Universidad de Colima

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1 Universidad de Colima MAESTRÍA EN CIENCIAS FISIOLÓGICAS CON ESPECIALIDAD EN FISIOLÓGIA HOMEOSTASIS IÓNICA EN EL PROCESO DE MUERTE CELULAR PROGRAMADA TESIS Que para obtener el grado de Maestro en Ciencias Fisiológicas con Especialidad en Fisiología PRESENTA Q.F.B. Elva Yesenia Luna Martínez ASESOR Dra. Oxana Dobrovinskaia COASESOR Dr. Igor Pottosin Colima, Col., febrero del 2003.

2 Este trabajo fue realizado en el laboratorio de Inmunología del Centro Universitario de Investigaciones Biomédicas (CUIB) de la Universidad de Colima. Agradezco el apoyo recibido por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) para llevar a cabo el posgrado de la maestría en Ciencias Fisiológicas con Especialidad en Fisiología.

3 AGRADECIMIENTOS A mi familia por su apoyo incondicional que me ha brindado siempre. A mis asesores la Dra. Oxana Dobrovinskaia y al Dr. Igor Pottosin por los conocimientos y tiempo compartido durante la realización de este proyecto. A CONACYT por su apoyo económico para la realización de la maestría. A Juan Manuel Viveros Paredes por su cariño y comprensión. A mis amigos Angeles, Víctor y Leonardo por convivir y compartir conocimientos durante el tiempo que me llevo realizar mis estudios.

4 ÍNDICE Tablas y figuras Resumen Abstract Introducción Objetivos Capitulo I. Homeostasis iónica en la fisiología normal de las células linfoides. I.1.- Iones monovalentes en la fisiología celular I.2.- El papel del calcio en la fisiología de las células linfoides Compartamentalización de Ca 2+ en linfocitos y mecanismos del mantenimiento de Ca 2+ intracelular El calcio como un mensajero secundario Oscilaciones de calcio: un mecanismo para especificar las señales I.3.- Regulación de volumen celular Iones que mantienen el volumen celular en un estado estable Osmolitos Mecanismo de regulación que incrementa el volumen celular (RVI ) Mecanismo de regulación que disminuye el volumen celular (RVD) Capitulo II. Muerte celular programada (apoptosis) y su impacto fisiológico. II.1.- La apoptosis como un proceso fisiológico II.2.- Fases de apoptosis II.3.- Estímulos apoptóticos II.4.- Cascada de caspasas en el desarrollo de apoptosis II.5.- El Papel de la mitocondria en la apoptosis II.6.- La señal de calcio en el proceso de la muerte celular apoptótica Activación de enzimas dependientes de calcio El control de apoptosis dependiente de calcio II.7.- Los mecanismos de apoptosis en las células linfoides

5 II.8.-Decremento del volumen durante apoptosis (AVD, apoptotic volume decrease) Capitulo III. Impacto de la homeostasis de iones monovalentes en el desarrollo de la apoptosis. III.1.- Dinámica de potasio durante la muerte celular apoptótica La cinética de K + intracelular en los diferentes eventos durante la apoptosis Activación de caspasas y endonuclesas dependientes de potasio El Control de apoptosis dependiente de potasio III.2.- Cambios en la actividad de canales iónicos durante la apoptosis Discusiones Conclusiones Perspectivas Referencias

6 TABLAS Y FIGURAS Figura 1. Distribución de iones monovalentes Figura 2. Vías de señalización y regularización de Ca 2+ en célula B Figura 3. Ciclo de Ca 2+ en mitocondria energizada Figura 4. Mecanismos de regulación del volumen en célula de mamífero Figura 5. Regulación del volumen en linfocitos en respuestas a estrés hipotónico. 24 Figura 6. Fases de Apoptosis y cascada de activación de caspasas Figura 7. Mecanismos moleculares de la regulación mitocondrial durante apoptosis.. 34 Figura 8. Las vías de acción de calcio de apoptosis Figura 9. Vías de Señalización de apoptosis del receptor CD Figura 10. Disminución del volumen apoptótico y posible enlace a apoptosis Figura 11. La salida de K + celular en células apoptóticas es simultaneo con otros eventos Figura 12. Análisis del encogimiento celular durante apoptosis Figura 13. Relación de la perdida de volumen celular y salida de K + en células Jurkat tratadas con anti-fas Figura 14. Relación del contenido de DNA y concentración de K + en linfocitos Jurkat tratadas con el anticuerpo anti-fas Figura 15. La actividad de caspasas y nucleasas es restringida en células con bajo K + intracelular Figura 16. Relación de la salida de K +, actividad de caspasas y endonucleasas en apoptósis Figura 17. Efecto de K + en la actividad de caspasa-3 y activación de pro-caspasa-3 por datp y citocromo c Figura 18. Diferentes concentraciones de K + extracelular inhiben el proceso de apoptosis Figura 19. Activación del canal ORCC en apoptosis inducida por el receptor CD Figura 20. Inhibición de la muerte celular y cambios bioquímicos en células linfoides tratadas con STS y TNF/CHX y bloqueadores de canales de K + y Cl

7 Figura 21. Activación del canal K + sensible a 4-Aminopiridina por radiación UV Figura 22. Inhibición del canal Kv1.3 en células Jurkat por estimulación del receptor CD Figura 23. Actividad del canal de K + (Kv1.3) en células Jurkat tratadas con actinomicina D Figura 24. Análisis Western blot de las subunidades y de la ATPasa Na + -K + en apoptosis Figura 25. Esquema propuesto que muestra el papel de K + en apoptosis Figura 26. Diagrama esquemático que muestra el mecanismo propuesto que media la AVD y la apoptosis del receptor CD95 en células Jurkat Figura 27. Vías de señalización y mecanismos de transporte durante la apoptosis del receptor CD Figura 28. Regulación de volumen en linfocitos en respuesta a estrés hipotónico.. 62 Figura 29. Regulación de los mecanismos de transporte bajo apoptosis inducida por CD Tabla 1. Canales iónicos en linfocitos Tabla 2. Inductores de apoptosis Tabla 3. Inhibidores de apoptosis Tabla 4. Miembros de la familia de las caspasas Tabla 5. Proteínas que son procesadas por caspasas miembros de familia de las caspasas durante la muerte celular Tabla 6. Correlación de los eventos durante la RVD y AVD en linfocitos Tabla 7. Eventos durante el proceso de apoptosis en diferentes células

8 RESUMEN La pérdida de volumen celular, es una de las características más generales del proceso de apoptosis, ya que se presenta en los diferentes estímulos apoptóticos que actúan a través de las distintas vías de señalización apoptóticas. Durante la disminución del volumen apoptótico (AVD) se ha reportado una pérdida de iones K +, dando como resultado una alteración en la homeostasis iónica. Con la finalidad de determinar los mecanismos que llevan a la AVD, se analizaron la homeostasis iónica y los mecanismos moleculares que ocurren durante el proceso de apoptosis en linfocitos. Encontramos que a concentraciones fisiológicas de K + intracelular y el bloqueo de canales de Cl - o de K + inhiben el encogimiento celular apoptótico suprimiendo la muerte celular programada. Así como también, la AVD es un promotor de apoptosis acoplado a la pérdida de K + intracelular que participa en la activación de caspasas y nucleasas. Finalmente, las vías de desarrollo de apoptosis están conectadas a la AVD por medio de cascadas de señalización que activan algunos mecanismos de transporte empleados en la regulación de volumen celular normal. 3

9 Abstract Cell shrinkage is a hallmark of apoptosis. It takes place independent on apoptotic stimuli and signal transduction pathways involved. Apoptotic volume decrease (AVD) is known to be accompanied by an efflux of intracellular K +, resulting in ion homeostasis changes. Analysis of ion homeostasis and molecular mechanisms, occurring in lymphocytes undergoing apoptosis, was undertaken to reveal the pathways leading to AVD. It appears that physiological concentrations of intracellular K + as well as blockage of Cl - and K + ion channels prevent apoptotic cell shrinkage and program cell death. AVD was concluded to promote apoptosis process being coupled to K + efflux, which in turn affects the activation of caspases and nucleases. Finally, the apoptotic pathways were shown to be linked to AVD by means of signal cascades and include some parts of regulatory volume decrease mechanisms. 4

10 INTRODUCCIÓN La apoptosis o muerte celular programada es un proceso que ocurre en los tejidos en condiciones fisiológicas normales, el cual es disparado por una variedad de estímulos apoptóticos que activan diferentes vías de señalización apoptótica, y es esencial en el desarrollo y homeostasis del sistema inmune. En respuesta a una infección se requiere de un incremento en el número de linfocitos y subsecuentemente su eliminación por apoptosis después de la recuperación. Este tipo de muerte, siempre es acompañado por encogimiento celular siendo uno de los mecanismos que previene la liberación del contenido celular sin afectar otras células ni provocar inflamación. El encogimiento celular apoptótico precede a otros procesos de apoptosis tales como la liberación de citocromo c, activación de caspasas y fragmentación de DNA (Gómez-Angelats et al. 2000; Maeno et al. 2000). Durante la AVD ocurre una pérdida de K + intracelular (Bortner et al. 1997). Recientemente se ha demostrado que la pérdida de iones monovalentes juega un papel primordial en apoptosis, es por eso, que manteniendo las concentraciones fisiológicas de éstos iones se puede inhibir la activación de caspasas y nucleasas, así como también, la muerte celular programada (Thompson et al. 2001). Existe la posibilidad de que la AVD utilice mecanismos similares que son empleados en la regulación que disminuye el volumen celular (RVD) en respuesta a un choque hipoosmótico (Gómez-Angelats et al. 2000). La RVD involucra la salida de K +, Cl - y osmolitos orgánicos (Lang et al. 1998a; 1998b), al igual que en la AVD se ha demostrado la pérdida de K +, Cl - y osmolitos orgánicos (Maeno et al. 2000). En linfocitos T Jurkat Szabo y col. (1996 y 1998) han reportado la inhibición de canales de potasio tipo-n dependientes de voltaje (Kv1.3) y la activación de un canal de cloro rectificante saliente (ORCC) por la estimulación del receptor APO-1/Fas(CD95). Mientras que en otros tipos celulares se ha mostrado la activación de canales de Cl - y K + con distintos estímulos apoptóticos (Wang et al. 1999; Nietsch et al. 2000). 5

11 Cambios en las concentraciones iónicas intracelulares acompañan la AVD modulando la actividad de caspasas y nucleasas, regulando así la progresión de apoptosis (Hughes et al. 1997), lo que sugiere que el papel que juegan los iones es más extenso que simplemente facilitar la pérdida del volumen celular. Por lo tanto, el propósito de este trabajo monográfico es analizar los mecanismos responsables del encogimiento celular apoptótico y su asociación con otros eventos durante el proceso de muerte celular programada en linfocitos. Para llevar a cabo ésta investigación nos hemos propuesto algunos objetivos que son los siguientes: OBJETIVO GENERAL: Analizar la homeostasis iónica y mecanismos moleculares que llevan a la disminución del volumen apoptótico en linfocitos durante el proceso de muerte celular programada. OBJETIVOS PARTICULARES: Determinar si la disminución del volumen apoptótico es una característica secundaria o es un promotor del proceso de apoptosis. Analizar la cinética de la pérdida de potasio y disminución de volumen en células apoptóticas, relacionando otros eventos característicos de este proceso. Examinar si la pérdida de potasio es característica secundaria o es necesaria para la activación y progresión de apoptosis. Revisar si las vías de muerte celular apoptótica están acopladas a la activación del encogimiento celular. Analizar si los mecanismos de regulación de volumen celular normal son empleados en el encogimiento celular apoptótico o la célula posee mecanismos especiales que llevan a la disminución del volumen apoptótico. 6

12 CAPITULO I. HOMEOSTASIS IÓNICA EN LA FISIOLOGÍA NORMAL DE LAS CÉLULAS LINFOIDES. I.1.- Iones monovalentes en la fisiología celular.- I.1.1. Gradientes de iones monovalentes a través de la membrana plasmática. Las células animales mantienen concentraciones asimétricas de iones a través de la membrana plasmática, en la Figura 1 se muestra la distribución de iones monovalentes entre el lado extracelular e intracelular de la membrana. Figura 1. Distribución de iones monovalentes. La concentración de iones monovalentes en el lado interno (5-15mM de Na +, 140mM de K +, 5-15mM de Cl - ) y externo (145mM de Na +, 5mM de K +, 110mM de Cl - ) de la membrana plasmática de una célula de mamífero (a). En (b) se esquematiza los movimientos de iones monovalentes a través de la membrana plasmática. La ATPasa Na + -K + transporta 3Na + hacia fuera y 2K + hacia dentro de la célula, por hidrólisis de trifosfato de adenosina (ATP). La difusión de Na +, K + y Cl - a través de canales transmembranales sigue sus gradientes electroquímicos. Em, potencial de membrana ( -70 mv). 7

13 a) ATPasa Na + -K +. La generación y mantenimiento de los gradientes transmembranales de concentración de Na + y K + se debe a la actividad de la ATPasa Na + -K +, la cual es una proteína tetramérica integral de la membrana plasmática compuesta por dos subunidades grandes transmembranales y dos subunidades pequeñas. La subunidad contiene el sitio de unión para ATP y tres sitios para Na + en la superficie citoplasmática, y dos sitios de unión para K + en la superficie externa. Es reversiblemente fosforilada y desfosforilada durante el bombeo (Lingrel and Kutzweiler, 1994). Para transportar Na + y K + a través de la membrana plasmática utiliza la energía metabólica obtenida al catalizar el ATP en difosfato de adenosina (ADP) y fosfato inorgánico, así por cada molécula de ATP hidrolizada bombea 3Na + hacia el exterior y 2K + al interior de la célula (100 moléculas de ATP pueden ser hidrolizadas por cada molécula de ATPasa cada segundo), (Glynn, 1993). Una tercera parte de la energía de una célula animal es consumida por ésta bomba. La ATPasa es estimulada por el incremento de la concentración intracelular de Na + y es inhibida por hiperpolarización y ouabaina un inhibidor específico que compite con K + por el mismo sitio de unión en el lado externo de la ATPasa (Bortner et al., 2001). b) Canales de K + y generación de potencial de membrana. El K + es importante en procesos celulares, tales como el crecimiento celular normal, la división celular, la síntesis de las proteínas y del ADN, la regulación del volumen celular y en el estado ácido-base intracelular requieren de una concentración elevada de K + intracelular (De la Torre et al., 2002), así como también enzimas que son activadas por bajo nivel de K + como caspasas y nucleasas durante el proceso de apoptosis (Gómez-Angelats et al., 2000). El gradiente electroquímico de K + conduce iones K + hacia fuera de la célula, guiando a un exceso de carga positiva en el lado extracelular creando una diferencia de potencial eléctrico ( ) con el lado interno negativo a través de la membrana 8

14 celular. El potencial de membrana celular conduce la salida de aniones tal como el Cl -. Por tanto, el potencial de membrana esta determinado por la combinación interactiva de la ATPasa Na + -K + y los canales de K +. Los canales de K + en los linfocitos juegan un papel importante en el desarrollo y mantenimiento de sus funciones, incluyendo regulación del volumen celular, y señalización de Ca 2+ (ver revisión Cahalan et al., 2001). En linfocitos y timocitos se puede encontrar tres tipos de canales dependientes de voltaje (Kv): n (normal), n (casi normal) y l (de gran conductancia y con distinto umbral de la activación), siendo el más importante el canal Kv tipo n por que su conductancia iónica predomina en los linfocitos en reposo (Tabla 1). Los canales Kv tipo n se inactivan y se recuperan de la inactivación lentamente, los de tipo l se reactivan rápidamente y los de tipo n no presentan inactivación (Lewis and Cahalan, 1988). Los canales Kv contribuyen en el mantenimiento del potencial de membrana en reposo (-50 a -60 mv) de linfocitos T humanos (ver Cahalan et al., 2001; Verheugen et al., 1995). Los linfocitos T periféricos de ratón carecen de una tercera parte de canales K V, sin embargo el potencial de la membrana se mantiene en el rango de -60 a -70mV debido a la actividad de la ATPasa Na + -K +. Entonces, durante la diferenciación de linfocitos T de ratón el mecanismo predominante de la generación del potencial de membrana se cambia de la electrodifusión (dentro de timo, a través de canales de K + ) a electrogénico (células T periféricos, vía ATPasa Na + -K + ) y regresa a la electrodifusión en linfocitos periféricos activados (Ishida and Chused, 1993). El otro grupo de canales de K + son los activados por Ca 2+ (KCa): de conductancia intermedia (IKCa ) y pequeña (SKCa), ambos son activados por Ca 2+ a un nivel submicromolar (400 nm y están cerrados a 100 nm Ca 2+ ), tienen diferente sensibilidad farmacológica y se expresan diferencialmente en varios tipos de células linfoides (Tabla 1). Normalmente, el número de canales IKCa por célula T humana son 20 comparado a cientos de canales Kv ( /célula), incrementando los canales IKCa después de la activación mitogena a 500/célula (Grissmer et al., 1993). En cambio timocitos humanos y murinos en reposo expresan un número mayor de canales KCa ( /célula), y también presentan un pequeño incremento durante la activación (DeCoursey et al., 1984; Lewis and Cahalan, 1988). 9

15 Los canales KCa participan en la regulación del potencial (hiperpolarización) durante la entrada de Ca 2+ y oscilaciones de Ca 2+ inducida por mitógenos (Grissmer et al., 1992). Estos canales están activados a potenciales hasta -100 mv cuando los Kv permanecen cerrados (DeCoursey et al., 1984). c) Sistemas de transporte acoplados a Na +. El flujo de sodio dentro de la célula es conducido por su gradiente electroquímico. Este flujo puede ser acoplado a procesos de transporte de compuestos de moléculas impermeables a través de la membrana plasmática como glucosa, aminoácidos y otros nutrientes dentro de la célula. El transportador Na + /glucosa importa una glucosa y dos iones Na + hacia dentro de la célula, así como el intercambiador Na + /Ca 2+ que transporta tres iones Na + bajo su gradiente electroquímico y exporta Ca 2+ contra su gradiente electroquímico (Lodish et al., 1999). El gradiente de sodio es responsable de la osmolaridad de los líquidos extracelulares y el mantenimiento del volumen celular (De la Torre et al., 2002). d) Canales de Cl -. Los canales de cloro juegan un papel importante en la regulación del volumen celular, estos son necesarios para regular el encogimiento o hinchamiento celular acompañados por la entrada de Na + o salida de K + respectivamente, para mantener la electroneutralidad (Lang et al., 2000b). En linfocitos T Jurkat se ha identificado un canal de Cl - con rectificación hacia fuera activado por hinchamiento osmótico (Cl - Swell- Swelling-activated Cl - channel, Tabla 1), el cual participa en el mecanismo de regulación de volumen en linfocitos expuestos a condiciones hipoosmóticas (Lewis et al., 1993). La tirosina cinasa P56 Ick activa un canal de Cl - (ORCC- Outwardly rectifying chloride channel, Tabla 1) en linfocitos Jurkat, así como también durante el proceso de apoptosis inducida por el receptor CD95 (Szabo et al., 1996). Éstos dos tipos de canales de Cl - son activados por la tirosina cinasa P56 Ick y bloqueados por DIDS. Entonces el hinchamiento celular y la cinasa P56 Ick parecen activar el mismo canal de Cl - en linfocitos, pero hasta el momento su estructura no es conocida. 10

16 Tabla 1. Canales iónicos en linfocitos. Grupo/tipo de Canal a De K + (Kv) tipo: n (Kv1.3) (12-18pS 2,12 ) Selectividad K + Rb + NH Activación Farmacología b Distribución Umbral de activación - 52± 8 mv 1,12 Shk-Dap, 52pM 9 CTX, 1 nm 5 KTX, 3nM 5 NTX, 1-10nM 4 Correolido, 90nM 9 Quinina, 20 M 3 4-AP, 0.15mM 3 TEA, 8-16mM 2,4 Linfocito T humano 1,5 y raton 2 Papel fisiológico Regulación del potencial de membrana y volumen celular, secreción de interleucina-2 y proliferación celular. n' (17pS 12 ) l (Kv3.1) (21-27pS 2,12 ) De K + (KCa) tipo: IKCa (11pS 4 ) SKCa (5pS 4 ) De Cl - tipo: Cl swell (25-28pS) 14 ORCC (31pS) 15 De Ca 2+ tipo: CRAC K + Rb + NH + 4 > Cs + 4 I SCN - NO - 3 Br - Cl - MeSO 3 acetato 10 Ca 2+ Ba 2+ = Sr 2+ Mn 2+ 7 Umbral de activación - 40 mv 12 Umbral de activación - 10 mv 12 K d =400nM Ca 2+ i 1, 4 K d =400nM Ca 2+ i 6 Solución hipoosmótica extracelular 10,14 Cinasa P56 ICK 14 ICK 15 Cinasa P56 Apoptosis 15 Depleción de almacén Ca 2+ (estimulación del receptor, liberación, IP 3, buffers Ca 2+ y Tapsigargina) 7 SWAC Ca Solución hipoosmótica extracelular 11 CTX, 5 nm 12 TEA, 100 mm 12 TEA, mM 2 CTX, 3-4 nm 4,5 CTX-Glu, 33nM 9 TRAM-34,20nM 8,9 TEA, 40 mm 4 Apamina 1nM 6 UCL1648, 200pM 9 DIDS, 500 M 14 SITS, 89 M 10 Herbimicina A 10 M 14 DIDS, Glibenclamida y IAA 100 M 15 Herbimicina A 10 M 15 Ca M mM de iones Cd 2+ (bloquea 90%) y Ni 2+ o Co 2+ (bloquea 50-60%) 7 La3+,58 nm 11 Gd3+,28 nm 11 Linfocito T raton 12 Lintocito T ratón 2,12 Linfocitos T y B humanos 1,4 Linfocito T Jurkat 6 Linfocitos B y T raton 10 Linfocito 10, 14 T Jurkat Linfocito T Jurkat 15 Linfocito T Jurkat 7,13 Timocitos raton 11 La3+,2.4 M 11 Timocitos Gd3+, 3.8 M 11 inmaduros de ratón 11 Regulación del potencial de mem brana y volumen celular, modulación de la señal de calcio y proliferación celular. Regulación del volumen celular y proceso de apoptosis. Señalización de Ca 2+ y activación de Célula T. Señalización de Ca 2+ en la regulación de volumen. 11

17 a CRAC (Calcium release-activated channels), canal activado por depleción de almacenes intracelulares de calcio; SWAC (Ca +2 -permeable nonselective cation channels), canal catiónico no selectivo permeable a Ca 2+. b TEA, tetraetilamonio; CTX, Carybdotoxina; 4-AP, 4-aminopiridina; NTX, Noxiustoxina; KTX, Kaliotoxina; Shk-Dap, toxina Stichodactyla helianthus-acido diaminopropionico; DIDS, diisotiocianato- 2-2 ácido stilbensulfonico; IAA, ácido indolacético. Referencias de la Tabla 1: 1. Verheugen et al., DeCoursey et al., DeCoursey et al., Grissmer et al., Rader et al., Grissmer et al., Premack et al., Wulff et al., Cahalan et al., Lewis et al., Ross and Cahalan, Lewis and Cahalan, Kerschbaum and Cahalan, Lepple-Wienhues et al., Szabo et a l., I.2.- El Papel del calcio en la fisiología de las células linfoides.- I.2.1. Compartamentalización de Ca 2+ en linfocitos y mecanismos de mantenimiento de Ca 2+ intracelular. La concentración del calcio intracelular en las células de mamífero en reposo es muy baja ( nm), mientras que la concentración extracelular (1-2 mm) y la del retículo endoplásmico (RE, 100 M, Golovina and Blaustein 1997) es alta. Por lo tanto, el gradiente de Ca 2+ tiende a conducir Ca 2+ dentro del citosol a través de los canales de la membrana plasmática y la membrana del RE. Mediciones de Ca 2+ libre en mitocondrias ( nm) han mostrado que su nivel normalmente esta más bajo que en el citosol (Bernardi, 1999a,b), lo que restringe la liberación de Ca 2+ en pocas mitocondrias con un nivel de Ca 2+ elevado. La concentración de Ca 2+ intracelular es regulada por el transporte de Ca 2+ dentro y fuera del RE, así como también a través de la membrana plasmática entre la célula y su ambiente (ver revisión de Berridge et al., 1998). Las vías de transporte de 12

18 Ca 2+ a través de la membrana plasmática es por medio de una ATPasa-Ca 2+, un intercambiador Na + /Ca 2+ y canales de Ca 2+ que contribuyen a la modulación y estabilización de la señal de Ca 2+ (Figura 2). La ATPasa-Ca 2+ tiene mayor afinidad por los iones Ca 2+ que el intercambiador Na + /Ca 2+ (Balasubramanyan et al., 1994). En linfocitos, la ATPasa de Ca 2+ de la membrana plasmática proporciona el mecanismo dominante para transportar Ca 2+ aunque el intercambiador Na + /Ca 2+ también contribuye (Donnadieu et al., 1992). El Ca 2+ entra a la célula a través de canales activados por depleción de almacenes intracelulares de Ca 2+ (CRACcalcium release-activated channels, Tabla 1), que contribuyen a un aumento en la concentración de Ca 2+ intracelular necesaria para la activación de células T y la expresión de genes (Lewis, 2001). Los canales CRAC activados por la descarga de Ca 2+ del RE interaccionan con diferentes almacenes celulares. La mitocondria mantiene la actividad de canal CRAC secuestrando el Ca 2+ cerca del canal para prevenir su inactivación por la acumulación de Ca 2+ (Hoth et al., 2000). Estos canales pueden ser inhibidos por esfingosina y ceramida a través de la estimulación de Fas en linfocitos T (Lepple- Wienhues et al.,1999). El número de canales CRAC expresados por célula T en reposo es bajo (10-15 por célula), incrementándose durante la activación de las células T a 150 canales por célula (Fomina et al., 2000). En linfocitos la señal de Ca 2+ depende principalmente de la entrada a través de canales CRAC conducida por el potencial de membrana negativo. Así como también, la apertura de canales IKCa1 por el aumento inicial de Ca 2+ citosólico y de canales Kv1.3 en respuesta a la despolarización de la membrana para proporcionar mecanismos que aumenten la entrada de iones de K + y mantener el potencial de membrana para promover la entrada de Ca 2+ en el tiempo requerido para la nueva transcripción de genes (Cahalan et al., 2001). 13

19 Figura 2. Vías de señalización y regulación de Ca 2+ en célula B. La señal de Ca 2+ inducida por el receptor antígenico de la célula B (BCR, B-cell antigen receptor) involucra la producción de inositol 1,4,5-trifosfato (IP 3 ) y la liberación de Ca 2+ de almacenes intracelulares, por la fosforilación y activación de fosfolipasa C gama (PLC- ), la cual corta a fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP 2 ) para generar IP 3 y DAG (diacilglicerol). El IP 3 libera Ca 2+ del RE por la activación de los receptores de IP 3 (IP 3 R) y de rianodina (RyR). La descarga de RE lleva a la entrada de Ca 2+ por activación de canales CRAC a través de un mecanismo no conocido indicado por la línea punteada. El mecanismo de activación del RyR1 de la célula B no es claro. El papel del IP 3 R y del canal de Ca 2+ tipo-l de la membrana plasmática no es claro, pero tienen la posibilidad de que pueden mediar la entrada de Ca 2+ indicado por líneas punteadas. El posible papel y localización del receptor NAADP (fosfato dinucleótido adenina ácido nicotínico) en la célula B es especulativo, así como también la identificación del canal de Ca 2+ tipo-l como un receptor NAADP. La Anexina V es mostrada como un posible canal de Ca 2+. La señal de Ca 2+ activa canales KCa y es sostenida por la mitocondria que toma Ca 2+ cerca de los canales CRAC para prevenir su inactivación y redistribuirlo a otro sitio en la célula. El Ca 2+ citosólico es regulado por la ATPasa-Ca 2+ de la membrana plasmática que transporta Ca 2+ fuera de la célula por hidrólisis de ATP a ADP y un intercambiador Na + / Ca 2+, así como también es transportado al RE por la ATPasa-Ca 2+. Syk y Lyn son proteínas cinasas que pueden regular la entrada de Ca 2+. (ver revisión Grafton and Thwaite, 2001). 14

20 Ca 2+ El transporte de Ca 2+ entre el RE y el citoplasma es a través de una ATPasa- (bomba SERCA) y canales sensibles a inositol 1,4,5-trifosfato (IP 3 R) y a rianodina (RyR), (Figura 2). El Ca 2+ es almacenado en el RE por la bomba SERCA que transporta Ca 2+ contra su gradiente electroquímico dentro del lumen del RE, usando la hidrólisis de ATP como fuente de energía (2 iones Ca 2+ son transportados por cada ATP hidrolizado) para la liberación de Ca 2+ inducida por IP 3 y controlar la entrada de Ca 2+ de canales CRAC (Lewis, 2001). Cuando la concentración de Ca 2+ citosólico es elevada por la liberación de almacenes intracelulares la bomba SERCA será activada (por el aumento de Ca 2+ intracelular) y los canales de liberación de Ca 2+ del RE serán cerrados, así que cuando la concentración de Ca 2+ citosólico ha disminuido al nivel en reposo la bomba SERCA es inhibida (Mogami et al., 1998). El inhibidor farmacológico específico de la bomba SERCA es la tapsigargina ( 1 M), que descarga el almacén intracelular de Ca 2+ y activa los canales CRAC en la membrana plasmática (Hoth et al., 2000). El IP 3 disparan la liberación de Ca 2+ del RE activando los IP 3 Rs. En concentraciones bajas de Ca 2+ citosolico la liberación de Ca 2+ a través de IP 3 R es acelerada, pero cuando la concentración de Ca 2+ es alta (0.3 M) es inhibida. La respuesta del IP 3 R puede ser regulada por fosforilación, varias proteínas accesorias, Ca 2+ y ATP, pero principalmente por Ca 2+ (Ehrlich et al., 1994). En linfocitos B y T existen los tres tipos de IP 3 R (IP 3 RI, IP 3 R2 y IP 3 R3), los cuales tienen diferente afinidad a IP 3 y sus propiedades de activación por Ca 2+ (Grafto and Thwaite, 2001). El IP 3 R3 es expresado en la membrana plasmática de las células B y T, su papel no es claro pero puede funcionar como mediador de la entrada de Ca 2+ como parte del canal CRAC (Figura 2). Miyakawa y col. (1999) mostró que IP 3 R3 esta involucrado en la generación de transientes de Ca 2+ monofásicos seguidos de la ligación del BCR, mientras que el IP 3 R1 y el IP 3 R2 están involucrados en la generación de oscilaciones de Ca 2+ con diferentes frecuencias. Los RyRs también regulan la liberación de Ca 2+ del RE, existen tres isoformas de RyRs de las cuales los linfocitos B y T expresan RyR1 y RyR3, respectivamente (Grafton and Thwaite, 2001). Los mecanismos que activan los RyRs en la célula B y T son diferentes. Guse y col. (1999) mostraron la liberación de Ca 2+ en célula T a 15