancia a 570 nm Procedimiento De cultivos confluentes se despegaron las células con tripsina al 0.1% y fueron resuspendidas en medio DMEM suplementado, para determinar el número de células requeridas por pozo, fue necesario contar las células de una alícuota en cámara de Neubauer y hacer los ajustes pertinentes para tener en cada pozo 8 X10 3 células de la linea PC3 y 1 X10 4 en el caso de linfocitos. Después de sembrar en las placas, esta se dejó por 24 h a 37 C y 5% de CO 2 para permitir su adherencia. Por otro lado, cada extracto fue disuelto en DMSO a una concentración de 0.1 %, (no tóxica para la línea celular PC3) de tal manera que al añadir 100 μl deberá contener las concentraciones desde 200 µg/ml hasta µg/ml en cada uno de los pozos. 56

72 Como control negativo se utilizó el DMSO (0.1 %) y como controles positivos el diterpeno Taxol (0.6 µg/ml) (Paclitaxel de Taxus brevifolia, Sigma, No. de Cat. T7402) y la quinona sesquiterpénica Perezona (24.8 µg/ml) (Perezia spp). Una vez agregado a cada una de los pozos el respectivo tratamiento, cada una de las placas de 96 pozos fue incubada a 37 C en atmósfera de 5% de CO 2 durante 24 horas. Al término del tratamiento, este fue retirado y se lavó con PBS 1X (Phosphate buffered saline) dos veces para eliminar cualquier residuo y se agregó 100 μl de MTT (1X = 5 mg/ml disuelto en medio sin suero) por pozo y se incubó por 4 h a 37 C para permitir la metabolización y formación de cristales de formazán en obscuridad. Al término de este tiempo se eliminó el sobrenadante de cada pozo y se agregó 100 μl de DMSO para permitir la solubilización del formazán haciendo movimientos suaves a la placa. Finalmente, la placa fue leída en un espectrofotómetro (TECAN GENios) a una longitud de onda de 570 nm Técnica de Cristal Violeta (CV) Ésta técnica es una prueba muy útil para obtener información cuantitativa acerca de la densidad relativa de células. El método se basa en la tinción de las células con una solución de cristal violeta 0.1% y el colorante fijado a las células es solubilizado, lo cual es proporcional a la masa celular total al medir el solubilizado espectrofotométricamente a 595 nm (Kueng et al., 1989) Procedimiento Al igual que en la técnica de MTT, las células cancerosas fueron sembradas en placas de 96 pozos y al igual que los linfocitos, posteriormente se incubaron por 24 h para permitir su adherencia. Se usaron las mismas concentraciones de 200 µg/ml a µg/ml y se dejó incubar por 24 h. Al término del tratamiento se retiró el medio y se les agregó 100 μl de formaldehído al 1.1% a cada uno de los pozos, las placas se dejaron reposar por 10 minutos, y transcurrido el tiempo se retiró la solución y se le agregó 50 μl de Cristal Violeta (0.1%), se dejó reposar por 10 minutos y al término de este tiempo se retiró el CV y se lavó con agua corriente hasta eliminar el exceso de colorante y después se dejo secar completamente la placa a temperatura ambiente, posterior a esto se solubilizó el CV de cada uno de los pozos con 100 μl de ácido acético (10%). Finalmente la placa fue leída en un espectrofotómetro (TECAN GENios) a una longitud de onda de 595 nm. 57

73 7.3.4 Análisis de resultados Las pruebas fueron realizadas cada una por triplicado y con tres estudios independientes. Con los valores de las lecturas del espectrofotómetro se calculó el porcentaje viabilidad celular para las dos técnicas de la siguiente manera: A partir de los datos calculados del porcentaje de viabilidad, se calculó el IC 50 (Concentración Inhibitoria a la cual el extracto redujo la viabilidad celular en un 50% de la población) (Denizot et al., 1986). 7.5 Evaluación de la genotoxicidad de los extractos Prueba de Ames El principio de la prueba se basa en el uso de cepas de Salmonella typhimurium modificadas en el operón de histidina y que se encuentran diseñadas de tal manera que son capaces de detectar sustancias que causan mutaciones por diferentes mecanismos, las cepas utilizadas en esta prueba fueron las siguientes: TA98 que detecta mutaciones por corrimientos en el marco de lectura (frameshift); TA100, que detecta mutaciones por sustitución de pares de bases, y la TA102 que detecta mutaciones provocadas por daño oxidativo. Para la detección de substancias promutagénicas, se incluye el ensayo de la fracción microsomal de hígado de rata, un sistema de activación metabólica, que permite la evaluación de metabolitos de la muestra problema (extractos con diferentes disolventes). Diferentes cepas de S. typhimurium auxotróficas a histidina son expuestas a una muestra con y sin activación metabólica y plaqueadas en agar con un mínimo de histidina/biotina. Dada la composición del medio de cultivo, se forman colonias con las células prototróficas a histidina, procedentes de mutaciones espontaneas u originadas de mutaciones provocadas por la muestra problema. Después de 48 h de incubación a 37 C, las colonias revertantes son contadas (Ames et al., 1975) Técnica de Incorporación (Procedimiento) Para la realización de ésta técnica, se utilizaron 3 cepas de Salmonella typhimurium, la 58

74 TA98, TA100, Y TA102, los extractos fueron disueltos en DMSO al 0.1% y evaluados a concentraciones de 50 a 200 µg por placa de extracto. Se usó como control negativo el DMSO al 0.1%, y como controles positivos diferentes mutagenos que han sido establecidos para cada una de las cepas: 2-AA, mitomicina C, Acido picrolónico y Metil-N-Nitrosoguanidina (MNNG). Todo el material, reactivos y medios, fueron preparados en condiciones de esterilidad, y por otro lado, la preparación de la fracción S9, proveniente de un homogenado del hígado de rata inducido con Aroclor 1254 también se realizó en condiciones de esterilidad. El medio Vogel Bonner se preparó y se virtió en placas de petri, y una vez solidificado está listo para su uso, el agar suave (10 ml) fue mantenido a 35 C en un termoblock para evitar su solidificación; la fracción S9 fue esterilizada con un filtro de 0.45 μm (Millipore) y se mantuvo a 4 C hasta su uso. A cada caja de petri se le agregó el contenido del tubo de ensayo con el agar suave con 100 μl de la cepa, 10 μl de cada uno los extractos disueltos a la concentraciones mencionadas y 500 μl de la fracción S9, en el orden indicado, homogenizando la mezcla cuidadosamente, enseguida se vertió la mezcla en la caja de petri procurando extenderla mezcla por toda la caja. Se esperó su solidificación y se incubó a 37 C por 48 h. Al término de la incubación se contaron las revertantes a Histidina Análisis de los datos Los resultados se expresan gráficamente a través de una curva dosis respuesta, colocando en la abscisa las concentraciones de la muestra evaluada y en la ordenada el número de revertantes inducidas en cada dosis. Si algunas de las placas con las diferentes concentraciones de los extractos doblan el número de colonias de las revertantes espontáneas basales de la cepa (placa control) el compuesto es considerado mutágeno (Maron et al., 1983). 7.6 Selección del extracto De las tres especies de Kalanchoe, se seleccionó el extracto que mejor efecto dosis respuesta mostrara en la línea celular PC3, y el que tuvo menor efecto citotóxico en las células sanas. Otro criterio de selección fue aquel extracto que resultara negativo a la prueba de mutagenicidad por la técnica de incorporación descrita por Ames. 7.7 Determinación de los efectos apoptóticos del extracto Proteína Anexina V FITC Esta técnica utiliza como ventaja uno de los cambios físicos que suceden durante el proceso de apoptosis, como es la pérdida de la asimetría de la membrana por la translocación del 59

75 fosfolípido fosfatidilserina (FS) desde la cara interna hacia la cara externa de la membrana celular. Una vez expuesta al ambiente extracelular, hay sitios de unión que se encuentran disponibles y pueden ser usados por la proteína de alta afinidad Anexina V, la cual es una proteína de 35 a 36 KDa, y es dependiente de Ca 2+. La translocación de FS precede a otros procesos apoptóticos tales como la pérdida de la integridad de la membrana plasmática, entre otros. De ésta manera, la Anexina V puede ser conjugada con Biotina o con fluorocromos tales como FITC, entre otros; y así pudiendo ser usada para la fácil identificación de células en estadíos tempranos de apoptosis, mediante el uso de un citómetro de flujo. Debido a que la translocación de la FS también ocurre durante la necrosis, la Anexina V no es un marcador absoluto de apoptosis, por lo cual, frecuentemente es usado en conjunción con colorantes como la 7-amino-actinomicina (7-AAD) o Ioduro de Propidio (IP), los cuales se unen a los ácidos nucleicos, pero que sólo pueden penetrar la membrana plasmática cuando no está integra, como cuando ocurre en etapas posteriores a la apoptosis o durante la necrosis Procedimiento Se utilizó el Kit de Anexina (Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit Biovision, No. de Cat. K ) y el procedimiento se realizó de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Se sembraron las células PC-3 en medio DMEM suplementado con 10% de SFB, al obtener la suficiente confluencia, se sembraron en placas de 6 pozos a una densidad de 1 X 10 5 células, se dejó 24 h para permitir la adherencia de las células, posterior a esto se agregó el tratamientos del extracto de acetato de etilo de Kalanchoe flammea al IC 50 : µg/ml a diferentes tiempos 3, 6, 12 y 24 horas, al igual que un control negativo con DMSO (0.1%) y un control positivo con Taxol (4.26 μg/ml), éstos en un tiempo de 24 h. Al término de los tratamiento, las células fueron colectadas en tubos de citometría y las que quedaron adheridas fueron tripsinizadas y colectadas en el tubo correspondiente. Se centrifugó a 1400 rpm por 5 minutos y se desecho el sobrenadante. Se resuspendieron las células en 500 μl de amortiguador de unión (1X), se le agregó 5 μl de Anexina V-FITC y 5 μl de Ioduro de Propidio (50 μg/ml) y se incubaron las muestras por 5 minutos en obscuridad Análisis en el citómetro de flujo Las muestras fueron analizadas en un citómetro de flujo Beckton Coulter a las siguientes condiciones y parámetros (Ex= 488 nm; Em = 530 nm), usando un detector de señal FITC (que usualmente es denominado FL1) e Ioduro de Propidio con la señal de detección de Ficoeritrocina (que es usualmente FL2). De acuerdo al gráfico representado en la Figura 19, el marcaje con Ioduro de Propidio permite la diferenciación de las células viables, en donde el cuadrante 3 es un 60

76 indicativo de Anexina V -/IP-, el cuadrante 4 a las células apoptóticas tempranas e indica un Anexina V+/IP-, las células apoptóticas tardías en el cuadrante 2 y corresponde a Anexina V+/IP+ y el cuadrante 1 que corresponde a muerte celular por necrosis, donde Anexina V-/IP+. Figura 20. Representación gráfica de un cuadrante con datos de una de las características de la apoptosis obtenido por citometría de flujo 7.8 Expresión de marcadores de muerte celular por Western Blot Para definir como ocurre la activación del proceso de apoptosis en la línea celular de PC3 mediada por el extracto de acetato de etilo de Kalanchoe flammea, se determinaron los niveles de expresión de algunas proteínas claves implicadas en los diferentes procesos de apoptosis explicados en la introducción, a diferentes tiempos con el extracto. Las proteínas detectadas fueron: Caspasas iniciadoras: Caspasa-8, caspasa-9, caspasa-10 Caspasa efectora: caspasa-3. Proteína inhibidora de apoptosis: XIAP Proteínas cinasa: PKCε 61

77 Se realizó el seguimiento de la expresión de estas proteínas a los tiempos de 3, 6, 12 y 24 h por la técnica de Western Blot con la dosis del extracto de acetato de etilo de Kalanchoe flammea a la concentración del IC 50 : µg/ml. Para ello, primero se sembraron las células a una densidad de 1 X 10 6 en placas de petri (100x20 mm) y después de 24 h, se colocó el tratamiento a los diferentes tiempos establecidos y transcurrido este tiempo se procedió a la obtención de extractos proteicos totales con un amortiguador de lisis RIPA (Sigma, No. de Cat. R0278) (Tris-HCl 50Mm ph 7.4, NP40: 1%, Na deoxicolato: 0.25%), al cual se le incorporó un cocktail de inhibidores de proteasas (Complete Cocktail inhibitor EDTA Free. Roche, No. de Cat ). Al término del tratamiento, se lavaron las células dos veces con PBS 1X frío (4 C), se les retiró y se agregó 200 μl del amortiguador de lisis con el inhibidor y se dejó en hielo por 5 minutos. Al término de incubación, las células fueron despegadas por scrapping tratando de obtener todo el lisado celular. Se colectaron en tubos eppendorf y se centrifugaron a rpm por 15 minutos en una microcentrífuga refrigerada a 4 C. Se recuperó el sobrenadante al cual se le agregó un amortiguador de Laemmli 2X (Sigma, No. de Cat. S3401-1VL) a una proporción 1: Determinación de la concentración de proteínas Se realizó por el método de Bradford, mediante la comparación de una curva estándar con Albúmina Sérica Bovina (BSA) 1 μg/ml, H 2 O, 800 μl y reactivo de Bradford 200 μl. La BSA fue utilizada en 0, 2, 4, 8 y 16 μg, al igual que las muestras de las proteínas y se leyó a una longitud de onda de 595 nm en un espectrofotómetro. Después se determinó la concentración proteica interpolando el valor de las muestras en la curva estándar de BSA Análisis de la expresión de las proteínas A partir de los extractos proteicos obtenidos en el procedimiento anterior, se procedió al análisis de la expresión de las proteínas Preparación de las muestras Antes de colocar cada una de las muestras en el gel, éstas fueron llevadas a 100 C por 5 minutos en baño María Preparación del gel Las proteínas fueron separadas por el método SDS-PAGE (SDS-polyacrylamide gel electrophoresis), el porcentaje del gel separador usado fue de 15 % y el gel concentrador al 4%. 62

78 Para que el gel quedara al 15% se usaron las siguientes cantidades de reactivos: 2.7 ml de H 2 O bidestilada, 2.5 ml de Tris 1.5 M ph 6.8, 100 μl de SDS 10%, 4.15 ml de Acrilamida/Bis acrilamida al 30%, 50 μl de PSA (Amonium persulfate, BioRad, No. de Cat ) 10%, 5 μl de TEMED (BioRad, No. de Cat ). Para un gel al 4% se utilizaron las siguientes cantidades de reactivos: 3 ml de H 2 O dd, 630 μl de Tris 0.5 M ph 6.8, 50 μl de SDS 10%, 830 μl de Acrilamida/Bis acrilamida al 30%, 50 μl de PSA (Amonium persulfate) 10%, 5 μl de TEMED. Para evitar deformaciones en la polimerización del gel separador se le añadió un frente de 0.5 ml de etanol. Al polimerizar se retira el etanol y se añade el gel concentrador. Los geles se polimerizaron en el sistema de electroforesis MiniPROTEAN 3 (Bio-Rad) Electroforesis Se cargaron 30 μg de proteína en cada carril, y en el primer carril se colocó un marcador de peso molecular de amplio espectro KDa (Dual Color, Bio-Rad No. de Cat. 2S-002) y se corrió la electroforesis a 100 V durante 1:30 h. El amortiguador de corrida constó de: Tris 1X M, Glicina M, SDS 1% y H 2 O bidestilada Electrotransferencia Una vez completada la electroforesis, las proteínas fueron transferidas a una membrana de nitrocelulosa (Trans-Blot Transfer Medium Pure Nitrocelullose 0.2 μm, Bio-Rad). Esta fue cortada en medidas de 6 x 8.5 cm e hidratada en el amortiguador de transferencia: (Tris Glicina 10X, 20% de metanol y H 2 O bidestilada), junto con papel filtro y esponjas de 0.75 cm de grosor. Se prosiguió a preparar el sándwich típico de la transferencia con el consiguiente orden del ánodo hacia el cátodo: En primer lugar la esponja, luego el papel filtro, el gel, la membrana de nitrocelulosa, luego de nuevo el papel filtro de nuevo y finalmente la esponja. La transferencia húmeda fue llevada a cabo con el sistema Mini-Trans Blot Cell System (Bio-Rad) durante 1:30 h a 300 ma a 4 C. Al termino de la transferencia, se colocó la membrana en rojo ponceau (Sigma, Aldrich) para verificar la eficiencia de la transferencia, dejándose algunos segundos, y posteriormente se lavó la membrana con H 2 O bidestilada hasta eliminar por completo el colorante Bloqueo e incubación con anticuerpos A continuación la membrana fue bloqueada durante 2 h en solución bloqueadora (PBS Tween 0.05% con 5% de leche libre de grasa). Al término de la incubación, se retiró esta solución por completo y se hicieron 3 lavados con PBS Tween 0.05% de 10 minutos cada uno a 63

79 temperatura ambiente. Al final de los lavados se realizó la incubación con el primer anticuerpo a 4 C durante toda la noche. Las diluciones de los anticuerpos primarios fueron los siguientes: Anticuerpo No. Catalogo de Sta. Cruz Dilución Actina policlonal SC :200 XIAP monoclonal SC :500 Caspasa-9 monoclonal SC :200 Caspasa-8 policlonal SC :200 Caspasa-10 monoclonal SC :200 Caspasa 3- policlonal SC :200 PKCε monoclonal SC :10 Al término de la incubación se retiró el Anticuerpo primario y se lavó 3 veces con PBS Tween 0.05% por 10 minutos cada uno a temperatura ambiente. Y se incubó con el anticuerpo secundario en las siguientes diluciones: Anticuerpo Anticuerpo Secundario Dilución Actina policlonal Ratón anti-cabra HRP 1:3000 XIAP monoclonal Cabra anti-ratón HRP 1:2000 Caspasa-9 monoclonal Cabra anti-ratón HRP 1:2000 Caspasa-8 policlonal Cabra anti-ratón HRP 1:3000 Caspasa-10 monoclonal Ratón anti-cabra HRP 1:3000 Caspasa-3 policlonal Cabra anti- conejo 1:3000 PKCε monoclonal Cabra anti-ratón HRP 1:2000 Esto se realizó durante 2 h a temperatura ambiente. Posterior a esto se realizaron de nuevo 3 lavados con PBS-Tween 0.05% cada uno por 10 minutos a temperatura ambiente. Se utilizó actina como un control de referencia por ser una proteína constitutiva en todas las células Revelado Todas las membranas fueron reveladas por quimioluminiscencia, siguiendo el método de Thorpe y Kricka, 1986, utilizando el Kit de Luminol (Termo Scientific, No. de Cat ), en 64

80 presencia del peróxido de hidrógeno. La peroxidasa cataliza la acción de diacil-hidrazidas cíclicas, tales como el luminol. Durante la reacción de oxidación, el luminol pasa por un estado excitado (intermedio de la reacción) el cual pasa a un estado estable emitiendo energía de forma lumínica. Esta luz puede ser potenciada por activadores tales como compuestos fenólicos. Mediante este método es posible detectar proteínas marcadas de forma directa o indirecta con HRP. Una vez realizado el último lavado, se colocó la membrana en una cubierta plástica transparente, donde se le agregó la solución A (luminol y potenciador) y la solución B (Peróxido de Hidrógeno) en una relación 1:1, procurando cubrir la membrana en su totalidad y posterior a esto, se colocó en un casete de revelado y encima de ésta se le puso una placa radiográfica (KODAK BIOMAX MS FILM) del mismo tamaño de la membrana, y se cerró el casete para detectar la quimioluminiscencia por tiempos desde 30 segundos a 1 minuto. 65

81 8. RESULTADOS 8.1 Obtención de la Información etnobotánica, colecta e identificación taxonómica Identificación taxonómica En la Figura 21, se muestra la ficha taxonómica de Kalanchoe pinnata con No. de registro 42568, en la Figura 22, se muestra la ficha taxonómica de Kalanchoe gastonis-bonnieri con No. de registro y la Figura 23 correspondiente a Kalanchoe flammea con No. de registro Figura 21. Kalanchoe pinnata 66

82 Figura 22. Kalanchoe gastonis-bonnieri Figura 23. Kalanchoe flammea 67

83 8.1.2 Información etnobotánica Los datos etnobotánicos obtenidos de cada una de las especies de Kalanchoe colectadas en el Estado de Tabasco se muestran en la Tabla 4. Nombre científico Kalanchoe pinnata Kalanchoe gastonis-bonnieri Kalanchoe flammea Nombre común Pericón Mala madre Belladona Parte utilizada Hojas Hojas Hojas Preparación Cocción y como cataplasma Cocción Cocción Dosis 1 hoja por L agua 2 Hojas por L Dependiendo del tamaño de la hoja Uso medicinal Cáncer, inflamación e infecciones Cáncer, infecciones urinarias Cáncer, inflamación, gripe Tabla 4. Información etnobotánica de plantas usadas contra el cáncer en el Estado de Tabasco Colecta La colecta fue realizada en distintos municipios del Estado de Tabasco, K. pinnata fue colectada en el municipio de Macuspana, K. gastonis-bonnieri se realizó en el municipio de Nacajuca y K. flammea se realizó en el municipio del Centro (Figura 24). 68

84 Figura 24. Colecta de Kalanchoe flammea Rendimiento de cada uno de los extractos de diferentes polaridades de Kalanchoe sp. Se realizaron 3 extracciones para cada una de las plantas, con el método de maceración continua con los disolventes, etanol (polar), acetato de etilo (polaridad media), hexano (no polar). De cada uno de los extractos se obtuvo un rendimiento, el cual es mostrado en la Tabla 5. Extracto Etanol Acetato de Etilo Hexano K. pinnata 500 mg 725 mg 606 mg K. gastonis-bonnieri 576 mg 575 mg 887 mg K. flammea 480 mg 429 mg 255 mg Tabla 5. Rendimientos de los extractos a partir de 1 Kg de planta 69

85 8.2 Identificación preliminar de algunas familias de metabolitos presentes en Kalanchoe por cromatografía de capa fina En la estandarización de las fases móviles, los sistemas que separaron una mayor cantidad de compuestos (manchas), se muestran en la Tabla 6. Tabla 6. Fase móvil usada en la cromatografía en capa fina de los extractos de las tres especies de Kalanchoe Los tipos de compuestos químicos de los extractos de las tres plantas, se identificaron mediante CCF y con reveladores específicos. Los Rf y fotografías de la CCF de cada una de las especies estudiadas con los respectivos disolventes se muestran en las Tablas 7, 8 y 9 para K. pinnata, en las Tablas 10, 11 y 12 para K. gastonis-bonnieri y en las Tablas 13, 14 y 15 para K. flammea. 70

86 Revelador Yodo Sulfato sérico amoniacal / H 2SO 4 UV FeCl 3 / C 6FeK 4N 6 2,4- dinitrofenilhidrazina Dragendorff- Modificación de Mounier Prueba Positiva/Negativa Grupo funcional identificado Valor de Rf Ácidos grasos insaturados Rf 1=0.25 Rf 2=0.5 Rf 3=0.75 General Rf 1=0.125 Rf 2=0.25 Rf 3=0.625 Rf 4=0.875 General Rf 1=0.25 Rf 2=0.5 Rf 3=0.75 Aldehídos y cetonas Rf 1=0.5 Rf 2=0.775 Fenoles Rf 1=0.8 Alcaloides Rf 1=0.2 Rf 2=0.85 Placa Revelador Liebermann- Buchard Vainillina / H 2SO 4 Reactivo Citrobórico Reactivo de Borntrager KOH/Etanol Vainillina/KOH Prueba Positiva/Negativa Grupo funcional identificado Triterpenos - Flavonoide s Derivados antracénicos libres Cumarinas volátiles - Valor de Rf Rf 1=0.5 Rf 2= Rf 1=0.325 Rf 1=0.375 Rf 1=0.3 - Placa Tabla 7. Resultado del estudio fitoquímico preliminar del extracto etanólico de K. pinnata 71

87 Revelador Prueba Positiva/Negativa Grupo funcional identificado Valor de Rf Yodo Sulfato sérico amoniacal / H 2SO 4 UV FeCl 3 / C 6FeK 4N 6 Modificación de Mounier Ácidos grasos insaturado s Rf 1=0.075 Rf 2=0.175 Rf 3=0.4 Rf 4=0.475 Rf 5=0.6 Rf 6=0.85 General Rf 1=0.05 Rf 2=0.175 Rf 3=0.275 Rf 4=0.4 Rf 5=0.525 Rf 6=0.55 Rf 7=0.625 Rf 8=0.95 General Rf 1=0.05 Rf 2=0.1 Rf 3=0.175 Rf 4=0.25 Rf 5=0.375 Rf 6=0.55 Rf 7=0.65 Aldehídos y cetonas Rf 1=0.175 Rf 2=0.2 Rf 3=0.5 Rf 4=0.775 Fenoles Rf 1=0.35 Rf 2=0.575 Rf 3=0.575 Alcaloides Rf 1=0.2 Placa Revelador Prueba Positiva/Negativa 2,4- dinitrofenilhidrazina Dragendorff- Liebermann- Buchard Vainillina/H 2SO 4 Reactivo Citrobórico Reactivo de Borntrager KOH/Etanol Vainillina/KOH Grupo funcional identificado Valor de Rf Derivados antracénicos libres Rf 1=0.075 Rf 2=0.25 Cumarinas volátiles Rf 1=0.075 Rf 2=0.25 Aminoácidos y aminas Rf 1=0.075 Rf 2=0.25 Placa Tabla 8. Resultado del estudio fitoquímico preliminar del extracto con acetato de etilo de K. pinnata 72

88 Revelador Prueba Positiva/Negativa Grupo funcional identificado Valor de Rf Yodo Sulfato sérico amoniacal / H 2SO 4 UV FeCl 3 / C 6FeK 4N 6 2,4- dinitrofenilhidrazina Dragendorff- Modificación de Ácidos grasos insaturado s Rf 1=0.075 Rf 2=0.175 Rf 3=0.4 Rf 4=0.475 Rf 5=0.6 Rf 6=0.85 General Rf 1=0.075 Rf 2=0.15 Rf 3=0.275 Rf 4=0.425 Rf 5=0.575 Rf 6=0.775 Rf 7=0.85 Rf 8=0.95 General Rf 1=0.25 Aldehídos y cetonas Rf 1=0.75 Rf 2=0.2 Rf 3=0.5 Mounier Fenoles - Rf 1=0.35 Rf 2=0.575 Rf 3= Placa Revelador Prueba Positiva/Negativa Lieberman n-buchard Vainillina/H 2 SO 4 Reactivo Citrobórico Reactivo de Borntrager KOH/Etanol Vainillina/KO H Grupo funcional identificado Valor de Rf Placa Tabla 9. Resultado del estudio fitoquímico preliminar del extracto hexánico de K. pinnata 73

89 Revelador Prueba Positiva/Negativa Grupo funcional identificado Valor de Rf Yodo Sulfato sérico amoniacal / H 2SO 4 UV FeCl 3 / C 6FeK 4N 6 2,4- dinitrofenilhidrazina Dragendorff- Modificación de Ácidos grasos insaturad os Rf 1=0.075 Rf 2=0.375 Rf 3=0.85 Rf 4=0.925 General Rf 1=0.275 Rf 2=0.75 Rf 3=0.85 General Rf 1=0.1 Rf 2=0.6 Rf 3=0.875 Aldehídos y cetonas Rf 1=0.075 Fenoles Rf 2=0.2 Rf 1=0.1 Mounier Alcaloides Rf 1=0.2 Placa Revelador Prueba Positiva/Negativa Liebermann -Buchard Vainillina/H 2SO 4 Reactivo Citrobórico Reactivo de Borntrager KOH/Etanol Vainillina/KOH Grupo funcional identificado Triterpenos - Flavonoides - Cumarinas volátiles - Valor de Rf Rf 1= Rf 1=0.125 Rf 2= Rf 1=0.125 Rf 2= Placa Tabla 10. Resultado del estudio fitoquímico preliminar del extracto etanólico de K. gastonisbonnieri 74

90 Revelador Prueba Positiva/Negativa Grupo funcional identificado Valor de Rf Yodo Sulfato sérico amoniacal / H 2SO 4 UV FeCl 3 / C 6FeK 4N 6 Modificación de Ácidos grasos insaturados Rf 1=0.1 Rf 2=0.2 Rf 3=0.3 Rf 4=0.375 Rf 5=0.5 Rf 6=0.625 General Rf 1=0.015 Rf 2=0.375 Rf 3=0.625 Rf 4=0.7 Rf 5=0.75 General Rf 1=0.175 Rf 2=0.275 Rf 3=0.45 Rf 4=0.55 Rf 5=0.675 Aldehídos y cetonas Rf 1=0.175 Rf 2=0.775 Mounier Fenoles - Rf 1=0.1 Rf 2= Placa Revelador Prueba Positiva/Negativa 2,4- dinitrofenilhidrazina Dragendorff- Liebermann- Buchard Vainillina/H 2SO 4 Reactivo Citrobórico Reactivo de Borntrager KOH/Etanol Vainillina/KOH Grupo funcional identificado Triterpenos - Flavonoides - Cumarinas volátiles - Valor de Rf Rf 1= Rf 1=0.125 Rf 2= Rf 1=0.125 Rf 2=0.25 Rf 3= Placa Tabla 11. Resultado del estudio fitoquímico preliminar del extracto con acetato de etilo de K. gastonis-bonnieri 75

91 Revelador Prueba Positiva/Negativa Grupo funcional identificado Valor de Rf Yodo Sulfato sérico amoniacal / H 2SO 4 UV FeCl 3 / C 6FeK 4N 6 Modificación de Ácidos grasos insaturados Rf 1=0.1 Rf 2=0.2 Rf 3=0.75 Rf 4=0.8 Rf 5=0.9 Mounier General General Rf 1=0.1 Rf 2=0.2 Rf 3=0.75 Rf 4=0.8 Rf 5=0.9 Rf 1=0.175 Rf 2= Placa Revelador Prueba Positiva/Negativa 2,4- dinitrofenilhidrazina Dragendorff- Liebermann- Buchard Vainillina/H 2SO 4 Reactivo Citrobórico Reactivo de Borntrager KOH/Etanol Vainillina/KOH Grupo funcional identificado - - Flavonoides Derivados antracénicos - - Valor de Rf - - Rf 1=0.125 Rf 1= Placa Tabla 12. Resultado del estudio fitoquímico preliminar del extracto hexánico de K. gastonisbonnieri 76

92 Revelador Prueba Positiva/Negativa Grupo funcional identificado Valor de Rf Yodo Sulfato sérico amoniacal / H 2SO 4 UV FeCl 3 / C 6FeK 4N 6 Modificación de Ácidos grasos insaturados Rf 1=0.35 Rf 2=0.675 Rf 3=0.825 Rf 4=0.925 Mounier General General Rf 1=0.45 Rf 2=0.325 Rf 3=0.55 Rf 4=0.775 Rf 1=0.45 Rf 2=0.5 Rf 3=0.7 Rf 4= Placa Revelador Prueba Positiva/Negativa 2,4- dinitrofenilhidrazina Dragendorff- Liebermann- Buchard Vainillina/H 2SO 4 Reactivo Citrobórico Reactivo de Borntrager KOH/Etanol Vainillina/KOH Grupo funcional identificado Cumarinas volátiles - Valor de Rf Rf 1= Placa Tabla 13. Resultado del estudio fitoquímico preliminar del extracto etanólico de K. flammea 77

93 Revelador Prueba Positiva/Negativa Grupo funcional identificado Valor de Rf Yodo Sulfato sérico amoniacal / H 2SO 4 UV FeCl 3 / C 6FeK 4N 6 Modificación de Ácidos grasos insaturado s Rf 1=0.125 Rf 2=0.3 Rf 3=0.5 Rf 4=0.725 General Rf 1=0.125 Rf 2=0.275 Rf 3=0.45 Rf 4=0.575 Rf 5=0.75 General Rf 1=0.15 Rf 2=0.35 Rf 3=0.575 Aldehídos y cetonas Rf 1=0.15 Rf 2=0.35 Rf 3=0.625 Mounier Fenoles - Rf 1=0.125 Rf 2=0.35 Rf 3=0.6 - Placa Revelador Prueba Positiva/Negativa 2,4- dinitrofenilhidrazina Dragendorff- Liebermann- Buchard Vainillina/H 2SO 4 Reactivo Citrobórico Reactivo de Borntrager KOH/Etanol Vainillina/KOH Grupo funcional identificado - - Flavonoides Compuestos antracénicos Cumarinas volátiles - Valor de Rf - - Rf 1=0.125 Rf 2=0.325 Rf 1=0.125 Rf 2=0.25 Rf 1=0.375 Rf 2=0.575 Rf 3= Placa Tabla 14. Resultado del estudio fitoquímico preliminar del extracto con acetato de etilo de K. flammea 78

94 Revelador Prueba Positiva/Negativa Grupo funcional identificado Valor de Rf Yodo Sulfato sérico amoniacal / H 2SO 4 UV FeCl 3 / C 6FeK 4N 6 Modificación de Ácidos grasos insaturados Rf 1=0.1 Rf 2=0.3 Rf 3=0.45 Rf 4=0.85 Rf 5=0.925 General Rf 1=0.1 Rf 2=0.375 General Rf 1=0.1 Rf 2=0.85 Rf 3=0.925 Aldehídos y cetonas Mounier Fenoles - Rf 1=0.1 Rf 1= Placa Revelador Prueba Positiva/Negativa 2,4- dinitrofenilhidrazina Dragendorff- Liebermann- Buchard Vainillina/H 2SO 4 Reactivo Citrobórico Reactivo de Borntrager KOH/Etanol Vainillina/KOH Grupo funcional identificado - - Flavonoides Compuestos antracénicos - - Valor de Rf - - Rf 1 =0.925 Rf 1 = Placa Tabla 15. Resultado del estudio fitoquímico preliminar del extracto hexánico de K. flammea 79

95 La Tabla 16 muestra el estudio fitoquímico preliminar de las diferentes especies de Kalanchoe. Entre los principales compuestos químicos detectados se encuentran los ácidos grasos insaturados, aldehídos, cetonas, aminoácidos y aminas, así como los triterpenos, flavonoides, alcaloides y fenoles. Extracto Etanol Acetato de etilo Hexano K. pinnata K. gastonisbonnieri K. flammea Ácidos grasos insaturados Aldehídos y cetonas Fenoles Triterpenos Flavonoides Alcaloides Compuestos antracénicos Ácidos grasos insaturados Fenoles Triterpenos Cumarinas Ácidos grasos insaturados Aldehídos y cetonas Fenoles Ácidos grasos insaturados Aldehídos y cetonas Fenoles Ácidos grasos insaturados Aldehídos y detonas Fenoles Triterpenos Flavonoides Cumarinas Compuestos antracénicos Ácidos grasos insaturados Aldehídos y cetonas Fenoles Flavonoides Cumarinas Compuestos antracénicos Ácidos grasos insaturados Aminoácidos y aminas Aldehídos y cetonas Flavonoides Aminoácidos y aminas Fenoles Triterpenos Compuestos antracénicos Aminoácidos y aminas Fenoles Triterpenos Flavonoides Aldehídos y cetonas Cumarinas volátiles Tabla 16. Grupos químicos mayoritarios identificados en las tres especies de Kalanchoe 80

96 8.3 Ensayos de citotoxicidad Citotoxicidad en células de cáncer de próstata PC-3 Los resultados de la citotoxicidad de los tres extractos en la línea PC3, evaluada por la técnica de MTT se muestran en las Gráficas 1-3. En estas tanto los extractos con etanol y con acetato de etilo ejercen un efecto citotóxico dosis respuesta. Sin embargo, se puede apreciar que el extracto con acetato de etilo de K. flammea es el que mejor efecto citotóxico muestra desde una concentración de µg/ml (Grafica 3), con respecto a los extractos de Kalanchoe pinnata y Kalanchoe gastonis-bonnieri, los extractos con hexano no ejercen un efecto significativo. Gráfica 1. Porcentaje de viabilidad de células PC3 expuestas a diferentes extractos de K. pinnata con la técnica de MTT Gráfica 2. Porcentaje de viabilidad de células PC3 expuestas a diferentes extractos de K. gastonisbonnieri con la técnica de MTT 81

97 Gráfica 3. Porcentaje de viabilidad de células PC3 expuestas a diferentes extractos de K. flammea con la técnica de MTT la Tabla 17. La concentración IC 50 para cada uno de los extractos con la prueba de MTT se muestra en ETANOL ACETATO DE ETILO HEXANO K. pinnata μg/ml - K. gastonis-bonnieri μg/ml μg/ml - K. flammea μg/ml μg/ml - Tabla 17. IC 50 obtenidos con la técnica de MTT 82

98 Los resultados de citotoxicidad de las tres especies realizados con la técnica de cristal violeta en células PC3, se muestran en las Gráficas 4-6, donde se observa que el extracto con etanol de K. gastonis-bonnieri (desde una concentración de 6.25 μg/ml) y con acetato de etilo de K. flammea (desde una concentración de μg/ml) ejercen un mayor efecto dosis respuesta en las células cancerosas (Gráficas 5 y 6). Los extractos con hexano de las 3 especies no muestran efecto citotóxico en las células PC3. Gráfica 4. Porcentaje de viabilidad de células PC3 expuestas a diferentes extractos de K. pinnata con la técnica de CV Gráfica 5. Porcentaje de viabilidad de células PC3 expuestas a diferentes extractos de K. gastonisbonnieri con la técnica de CV 83

99 Gráfica 6. Porcentaje de viabilidad de células PC3 expuestas a diferentes extractos de K. flammea con la técnica de CV la Tabla 18. La concentración IC 50 para cada uno de los extractos con la prueba de CV se muestran en ETANOL ACETATO DE ETILO HEXANO K. pinnata μg/ml 83.2 μg/ml μg/ml K. flammea μg/ml μg/ml - K. gastonis-bonnieri μg/ml μg/ml - Tabla 18. IC 50 obtenidos con la técnica de CV 84

100 8.3.2 Citotoxicidad en células mononucleares de sangre periférica Los resultados de citotoxicidad que se obtuvieron en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) con la técnica de MTT, se muestran en las Gráficas 7-9. En éstas se puede apreciar que ninguno de los extractos mostró efectos citotóxicos significativos. Gráfica 7. Porcentaje de viabilidad obtenido con diferentes extractos de K. pinnata con la técnica de MTT en PBMC Gráfica 8. Porcentaje de viabilidad obtenido con diferentes extractos de K. gastonis- bonnieri con la técnica de MTT en PBMC 85

101 Gráfica 9. Porcentaje de viabilidad obtenido con diferentes extractos de K. flammea con la técnica de MTT en PBMC Los resultados de citotoxicidad en PBMC con la técnica de Cristal Violeta, se muestran en las Gráficas 10-12, donde se puede confirmar que ninguno de los extractos mostró efectos citotóxicos a ninguna de las concentraciones evaluadas. Gráfica 10. Porcentaje de viabilidad obtenido con diferentes extractos de K. pinnata con la técnica de CV en PBMC 86

102 Gráfica 11. Porcentaje de viabilidad obtenido con diferentes extractos de K. gastonis-bonnieri con la técnica de CV en PBMC Gráfica 12. Porcentaje de viabilidad obtenido con diferentes extractos de K. flammea con la técnica de CV en PBMC. 87

103 8.4 Ensayos de genotoxicidad Los resultados de genotoxicidad obtenidos con la prueba de Ames con la técnica de incorporación, fueron los siguientes: En las Gráficas se muestran los efectos en el valor de las revertantes espontáneas de los extractos con hexano, acetato de etilo y etanol de K. pinnata, K. gastonis-bonnieri y K. flammea a las diferentes concentraciones, así como los controles negativos y positivos con o sin activación metabólica, respectivamente en la cepa TA98 (que detecta mutaciones por corrimiento del formato de pares de bases en el ADN). La linea horizontal marcada en las gráficas delimita el doble de las revertantes espontáneas de la cepa, sobrepasando esta línea, un extracto puede considerarse mutagénico. Cabe señalar, que los controles usados como positivos, son potentes mutagenos que se encuentran en la clasificación estándar de la IARC (Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer). Como se puede observar, en la Gráfica 13, la dosis más alta del extracto con hexano de las tres especies produjo un ligero aumento de las revertantes espontáneas, repitiéndose el efecto con el extracto con acetato de etilo de K. gastonis-bonnieri (Gráfica 14). Sin embargo, no se produjo algún efecto significativo en el valor de las revertantes espontáneas de la cepa con los demás tipos de extractos a la más alta concentración (Gráfica 14 y 15). Gráfica 13. Efectos de los extractos con hexano de K. pinnata, K. gastonis-bonnieri y K. flammea en la cepa TA98 que detecta mutágenos por corrimiento de pares de bases 88

104 Gráfica 14. Efectos de los extractos con acetato de etilo de K. pinnata, K. gastonis-bonnieri y K. flammea en la cepa TA98 que detecta mutagenos por corrimiento de pares de bases Gráfica 15. Efectos de los extractos con etanol de K. pinnata, K. gastonis-bonnieri y K. flammea en la cepa TA98 que detecta mutagenos por corrimiento de pares de bases 89

105 Las Gráficas 16-18, muestran el efecto de los extractos con hexano, acetato de etilo y etanol de K. pinnata, K. gastonis-bonnieri y K. flammea en la cepa TA100, la cual ha sido modificada para detectar sustancias que causan mutaciones por sustitución de pares de bases. La Gráfica 17 muestra el efecto de los extractos con hexano de las tres especies de Kalanchoe, donde puede observarse un ligero aumento sobre la línea que indica el doble de las revertantes espontáneas de la cepa, a la más alta concentración probada (200 µg/placa). Así como sus respectivos controles con y sin activación metabólica. Sin embargo, los extractos con acetato de etilo y etanol no producen ningún efecto significativo en el valor de las revertantes espontáneas de las cepas por arriba de la línea indicada como el doble de la revertantes basales (Gráfica 17 y 18). Gráfica 16. Efectos de los extractos con hexano de K. pinnata, K. gastonis-bonnieri y K. flammea en la cepa TA100 que detecta mutágenos por sustitución de pares de bases 90

106 Gráfica 17. Efectos de los extractos con acetato de etilo de K. pinnata, K. gastonis-bonnieri y K. flammea en la cepa TA100 que detecta mutágenos por sustitución de pares de bases Gráfica 18. Efectos de los extractos de etanol de K. pinnata, K. gastonis-bonnieri y K. flammea en la cepa TA100 que detecta mutágenos por sustitución de pares de bases 91

107 En las Gráficas 19-21, se muestra el efecto de los extractos con hexano, acetato de etilo y etanol de K. pinnata, K. gastonis-bonnieri y K. flammea en la cepa TA102, la cual detecta mutágenos por la acción de radicales libres producidos. Como puede observarse, en la Gráfica 19 los extractos con hexano, no muestran ningún efecto sobre la reversión espontánea de esta cepa a ninguna de las concentraciones evaluadas. Lo mismo sucede con los extractos con acetato de etilo y etanol (Gráficas 20 y 21), indicando que ninguno de los diferentes extractos evaluados es capaz de inducir algún tipo de mutación por este mecanismo. Gráfica 19. Efectos de los extractos con hexano de K. pinnata, K. gastonis-bonnieri y K. flammea en la cepa TA102 que detecta mutágenos por la acción de radicales libres Gráfica 20. Efectos de los extractos con acetato de etilo de K. pinnata, K. gastonis-bonnieri y K. flammea en la cepa TA102 que detecta mutágenos por la acción de radicales libres 92

108 Gráfica 21. Efectos de los extractos con etanol de K. pinnata, K. gastonis-bonnieri y K. flammea en la cepa TA102 que detecta mutágenos por la acción de radicales libres 8.5 Análisis de apoptosis por citometría de flujo El uso de Anexina V es una técnica muy útil que hace referencia al proceso de apoptosis mediada por el mecanismo que previamente se mencionó. Como la Anexina está marcada con Isotiocianato de fluoresceína (FITC), ésta pudo ser cuantificada por citometría de flujo. El cambio de proporción de los aminofosfolípidos de la fosfatidilserina suele ocurrir de forma previa a la formación de cuerpos apoptóticos, por lo que es posible determinar la aparición de apoptosis temprana. Las células que tengan un alto marcaje de IP serán las que tengan su membrana suficientemente desorganizada como para permitir que éste penetre, lo que corresponderá a una apoptosis tardía. Las gráficas fueron representadas por la intensidad de la fluorescencia de la fluoresceína y la intensidad del IP. De tal forma que si las células tratadas tienen un mayor marcaje de Anexina se encontrarán por encima del umbral de Anexina, al igual que con el marcaje con IP. Estos cuatro cuadrantes corresponden a: Células con alto marcaje de Anexina V-FITC y bajo de IP que corresponden a células en apoptosis temprana, células con alto marcaje de Anexina V-FITC y alto en IP son aquellas que se encuentran en etapas finales del proceso de apoptosis (tardía), células 93

109 con bajos marcajes de Anexina y IP (células normales), y por último células con bajo marcaje de Anexina V-FITC, y alto de IP (células necróticas). Los resultados obtenidos fueron los siguientes: La Gráfica 22 representa a las células sin tratamiento, mostrando que la población celular, se encuentra viable en un 99% (Cuadrante 3). La Gráfica 23 representa el control negativo en donde las células fueron tratadas con DMSO (0.1 %) donde el porcentaje de células en estado normal es de 96.31% (Cuadrante 3) y los demás cuadrantes en porcentajes por debajo de 3% y las Gráficas 24 y 25 muestran los resultados con los controles positivos, en la cual las células fueron tratadas por 24 h con Taxol (4.26 μg/ml) y con Perezona (24.8 μg/ml) respectivamente; el gráfico correspondiente a las células tratadas con Taxol muestran pocas células en estadíos apoptóticos (Cuadrante 2 y 4) y en estado normal (Cuadrante 3), a diferencia de la Perezona en la que las células se encuentran en un 70% en estado apoptótico (Cuadrante 2 y 4) y un 30% en estado normal (Cuadrante 3). Gráfica 22. Células sin tratamiento Gráfica 23. Células con DMSO 0.1%. 24 h Gráfica 24.Células con Taxol (4.26 μg/ml) 24 h Gráfica 25.Células con Perezona (24.8 μg/ml) 24 h 94

110 Los resultados obtenidos al tratar las células PC3 con la dosis de IC 50 del extracto con acetato de etilo de Kalanchoe flammea se muestran en las Gráficas 26, 27, 28 y 29, a los tiempos de 3, 6, 12 y 24 h respectivamente, mostrando el efecto apoptótico dependiente del tiempo, donde a las 24 h aproximadamente un 50% de la población celular se encuentra tanto en estado apoptótico temprano así como en tardío (Cuadrantes 2 y 4) (Gráfica 29). Los cuatro gráficos (Cuadrantes 1) muestran menos de 2.5 % de células en estados necróticos. Todos los gráficos representan 10,000 eventos (células) evaluados. Gráfica 26. Células con el extracto con acetato de etilo de Kalanchoe flammea 3h Gráfica 27. Células con el extracto con acetato de etilo de Kalanchoe flammea 6h Gráfica 28. Células con el extracto con acetato de etilo de Kalanchoe flammea 12h Gráfica 29. Células con el extracto con acetato de etilo de Kalanchoe flammea 24h 95

111 En la Gráfica 30 se esquematiza el porcentaje de apoptosis temprana y tardía para cada uno de los controles y así como los tratamientos con el extracto con acetato de etilo de Kalanchoe flammea (33.23 μg/ml) a los diferentes tiempos establecidos, mostrando un incremento tiempo-dependiente de la inducción de apoptosis por parte de éste. Grafica 30. Efecto del extracto con acetato de etilo de K. flammea en las células PC Análisis de la expresión de proteínas apoptóticas Como se mencionó antes, las caspasas están involucradas en la muerte celular, y son clasificadas en dos grupos: iniciadoras y ejecutoras, y se encuentran involucradas tanto para la vía extrínseca como intrínseca. Para determinar el proceso que se está llevando a cado en la inducción de apoptosis por el extracto con acetato de etilo de Kalanchoe flammea, en células de cáncer de próstata, se llevó a cabo el análisis de algunas de las proteínas implicadas en este proceso por Inmunodetección, en el cual se analizó tanto el nivel de expresión de las proteínas de la vía intrínseca, como extrínseca. Esta valoración se realizó en diferentes tiempos de tratamientos con el extracto (3, 6, 12, 24 h) y con controles negativos correspondiente a células sin ningún tratamiento, con el vehículo de los extractos (DMSO 0.1%) y con Taxol (0.512 μg/ml). Primero se verificó la integridad de las proteínas después de haber realizado la extracción mediante el lisado celular, en un gel de acrilamida al 15% y teñido con azul de Coomassie. Figura