Maestría en Micología Médica

Transcripción

1 Universidad Nacional del Nordeste Facultad de Medicina Maestría en Micología Médica Director: Dr. Ricardo Negroni Coordinadores: Dra. Alicia Arechavala Dr. Gustavo E. Giusiano Unidad Temática III Diagnóstico de las micosis superficiales Cohorte

2 El diagnóstico de las dermatomicosis, requiere de varios pasos que son comunes a todas ellas y que son fundamentales para lograr identificar correctamente al agente causal. Preparación del paciente Antes de la toma de la muestra, se debe indicar al paciente la forma en que debe concurrir al laboratorio para la realización del examen micológico. En primer término hay que preguntarle si está recibiendo o ha recibido medicación antifúngica oral o local y en caso afirmativo indicarle que debe suspenderla al menos una semana antes de realizar el estudio si el tratamiento era tópico y 2-3 semanas en caso de que fuera oral. La zona debe estar limpia y sin ningún tipo de cremas, lociones, pomadas, antisépticos, etc. Debe indicarse la higiene con agua y jabón y en las lesiones de uñas debe agregarse el cepillado de las mismas, al menos 2-3 días previos a la realización del estudio. Deben evitarse los cosméticos y los esmaltes de uñas. Para las lesiones en los pies debe indicarse el uso de calzado cerrado y medias y no colocar polvos, talcos o desodorantes ni en los pies ni en el calzado. Si debe tomarse una muestra de cuero cabelludo, el cabello debe lavarse con champú común y evitar el rasurado en lesiones de la barba. Cuando las lesiones están en las manos se recomienda el lavado de las mismas antes del momento de la extracción de la muestra. Para las lesiones de la mucosa oral, el paciente deberá concurrir en ayunas y luego de una buena higiene bucal. Para la toma de flujo vaginal la preparación es similar a la de otros estudios microbiológicos: evitar relaciones sexuales los 3 días previos, higiene con agua y jabón evitar la colocación de óvulos u otras medicaciones intravaginales. Toma del material Siempre que sea posible, las muestras deben tomarse directamente en una sala de extracciones del laboratorio. La forma de obtención dependerá de la localización y el tipo de lesión. En todos los casos debe contarse con el instrumental adecuado (sindesmótomos, bisturí tipo Collins, mangos y hojas descartables de bisturí, tijeras, pinzas de depilar, curetas, pinzas diente de ratón, hisopos estériles humedecidos con solución salina isotónica, portaobjetos esterilizados o cajas de Petri estériles). 1. Lesiones de regiones pilosas (cuero cabelludo, barba, bigote, dermatofitosis foliculares): En las tineas capitis de tipo microspórico se obtienen escamas de la placa por raspado con bisturí y pelos del borde con pinzas de depilar, en las del tipo tricofítico pelos y en los kerion de Celso se toman muestras de escamas, pelos y material supurativo. Este material se recoge sobre portaobjetos estériles y se mantienen entre 2 portaobjetos hasta el momento de su procesamiento en el laboratorio. En las lesiones de la barba (sicosis), bigote y dermatofitosis foliculares de las piernas, debe procederse de la misma manera, tratando de extraer pelos infectados con ayuda de pinza de depilar y escamas por raspado. Cuando se trate de lesiones que afecten el tallo del pelo (piedras, tricomicosis) debe cortarse trozos de cabello donde se encuentren los nódulos y colocarlos en una placa de Petri o entre 2 portaobjetos estériles hasta su procesamiento.

3 2. Lesiones de piel glabra y pliegues cutáneos: Las muestras de piel y uñas se obtienen después de la desinfección de la zona afectada con etanol 70. En las lesiones descamativas se realiza un raspado del borde la lesión usando una cureta de Brocq, sindesmótomo o bisturí de tipo Collins. Las escamas se colocan entre dos portaobjetos esterilizados o bien en una placa de Petri pequeña hasta el momento de la realización del examen. 3. Lesiones ungueales: La toma de muestra se realizará según el tipo de lesión, raspando con un sindesmótomo por debajo de la uña en caso de lesiones distales o laterales subungueales y en las onicolisis, o con hoja de bisturí cuando se trate de lesiones superficiales o profundas tomando capas de la lámina ungueal hasta llegar a la que está afectada. Cuando hay paroniquia se toma del reborde periungueal y en caso de onicomadesis del extremo proximal de la uña. Al igual que en las otras lesiones el material se conserva entre portaobjetos esterilizados hasta ser procesados. 4. Lesiones mucosas y semimucosas: Habitualmente la muestra se toma con hisopo humedecido en solución salina. Se deben obtener el material en 2 hisopos uno para los cultivos y el otro para los exámenes directos o Si es posible, se puede tomar material con espátula para el examen directo que se coloca sobre portaobjetos, uno para examen al estado fresco que debe ser procesado de inmediato y otros para realizar las coloraciones necesarias. Estudio micológico El estudio con luz de Wood establece si los pelos o las lesiones cutáneas dan fluorescencia o no. Es positiva en pelos microspóricos y en las tiñas fávicas por T. schoenleinii. También se observa fluorescencia en la pitiriasis versicolor, en todos estos casos la fluorescencia es de color amarilloverdoso. En las infecciones debidas a Nocardia minitissima (Corynebacterium minutissimum) es de color rojo coral. Examen directo Se realiza con hidróxido de potasio al % con el objeto de digerir la queratina, a fin de facilitar la visualización de las estructuras fúngicas. También se le puede adicionar tinta azul-negro permanente de Parker, y así mejorar la visualización de las hifas que se tiñen de ligeramente de azul y se evidencian claramente los elementos filamentosos y levaduras de Malassezia. Otras opciones incluyen el uso de negro de clorazol o blanco de calcoflúor usando microscopio de fluorescencia. Estas preparaciones son de gran utilidad, en especial cuando existen pocos microorganismos en la lesión ya que aumentan la sensibilidad del examen directo. Observación Dermatofitos: o En las escamas se observan como hifas hialinas largas, tabicadas, a veces artrosporadas. o Pelos: pueden presentar cinco tipos de parasitación: dos endothrix y tres ectothrix. Del tipo endothrix se distinguen la parasitación tricofítica (T. tonsurans), con una gran cantidad de esporas agrupadas en el interior del pelo y una forma fávica con esporas e hifas, así como burbujas de aire en el interior del tallo del pelo (T. schoenleinii). La parasitación ectoendothrix clásica tiene una forma microspórica (M. canis) con esporas pequeñas y ordenadas alrededor del pelo, una forma microide con esporas con disposición laxa alrededor del pelo (T. mentagrohytes) y una forma megasporada (T. verrucosum) con grandes esporas alrededor del pelo. Cuando T. rubrum parasita el pelo es endothrix.

4 Esquema que muestra la invasión del pelo. En las infecciones por Scytalidium, el examen directo es característico ya que se observan filamentos irregulares en grosor (apariencia de doble contorno) con cadenas de artroconidios a menudo ramificados de paredes gruesas, al principio hialinos y luego oscuros. Presentan variabilidad en el ancho de las hifas con engrosamiento y espirales. Los elementos de Malassezia se presentan en el examen directo como hifas cortas, de diámetros irregulares y acúmulos de levaduras características en caso de pitiriasis versicolor, en tanto que en las foliculitis, dermatitis seborreicas, etc. habitualmente se observa solamente la fase de levaduras de este microorganismo. Los exámenes directos se realizan con hidróxido de potasio o de sodio al 20% con el agregado de tinta Parker azul negro permanente. El hidróxido tiene por objeto aclarar la capa cornea de la piel y la tinta la coloración del hongo. La visualización también puede realizarse coloreando las escamas con azul de metileno; para ello es necesario adherir la muestra a un portaobjetos con una gota de suero fenicado y dejar secar, luego se tiñe durante 5 minutos con una solución de azul de metileno al 1% y luego se lava por inmersión para evitar el desprendimiento de las escamas, el preparado se deja secar y se observa con objetivo de inmersión. Como se mencionó anteriormente también puede realizarse una preparación con KOH-tinta azul negro permanente. El material de las pústulas se coloca sobre un portaobjetos, se deja secar y se tiñe con azul de metileno, o colorante de Giemsa. En el caso de la pitiriasis versicolor, también se puede utilizar un trozo de cinta adhesiva transparente. Se aplica la cara engomada sobre la lesión, se retira la cinta con la impronta y se coloca sobre un portaobjetos. La observación se realiza agregando previamente, por capilaridad, azul de metileno al 1% entre la cinta y el portaobjeto En la tinea nigra, el examen de las escamas aclaradas con KOH muestra hifas pardas, tabicadas y ramificadas. Los pelos para visualizar elementos de piedra blanca o negra o con sospecha de tricomicosis, se cortan y se coloca el trozo donde se encuentra el nódulo sobre un portaobjetos, se agrega una gota de KOH y se cubre con un cubreobjetos y se calienta muy suavemente. Luego se observa con objetivo de poco aumento para ver el nódulo y luego con

5 objetivo de 40 X para visualizar los filamentos fúngicos hialinos segmentados en artroconidias en caso de piedra blanca o hifas pigmentadas agrupadas densamente y la presencia de ascos con ascosporos en su interior (como ya fue explicado en aspectos clínicos). En caso de tricomicosis se observan nódulos con filamentos muy finos que corresponden a las estructuras bacterianas. En caso de eritrasma y tricomicosis, las escamas primero se procesan como en el caso de las dermatoficias con el agregado de KOH y calentándolas suavemente, una vez realizada la visualización microscópica se lavan las escamas previamente tratadas con KOH colocándolas en un tubo de centrífuga plástico arrastrándolas del portaobjetos y del cubreobjetos con agua destilada estéril con la ayuda de una pipeta Pasteur, se tapa el tubo y se centrifuga durante 5 minutos a 3000 rpm, luego se descarta el sobrenadante y con el sedimento se realizan 2 improntas sobre portaobjetos, se secan bien y se tiñen con azul de metileno y coloración de Zihel-Neelsen. En caso de eritrasma, el examen directo con hidróxido de potasio muestra bastones aislados o en cadena y filamentos flexuosos de 4 a 7 µm de longitud promedio, con elementos cocoides de 1 a 3 µm. En el examen directo de los nódulos de tricomicosis, con hidróxido de potasio o azul de metileno se observan elementos cocoides difteroides de 0,4 a 0,6 µm por 1,8 µm así como filamentos bacterianos de menos de 1 µm de diámetro. Para el diagnóstico de las candidiasis cutáneas o ungueales, las muestras se procesan de la misma manera que para las dermatofitosis, utilizando KOH 20-40% y esto permite la visualización de las seudohifas y blastosporas de Candida. En las lesiones mucosas no es imprescindible aclarar el material y los elementos fúngicos pueden verse en las preparaciones al estado fresco, esto además permite realizar coloraciones de Gram o Giemsa utilizando este mismo material. Estas coloraciones son de gran utilidad ya que las levaduras y seudohifas son grampositivas y además se ve la biota acompañante especialmente en muestras de flujo vaginal u otras lesiones. Cultivos e identificación Dermatofitosis El cultivo se efectúa en medios habituales como agar Sabouraud, agar lactrimel de Borelli, agar avena, DTM, etc.; con antibióticos y sin ellos. Los dermatofitos se caracterizan por tolerar cicloheximida y alcalinizar el medio cuando crecen en agar con glucosa o peptona. Para estimular la fructificación se utiliza agar papa glucosado o agar harina de maíz. La identificación se logra al estudiar las características macroscópicas y microscópicas de las colonias, velocidad de crecimiento, tamaño, color, aspecto y textura, tipos de filamentos, septos, clamidosporos, hifas especiales y principalmente por las características de las conidias. De acuerdo con su hábitat las especies de dermatofitos se dividen en 3 grupos: Existen especies que primariamente afectan al hombre y se denominan antropófilas, otras zoófilas (pues infectan a animales y accidentalmente al hombre) y las geófilas (habitantes del suelo) que pueden ocasionar enfermedad en el hombre y los animales.

6 Como ejemplo de los tres grupos tenemos: Especies antropófilas: T. rubrum, T. tonsurans, T. violaceum, T. mentagrophytes, T. interdigitale, T. schoenleinii, T. soudanense, T. concentricum, M. audouinii, M. ferrugineum. Especies zoófilas: T. mentagrophytes, T. verrucosum, T. equinum, M. canis, M. nanum, M. gallinae y M. distortum. Especies geófilas: M. gypseum, M. cookei y M. fulvum. Género Trichophyton Presenta microconidias abundantes, globosas, piriformes o en forma de lágrima, de 2 a 4 µm de diámetro y escasos macroconidias de paredes delgadas, de formas variables y extremo distal romo, de 4 a 8 por 8 a 50 µm. T. rubrum: posee generalmente colonias de color blanco, algodonosas con pigmento rojo en el reverso. Las microconidias pueden ser numerosas o escasas, en forma de lágrima y nacen a los lados de las hifas. Las macroconidias son escasas y tienen forma de lapiz. Existen formas granulosas y plegadas y pulvelulentas. T. mentagrophytes: presenta colonias algodonosas de color blanco cremoso, con escasa fructificación. Las cepas pulverulentas, con márgenes radiadas, que en el reverso tienen un color rojo café, presentan abundantes microconidias. Estas son esféricas y se distribuyen en forma de racimos de uvas, a lo largo de las hifas. Las macroconidias son cilíndricas y de paredes delgadas; presentan además hifas en espiral. Presenta cepas antropófilas vellosas actualmente clasificadas como T. interdigitale. T. tonsurans: da colonias pulverulentas que luego se pliegan, el color de la superficie pude ser blanco, gris o amarillo. Las microconidias son numerosas, de tamaño variable, piriformes y nacen de artrosporos; las macroconidias se estrechan a nivel de cada tabique. Se reconocen dos especies T. tonsurans variedad tonsurans y variedad sulfureum. T. violaceum: da colonias glabras de crecimiento lento y textura firme, son de color violáceo o rojizo. Microscópicamente se observa un micelio vegetativo con hifas de diverso espesor y clamidosporos, no presenta conidias. T. verrucosum: da colonias de crecimiento muy lento con textura dura; crece mejor a 37 C y con extracto de levadura en el medio. Puede haber microconidias en forma de lágrima y macroconidias generalmente ausentes; hay gran cantidad de clamidoconidias dispuestas en serpiente de cascabel. T. concentricum: da colonias de crecimiento lento y aspecto céreo de color blanco cremoso o ligeramente rosadas, grises de superficie blanca con hifas en astas de ciervo, carecen de fructificación. T. schoenleinii: da colonias de crecimiento lento con textura glabra de color blanco grisácea, aspecto cerebriforme. La principal característica es la presencia de hifas en asta de ciervo, es decir extremos ramificados y redondeados o hinchados y de clamidosporos terminales. T. soudanense: produce colonias glabras de crecimiento lento con textura suave, color naranja. Su principal característica es la presencia de hifas ramificadas y reflexivas.

7 Género Microsporum M. canis: es la especie más importante. Tiene colonias de crecimiento rápido de superficie planas y abundantes hifas aéreas de aspecto velloso, con un color amarillo naranja en el reverso y bordes. Las macroconidias son fusiformes con extremos afilados y paredes gruesas y equinuladas. Presentan de 1 a 15 septos. Se pueden hallar formas glabras de textura cérea. Son inestables y revierten a su forma original con la edad, tiene dos variedades disortum y obesum. M. audouinii: da colonias planas de color blanco, textura sedosa reverso de color rosado, puede haber microconidias elongadas y si hay microconidias, tienen aspecto distorsionado, tiene dos variedades langeroni y rivalieri aunque las consideren especies. La primera produce colonias de color café rosa, con surcos radiados, la segunda produce colonias blanco grisáceas, céreas con hifas pectinadas. M. gypseum (dermatofito geófilo de mayor importancia): da colonias de crecimiento rápido color canela y textura pulverulenta, hay microconidias y macroconidias fusiformes con puntas romas, paredes más finas que las de M. canis y con menos de seis septos. M. ferrugineum: da colonias radiadas de color amarillento o rojo oxidado con microscopía de hifas de bambú. Microscópicamente el micelio es estéril. Género Epidermophyton Tiene una sola especie patógena para seres humanos. E. floccosum (antropófila y que no afecta pelos de cabeza) esta se caracteriza por colonias radiadas y finamente pulverulentas de crecimiento rápido de color verdoso al envejecer se va plegando. Produce macroconidias de paredes lisas, de mediano espesor y extremo distal romo, en forma de clava. No produce microconidias pero si numerosos clamidosporos. Otras pruebas diferenciales 1. Producción de ureasa El viraje del color del medio de amarillo a rojo antes de los 7 días indica la capacidad para usar urea. T. rubrum da la prueba negativa, T. mentagrophytes y T. tonsurans dan positivo. 2. Test de órganos perforadores Se visualizan cuñas transversas en los pelos. Se usan pelos de niños esterilizados con extracto de levadura diluido colocados en cajas de Petri. Luego de la inoculación se incuban dos semanas. Es positiva en T. mentagrophytes y M. gypseum y negativa en T. rubrum. Se usa generalmente para diferenciar T. mentagrophytes de T. rubrum. 3. Temperatura óptima de crecimiento T. verrucosum crece mejor a 37 C y algunas cepas de T. tonsuran también, los demás dermatofitos se desarrollan a temperatura ambiente. 4. Crecimiento en granos de arroz Luego de colocar granos de arroz en un frasco, se cubre de agua destilada y se esteriliza. Los hongos se inoculan en la superficie de los granos y se incuban de 7 a 14 días. M. audouinii no crece en granos de arroz y M. canis o M. gypseum crecen abundantemente. 5. Requerimientos vitamínicos especiales Estas técnicas se basan en la diferenciación de las especies de dermatofitos según los requerimientos específicos que tienen algunos de ellos por ciertas vitaminas y otros factores de crecimiento.

8 El ensayo nutricional se realiza con tiamina, inositol, histidina, ácido nicotínico entre otros y permite diferenciar especies principalmente del género Trichophyton. 6. Producción de pigmentos La capacidad de los dermatofitos para producir pigmento cuando están creciendo en ciertos medios como por ejemplo: agar papa dextrosa es característica de algunas especies de este grupo de hongos. La producción de pigmento puede usarse para diferenciar T. mentagrophytes y T. rubrum ya que T. rubrum es capaz de producir pigmento color rojizo o rojo oscuro. Técnicas inmunológicas Intrademorreacción: Se realiza con tricofitina y no tiene utilidad práctica. Es positiva en la población en general, esto dado por el contacto previo con el hongo. En formas inflamatorias da respuesta positiva y en formas secas crónicas y escamosas así como en las onicomicosis es casi siempre negativa. Las pruebas serológicas no se utilizan para el diagnóstico de las dermatofitosis, aunque se producen anticuerpos específicos. Conservación de las cepas de dermatofitos Se debe tener presente que no todas las especies soportan las técnicas de conservación y mantenimiento habituales. La resiembra continuada de estos hongos en un medio de mantenimiento como el Sabouraud dextrosa tiende a degenerar los cultivos, observándose un fenómeno creciente llamado pleomorfismo. El mantenimiento de cepas a 4 C tampoco está recomendado para ciertas especies como E. floccosum y T. verrucosum. Lo más recomendado para conservar estos hongos es realizar una suspensión espesa del hongo en agua estéril y guardarla a temperatura ambiente. También se recomienda su conservación en medios de cultivo sin o con baja concentración de glucosa y mantenerlos mediante subcultivos. Tinea nigra La siembra se realiza en agar glucosado de Sabouraud solo o con antibióticos y agar lactrimel a temperatura ambiente. Luego de dos o tres semanas crecen colonias levaduriformes negras y brillantes, que más tarde se tornan verdosas o grises y aparecen hifas aéreas. En cultivos jóvenes se observan al microscopio levaduras ovales de 3 a 10 µm con un solo septo, en cambio en los más viejos se observan hifas tortuosas de color verde oscuro con tabiques y conidióforos en anélidos con racimos de conidios fusiformes con un septo. Rara vez se observan clamidosporos. (La descripción de Hortaea werneckii está en aspectos clínicos) Piedra blanca La piedra blanca es ocasionada por Trichosporon beigelii. Las especies del género Trichosporon son: T. ovides, T.inkin, T. asahii, T. asteroides, T. cutaneum y T. mucoides. Las características morfológicas son parecidas y se requieren estudios moleculares para su identificación.

9 Taxonómicamente se ubica: Phylum Basidiomycota Subphylum Agaricomycotina Clase Tremellomycetes Orden Tremellomycetidae Familia Tremellales Subfamilia Trichosporonaceae Género Trichosporon El cultivo se realiza en agar Sabouraud con cloranfenicol y a temperatura ambiente. Luego de 48 a 72hs desarrollan colonias blancas o beige, al principio lisas y luego de superficie plisada o cerebriforme (aspecto mantecoso). En el microscopio se observan seudohifas o hifas septadas de 2 a 4 µm, artrosporas rectangulares, blastosporos redondos y blasto-artrosporas. Las colonias crecen a 28 C y 37 C, son sensibles a la cicloheximida y utilizan inositol. Dan urea positiva después de 18 a 24 horas a 37 C. Para llegar a su identificación bioquímica se utilizan azúcares (dextrosa, lactosa, xilosa e inositol), la identificación rápida se realiza con equipos comerciales de identificación de levaduras. Piedra negra Las colonias de Piedraia hortae crecen en forma lenta en Sabouraud con cloranfenicol a 25 C, en dos a tres semanas aparecen y son de color café, negro, verde, lisas además pueden tomar aspecto cerebriforme. Al microscopio se ven filamentos pigmentados cortos, de pared gruesa, ramificados y tabicados, con clamidosporos y en ocasiones ascostromas globosos u ovoides con ascas y ascosporas, con las mismas características que en el examen directo. La ubicación taxonómica de este hongo es: División Ascomycota Clase Pezizomycotina Subclase Dothideomycetes Orden Dothideomycetidae Familia Piedraiaceae Género Piedraia Especie Piedraia hortae (Brumpt) da Fonseca & de Aréa Leao Candidiasis Los hongos del género Candida desarrollan bien en los medios de cultivo habituales en los laboratorios de microbiología. Cuando el examen directo muestra la presencia de elementos levaduriformes con o sin seudohifas se recomienda la siembra en medios con sustratos cromogénicos que permiten la identificación presuntiva más rápida a la vez que evidenciar si hay más de una especie en la lesión. Debe tenerse en cuenta que el aislamiento de levaduras en los cultivos no es suficiente para considerar a estos microorganismos como agentes causales de la lesión y la presencia de levaduras y/o seudohifas en los exámenes directos es un elemento de gran valor para considerar esta etiología.

10 La identificación de levaduras para el diagnóstico de candidiasis superficiales no es indispensable en todos los casos; sin embargo, es imprescindible en casos de lesiones de mucosa orofaríngea, en las vulvovaginitis, en especial en las formas recurrentes; en pacientes inmunocomprometidos y en las candididiasis mucocutáneas crónicas. En las otras localizaciones tiene valor epidemiológico y si el laboratorio no cuenta con los medios para la identificación definitiva puede realizar la identificación presuntiva y conservar el aislamiento por si fuera necesario llegar al reconocimiento de la especie posteriormente o por si hiciera falta estudiar la sensibilidad a los antifúngicos. Para la identificación de cualquier levadura debe partirse de una única colonia aislada, esta se subcultiva en agar de Sabouraud y a partir de allí se inicia el estudio del aislamiento. La identificación definitiva se basa en la capacidad de asimilación de fuentes de carbono (auxanograma de carbono) y de nitrógeno (auxanograma de nitrógeno), el estudio de los azúcares que es capaz de fermentar (zimograma), tamaño, forma, color, producción de pigmento carotenoides, formación de seudohifas, presencia de clamidoconidias, artroconidias o blastoartroconidias, formación de ascosporas (en medio de Gorodkowa o V8) o balistosporas y numerosas pruebas adicionales según los casos. También se tienen en cuenta aspectos macromorfológicos como textura, aspecto, bordes de la colonia en medio de agar extracto de malta. Los medios cromogénicos (CHROMagar Candida, Brilliance Oxoid, Candida ID2 biomérieux), son de gran ayuda ya que en primer término permiten reconocer presuntivamente Candida albicans/ C. dubliniensis (azul en Candida ID2 y verde en los otros medios) y diferenciarlas de las demás levaduras. En los 2 primeros medios también es posible aproximarse al diagnóstico de C. tropicalis (color azul en CHROMagar y Brilliance), y cuando aparecen colonias de color rosa viejo de aspecto seco y de bordes festoneados puede presumirse que se trata de C. krusei. El restos de las levaduras presentan colonias que varían su color del rosa pálido al violeta o beige pálido al marrón o se mantienen de color crema según el medio utilizado. Trichosporon spp. aparece como colonias ligeramente vellosas a los 4-5 días y de color azul en CHROMagar y Brilliance, las características micromorfológicas permiten distinguir si corresponden a este género. El aspecto micromorfológico puede estudiarse en medios como el agar harina de maíz con, agarleche, agar-arroz todos con el agregado de Tween 80 al 1%. En ellos puede verificarse la presencia o no de seudohifas, la formación de clamidoconidias características de C. albicans /C. dubliniensis, la forma y disposición de las seudohifas y la distribución de las blastoconidias, la presencia de artroconidias o blastoartroconidias. La presencia de ascosporas se estudia en medio de Gorodkowa o V8, también pueden efectuarse coloración de un extendido de levaduras por el método de Kinyoun y así ver la presencia de ascosporas ácido-resistentes (ej. Saccharomyces). Otros aspectos a analizar es la capacidad de desarrollo a distintas temperaturas, la asimilación de xilosa, producción de halo de opacidad en medios con Tween y CaCl 2, la producción de tubos germinativos en suero, que contribuyen a la identificación rápida de especies como C. albicans/ C. dubliniensis. En la actualidad se cuenta con numerosos equipos comerciales de identificación manuales y automatizados que permiten la identificación definitiva de la mayor parte de las levaduras de interés clínico (Api 20C, Api 20C aux, Api ID 32C, Vitec; Microscan, Candifast y Fungichrom; y otros equipos que no se encuentran en nuestro país). También se pueden identificar a través de PCR, con primers específicos. Esto es de gran utilidad para distinguir con certeza, C. albicans de C. dubliniensis. El esquema de identificación puede variar en los distintos centros de diagnóstico y aquí proponemos el que nos resulta más adecuado en nuestro laboratorio. 1. Aislamiento en agar cromogénico: puede sembrarse la muestra directamente en este medio, teniendo cuidado de obtener colonias aisladas para poder determinar si hay un solo tipo de aislamiento o si hay más de una especie (colonias de colores diferentes); también pude realislarse en este medio a partir de un cultivo en medio de Sabouraud u otro medio donde se haya aislado la levadura haciendo una suspensión en solución fisiológica de varias colonias y

11 luego sembrando en el medio cromogénico para obtener colonias aisladas. La identificación se realizará a partir de una única colonia de cada color obtenido, para ello se subcultiva una colonia aislada en un tubo con medio de Sabouraud sin antibiótico, durante 24 horas. 2. Colonias de color verde (o azul en Candida ID): presuntivamente corresponden a C. albicans o C. dubliniensis. Para confirmarlo se pueden llevar a cabo las siguientes pruebas: producción de tubos germinativos en suero o en agar-leche, producción de clamidoconidias en agar-leche o agar harina de maíz con tween 80. Para diferenciar entre ambas especies pueden considerarse las siguientes características: C. albicans C. dubliniensis Producción de tubos germinativos + + Producción de clamidoconidias en agar-leche + + muy abundantes Desarrollo a 45 C + - Asimilación de D-xilosa + Producción de lipasas en medio con tween- CaCl 2 Color y aspecto en agar tabaco, producción de clamidoconidias + - Blanca, lisa y no produce clamidoconidias o son escasas Dorada, rugosa, clamidoconidas muy abundantes Asimilación de N acetil glucosamina Colonias de otro color: Se recomienda sembrar una placa con agar harina de maíz para estudiar la micromorfología como complemento de las otras pruebas diferenciales que se realicen. a. Colonias azules cremosas: presuntivamente se trata de C. tropicalis. Esta levadura crece a 42 C, asimila galactosa pero no lactosa, rafinosa, L-ramnosa, meso-eritritol, mioinositol ni D-triptofano; fermenta maltosa. Microscópicamente presenta blastosporas elipsoidales, abundante seudomicelio con elementos largos y escasamente ramificados y que suelen estrecharse cerca del ápice estéril. Las conidias se ubican en pequeños grupos en el medio de cada elemento celular. b. Colonias azul afelpadas: los hongos del género Trichosporon suelen observarse así en medios cromogénicos. La presencia de blastoartroconidias en agar harina de maíz, que sean ureasa +, nitrato y no fermentadoras contribuyen a la identificación. El uso de equipos comerciales o las pruebas de asimilación, capacidad de desarrollo a 37 C, resistencia frente a cicloheximida permiten diferenciar las distintas especies. c. Colonias rosa viejo: de aspecto seco y butiroso, bordes festoneados, es presuntivo de C. krusei. Microscópicamente se observan elementos brotantes elipsoidales a cilíndricos con cicatrices planas y bien circunscriptas; habitualmente presentan seudomicelio que es robusto y las células que se liberan se organizan paralelamente al eje principal. Teleomorfo: Issatchenkia orientalis. Fermenta glucosa y utiliza lactato y lisina y no crece en presencia de cicloheximida 0,01%. d. Colonias que varían del color crema al lila fuerte: aquí se encuentra el resto de las especies. La micromorfología puede orientar, por ejemplo si en agar harina de maíz solamente se observan levaduras de pequeño tamaño y ausencia de seudohifas podría tratarse de C. glabrata, la asimilación de trehalosa puede confirmarlo. Saccharomyces que muestra color lila intenso, presentará ascosporas que se pueden evidenciar mediante la coloración de Kinyoun. Para la identificación definitiva de cualquiera de las levaduras de este grupo se requiere el uso de equipos comerciales como el Api o la realización de las pruebas de asimilación y fermentación ya mencionadas.

12 Siempre es aconsejable correlacionar los hallazgos de los medios cromogénicos, el aspecto macro y micromorfológico y las pruebas fisiológicas. Infecciones por Malassezia Diversas formas clínicas se relacionan con el género Malassezia como agente etiológico o asociadas a ellas: pitiriasis versicolor, dermatitis seborreica, dermatitis atópica, foliculitis y otras asociaciones con afecciones clínicas en zonas seborreicas, como por ejemplo psoriasis. El género Malassezia ha sido incluido dentro de: División Basidiomycota Clase Ustilagomycetes Orden Malasseziales Familia Malasseziaceae Género Malassezia Comprende actualmente 14 especies: Malassezia furfur (M. furfur), M. sympodialis, M. globosa, M. restricta, M. obtusa, M. slooffiae, M. pachydermatis, M. yamatoensis, M. dermatis, M. nana y M. japonica, M. caprae, M. equina y M. cuniculi. Excepto M. pachydermatis, la característica lípido-dependiente del resto de las especies de Malassezia, hace que requieran de medios de cultivos especiales para su aislamiento. Los medios con mejores rendimientos son el medio de Dixon y el medio de Leeming y Notman. Para asegurar el aislamiento de todas las especies, la temperatura de incubación ideal es 32ºC, con un rango de 31º a 35ºC, durante un tiempo promedio de 7 días. La identificación a nivel de especie se presenta en material de estudio aparte. Aún no está determinado cual es el verdaero rol patogénico de cada una de ellas ni se conoce certeramente la sensibilidad de estas especies, por esta razón el diagnóstico es mediante el examen micológico directo ya que el cultivo no se hace de rutina en laboratorios asistenciales. La tipificación sólo se practica para estudios epidemiológicos y se realiza mediante estudios de sus características morfológicas y pruebas bioquímicas, o bien, por técnicas de biología molecular. Infecciones por Scytalidium En 1970 Gentles y Evans describieron infecciones por hongos no dermatofitos que afectan pelos y uñas, pero en 1977 Campbell y Mulder informan el primer caso de infección cutánea por Scytalidium hyalinum. Este Coelomycete, parásito de suelos y plantas, se halla en lugares tropicales y subtropicales. La forma hialina se conoce como Scytalidium hyalinum y la dematiácea como Scytalidium dimidiatum. Descripto en Europa y EE UU en inmigrantes provenientes de áreas tropicales, su área endémica es Asia, Caribe, América Central, África, India. En algunas zonas del sudeste Asiático las infecciones por Scytalidium son mas frecuentes que por dermatofitos, mientras que en Trinidad y Tailandia tienen una prevalencia del 40 %. Taxonomía: Es confusa dada su naturaleza pleomofa. Los Coelomycetes (hyphomycetes) tienen en su reproducción asexuada conidios dentro de un cuerpo fructificante llamada conidiomata o picnidio. Siggler en 1997 resume la taxonomía en tres puntos:

13 1- Cambio del estado picnidial Hendersonula toruloidea a Nattrassia mangiferae. 2- Scytalidium es el estado sinamorfo (que ha perdido su capacidad de producir picnidios y se reproduce por artroconidios) de N. mangiferae. 3- Scytalidium presenta variantes morfológicas. Las variantes en cultivo, con igual clínica y morfología son: S. dimidiatum (pigmento y parásito humano y vegetal), S. hyalinum (humano), S. lignicola (vegetal), S. infestans y S. japonicum. Cultivo: No crece en medios con cicloheximida y las colonias pueden ser dos tipos: uno que es de crecimiento rápido con abundante micelio aéreo (Sudamérica) y otro que crece lento y es de menor micelio aéreo (África). Tricomicosis Es una seudomicosis producida por una bacteria llamada Corynebacterium tenuis. Esta bacteria difteroide grampositiva anteriormente se llamaba Nocardia tenuis (no es el único microorganismo involucrado en esta patología). Clase Orden Género Especie Schizomycete Corynebacteriaceae Corynebacterium Corynebacterium tenuis El cultivo es dificultoso, y se realiza en medios enriquecidos a 37 C. Su crecimiento es rápido y se obtienen colonias redondas u ovales, blanco grisáceas y brillantes. En el Gram se observan filamentos grampositivos, ramificados en T, V o Y y también formas bacilares difteroides. Son fermentadoras de dextrosa. Eritrasma El Corynebacterium minutissimum es un bacilo lipófilo, difteroide, filamentoso y grampositivo, considerado un residente habitual de la piel (regiones genitales, espacios interdigitales). Su fluorescencia es producida por una porfirina y es rojo coral o anaranjada. Clase Schizomycetes Familia Corynebacteriaceae Género Corynebacterium Especie Corynebacterium minutissimum No se precisa cultivar este microorganismo para el diagnóstico y además resulta dificultoso ya que requiere medios especiales como agar infusión cerebro corazón o medios con suero fetal bovino al 20 %.Clasificarlas es complicado porque se requieren medios especiales. La incubación es a 37 C con una mezcla de nitrógeno puro al 5 o 10 % y CO 2. Luego de dos o tres días las colonias de 2 o 3 mm son traslúcidas, convexas y no hemolíticas.