O157 COLI-Strip. USO IN VITRO Referencia: C-1011, 20 tests por estuche. I. INTRODUCCIÓN
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- Elisa Silva Cuenca
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1 O157 COLI-Strip Test Inmunocromatográfico In Vitro para la detección de E. Coli O157 en muestras fecales después de cultivo en Caldo T.S.B. + NovoBiocina USO IN VITRO Referencia: C-1011, 20 tests por estuche. I. INTRODUCCIÓN De entre todas las especies de Escherichia Coli Enterovirulentas (EEC) cuatro de ellas han sido reconocidas como causantes de Gastroenteritis en humanos: E.Coli Enterotoxigenica (ETEC), E.Coli Enteropatogénica (EPEC), E.Coli Enteroinvasiva (EIEC) y la E.Coli Enterohemorrágica (EHEC). La E.Coli O157 pertenece al grupo de las E. Coli Enterohemorrágicas (EHEC). La infección es adquirida mediante la ingestión de comida contaminada por esta bacteria, también puede estar asociada al consumo de carne poco cocinada, agua, leche cruda, productos no pasteurizados, lechugas, patatas, yogures, etc. Como síntomas aparecen retortijones abdominales y diarreas líquidas que pueden progresar a diarreas difíciles (colitis hemorrágicas), fiebre y vómitos que también pueden aparecer en pacientes recuperados al cabo de los 10 días. Son particularmente de riesgo los niños menores de 5 años, ancianos y gente con sistemas inmunológicos deprimidos. Del 2-10 % de estos casos pueden sufrir complicaciones serias dando lugar al Síndrome Hemolítico Urémico (HUS), de estos un 3-5 % pueden causar la muerte. A menudo, esta enfermedad se identifica mal y su diagnóstico se lleva a cabo mediante métodos caros. No existen evidencias claras de que el tratamiento con antibióticos pueda mejorar el curso de la enfermedad, pero sí se ha mostrado que algunos tratamientos con determinados antibióticos pueden precipitar complicaciones en los riñones. Agentes anti-diarréicos también deberían ser evitados. Es muy importante beber mucho líquido para prevenir la deshidratación. En Estados Unidos aproximadamente entre y personas son afectadas por esta bacteria, de las cuales 500 terminan muriendo. II. PRINCIPIO DEL TEST Se trata de un test listo para su uso basado en el empleo de un sistema inmunocromatográfico homogéneo con oro coloidal. La muestra es diluida en una solución tamponada suministrada en el kit. Una membrana de nitrocelulosa es sensibilizada con anticuerpos frente E coli O157. La especificidad de la prueba es asegurada por el empleo de anticuerpos monoclonales específicos a E.Coli O157 LPS y polisacáridos de O a partes iguales conjugados en oro coloidal. Este conjugado soluble es desecado sobre una hoja de cristal de borosilicato.
2 Cuando la tira es introducida en la suspensión de la muestra, el conjugado solubilizado y la muestra migran por difusión pasiva entrando en contacto con los anticuerpos Anti-E.coliO157 adsorbidos en la nitrocelulosa. Si la muestra contiene E.Coli O157, el conjugado soluble de la muestra se unirá a los anti- EcoliO157 formando un complejo Ag-Ac originando la formación de una línea rojiza visible al cabo de los 10 primeros minutos. La solución continua avanzando hasta encontrar un segundo reactivo que producirá una segunda línea rojiza. Este test es indicado para la detección de E.coliO157 en muestras fecales después de un enriquecimiento durante mínimo 8 horas en caldo TSB + Novobiocina. III. REACTIVOS Y MATERIALES Cada estuche contiene: 20 TIRAS O157 Coli-strip, cada tira contiene anticuerpos monoclonales de ratón anti EcoliO157. Estos Ac son específicos frente al LPS del Ecoli O157 y frente al O. También contiene un anticuerpo monoclonal específico para un reactivo de control. Estos reactivos son purificados mediante la proteína A y adsorbidos a la membrana de nitrocelulosa. El anti-ecolio157 conjugado es producido empleando anticuerpos contra LPS y O y ligado a partículas de oro coloidal tras una purificación sobre cromatografía de afinidad de la proteína A. Las tiras se encuentran en un tubo con un desecante. Tampón de dilución o Buffer (frasco gotero de 15 ml) Solución salina tamponada con un ph 7.5 que contiene NaN3 (>0,1%), un detergente y compuestos proteínicos. Instrucciones de uso (1) MATERIAL NECESARIO NO PROVISTO EN EL KIT Caldo de cultivo TSB más NovoBiocina Tubos de ensayo de 3 ml Material para la toma de muestras IV. PRECAUCIONES PARTICULARES Todas las manipulaciones ligadas al uso de este test deberán de ser realizadas de acuerdo con las Buenas Prácticas de Laboratorio (Good Laboratory Practices o GLP). Test destinado para uso In Vitro exclusivamente. Evitar de tocar directamente con los dedos las tiras de nitrocelulosa. Emplear guantes durante la manipulación de las muestras. Desechar todo el material utilizados durante la prueba de acuerdo con las GLP.
3 Nunca utilizar reactivos procedentes de otros estuches. El frasco conteniendo las tiras sensibilizadas deberá de cerrarse tan pronto se hayan obtenido el número necesario de tiras a utilizar en ese momento. Dado que estas tiras son sensibles a la humedad, asegurarse que el sobre conteniendo el desecante se encuentra en el interior. Dos líneas verdes indican el lugar de absorción de los anticuerpos. Estas desaparecerán durante el transcurso del test. Los resultados no serán garantizados después de la fecha de expiración o cuando las tiras sean conservadas en condiciones inadecuadas. Conservar las tiras O157 Coli-Strip en ambiente lo más seco posible. No emplear soluciones de dilución contaminadas por bacterias u hongos. Las muestras deben ser obtenidas y manipuladas de acuerdo con las GLP. V. CONSERVACIÓN El kit O157 Coli-Strip cuando no ha sido abierto, almacenado entre 4-37ºC, tiene una estabilidad hasta la fecha indicada en la etiqueta. Las tiras y la solución buffer suministrados en el kit O157 Coli-Strip tienen una vida media de 12 meses antes de ser abiertos y conservados a 4-37ºC. Una vez abierto el envase, las tiras tienen una estabilidad de al menos 15 semanas cuando son conservados entre 4-37ºC en ambiente libre de humedad. El kit O157 Coli- Strip no debe ser congelado. Los estudios de conservación a largo plazo están llevándose a cabo. Los resultados intermediarios pueden ser suministrados. VI. TOMA DE MUESTRAS Las muestras fecales deberán ser testadas lo más pronto posible. Si fuera necesario, podrán ser almacenadas a 2-8ºC durante 24 horas o a -20ºC para periodos de tiempo más largos. Cultivo de la muestra: Preparar una dilución al 5-10 % de muestra fecal en suero fisiológico al 0.9% NaCl. Añadir 1 ml de esta suspensión en 10 ml de Caldo TSB + Novobiocina (20 mg/l). Incubar durante mínimo 8 horas a 37 o 42ºC. VII. MODO OPERATIVO 1. Dejar que el frasco conteniendo las tiras alcance la temperatura ambiente. Abrir el frasco y sacar la cantidad de tiras O157 Coli-Strip requeridas (una por test). Etiquetar cada tubo / test a utilizar.
4 2. Añadir 0.25 ml (u 8 gotas) de tampón de dilución (Buffer) en cada tubo/test y la misma cantidad (0.25 ml) del cultivo realizado en caldo de TSB + Novobiocina, agitar en vortex para su homogeneización. 3. Sumergir la tira O157 Coli-Strip en la suspensión en el sentido de la flecha (detrás de la tira) y esperar 15 minutos antes de proceder a leer los resultados. Nunca leer los resultados después de 20 minutos. Muestras muy positivas pueden ser detectadas al cabo de los 5 minutos. No sumergir la varilla más allá de la línea malva (situada detrás de la tira, debajo de la flecha del mismo color) para evitar la dilución del combinado de oro coloidal con la muestra. VIII. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS Los resultados deben interpretarse de la manera siguiente: 1 raya = Negativo 2 rayas = Positivo 0 raya = Inválido* * La ausencia de la línea de control (línea superior) invalida el resultado. En este caso, la muestra debe ser probada de nuevo. Para almacenar los resultados, deje secar la tira después de quitar el material absorbente en su base. Una vez seca la tira, puede aparecer una sombra muy leve alrededor de la línea TEST. IX. CONTROL DE CALIDAD De acuerdo con las GLP recomendamos comprobar el buen funcionamiento del test con regularidad. A tal efecto esta disponible de forma opcional (fuera del kit) un control positivo de Coli O157. X. PERFORMANCES: A)Límites de Detección: El límite de detección del O157 Coli-Strip corresponde al umbral de dilución por debajo del cual la bacteria E.Coli O157 ya no se detecta. Este límite ha sido establecido gracias a una cultura positiva cuantificada de bacterias E.Coli O157. Para determinar la cantidad mínima de bacterias detectable esta cultura ha sido testada en dilución sucesiva hasta una eficacia con ³ CFU*/ml con el O157 Coli-Strip. El limite de detección es de +/- 5 x 10 4 CFU/ml (colonias formadas por unidad y por ml) después de 8 h de cultivo en TSB + Novobiocina.
5 B) Interferencias: Se realizaron pruebas de reactividad cruzada con los siguientes patógenos purificados, los resultados siempre fueron negativos: Acinetobacter lwoffi, Enrerobacter cloacae, Klesiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Samonella typhimurium, Serratia marcescens, Shigella flexneri, Stenotrophomonas maltophilia, Yersinia enterocolitica (serotype 03), Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Helicobacter pylor, Yersinia enterecolitica 01, Yersinia enterocolitica 09, Escherichia hermanii, E. coli O157:H7, E. coli O55 :H7, E. coli O7 :H1, E. coli O116 :H-, Rotavirus, Adenovirus, Adenovirus 40-41, Cryptosporidium parvum, E. coli K99, Giardia, Salmonella enteritidis, Aeromonas hydrophila. Se realizaron pruebas de reactividad cruzada con los siguientes patógenos purificados, los resultados fueron positivos: E. coli broth, E. coli O157 VT neg (EH431), E. coli O157 VT neg (EH546), E. coli: H19, Staphylococcus aureus. Nota: la reactividad cruzada con el Staphylococcus aureus es debida a la proteína A que liga los fragmentos FC. Resultados positivos fueron observados con concentraciones de Staphylococcus aureus cercanas a 108 cfu/ml. XI. LIMITACIONES DEL TEST Los resultados obtenidos a través del O157 coli-strip deberá de compararse con todos los datos clínicos y biológicos disponibles. Un resultado positivo en este test no excluye la posibilidad de que otros patógenos estén presentes. O157 Coli-Strip es un test de screening para detección de E.coliO157 en su fase aguda. Muestras fecales obtenidas después de esta fase pueden contener titulaciones de antígenos inferiores al umbral de sensibilidad de detección. Si una muestra da un resultado negativo pero se observan síntomas, el resultado debe ser confirmado llevando a cabo una cultura celular. Última puesta al día: Julio 2004 NOT-5411/00 Rev: 01 Fo Fabricante: Coris BioConcept
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