AVANCE. MICROALBUMINURIA Inmunoquant. Método inmunoturbidimétrico con sensibilidad exaltada por látex

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1 Publicación de contenido científico editada por GT Laboratorio S.R.L. Necochea 3274 Rosario AVANCE N 5 Mayo 212 MICROALBUMINURIA Inmunoquant Método inmunoturbidimétrico con sensibilidad exaltada por látex GT Lab ha introducido un método inmuno turbidimétrico con sensibilidad incrementada por partículas de látex que permite la determinación manual o automatizada. En efecto, la exaltación de la respuesta inducida por partículas de látex permite trabajar con una sensibilidad adecuada para discriminar entre valores bajos de concentración proteica, los que son de interés en procesos vinculados a detección temprana de afección renal y de cardiopatías, entre otras patologías. Los reactivos son presentados en forma líquida estables, los que pueden emplearse en analizadores capaces de usar dos reactivos por método.

2 INTRODUCCIÓN La microalbuminuria está definida como la tasa de excreción urinaria de albúmina en concentraciones entre 2 y 2 mg/l. Esta concentración, aun siendo superior al valor normal, no llega a ser considerada como proteinuria convencional. La microalbuminuria es un marcador de riesgo de nefropatía diabética y de anomalías cardiovasculares en pacientes con diabetes mellitas insulino dependientes o no insulino dependientes. La diabetes mellitus es la enfermedad endocrina más frecuente, es una enfermedad crónica no transmisible que debido a la transición demográfica que ocurre en el mundo, cobra cada vez mayor importancia tanto por su morbilidad y mortalidad, como por sus efectos discapacitantes que afecta la calidad de la vida de quienes la sufren, así como de sus familiares. En la región de las Américas viven unos 45 millones de diabéticos, más de la cuarta parte del total de los casos del mundo. Por otra parte, la prevalencia tiene un tendencia creciente. En la actualidad las consecuencias más importantes de la diabetes mellitus son las complicaciones vasculares y la glomeruloesclerosis, ya que después del descubrimiento de la insulina y el amplio uso de los antibióticos, disminuyó en gran medida la muerte por coma diabético e infecciones. Una de las principales complicaciones de la diabetes mellitus es la nefropatía diabética. No se conoce con exactitud su prevalencia, pero podemos señalar que de acuerdo diversos estudios realizados, fue la primera causa de Insuficiencia Renal Crónica Terminal, interviniendo en casi un tercio de los fallecidos por dicha afección renal. La nefropatía diabética es la segunda causa de muerte en los pacientes diabéticos solo precedida por las causas cardiovasculares si se tienen en cuenta todos los diabéticos, sin embargo, es la primera causa de muerte si consideramos solo aquellos diabéticos que debutan en las tres primeras décadas de la vida. Algunos investigadores han reportado que aproximadamente el 5% de los pacientes diabéticos insulino dependientes desarrollan una IRC en algún momento de su evolución. La insuficiencia renal crónica (IRC) se ha convertido en un problema importante de salud. Se observa con alarma el incremento mantenido en los últimos años tanto de la incidencia como de la prevalencia de esta entidad. Este incremento se debe fundamentalmente a un elevado número de pacientes diabéticos que desarrollan la IRC por vía de la nefropatía diabética, constituyendo la primera causa de Insuficiencia Renal Crónica Terminal en los programas de diálisis en la mayoría de los países desarrollados influenciado además por el factor envejecimiento de la población, por ejemplo en Estados Unidos es el 43.4% de los nuevos pacientes que ingresan a este programa, por lo que constituye un problema económico, social, ético y político. Son múltiples los factores de riesgo que predisponen a la aparición o agravamiento de la nefropatía; dentro de los más destacados se encuentran al sobrepeso, sedentarismo, tabaquismo, dietas inadecuadas con exceso de proteínas, grasa y sal, 2 la presencia de dislipidemias, deshidratación, infecciones, el uso de tóxicos renales en forma de medicamentos o contraste radiológicos por solo citar los más frecuentes. La evolución clínica de la nefropatía diabética, está muy bien caracterizada en el paciente con diabetes mellitus insulino dependiente, en la que se describen cinco estadios que denotan cambios estructurales y funcionales en el riñón (clasificación de Mogensen), en el primero de los cuales puede aparecer pequeñas cantidades de albúmina en orina (microalbuminuria) en el rango entre 3 y 3 mg en 24 horas, la que desaparece al conseguir el control metabólico. Esta dura aproximadamente 2 años. De allí la importancia de la determinación. Recientemente también se observó que la microalbuminuria está asociada a enfermedades cardiovasculares en poblaciones normales no diabéticas. PRINCIPIO La microalbuminuria reacciona con anticuerpos anti-albúmina adheridos a partículas de látex, provocando una turbidez que es proporcional a su concentración, la que puede cuantificarse fotométricamente.) REACTIVOS PROVISTOS R1: solución lista para usar. R2: solución lista para usar. Calibrador Microalbuminuria: solución lista para usar COMPOSICIÓN DE LOS REACTIVOS PROVISTOS R1: buffer glicina 1 mmol/l, ph= 1. R2: partículas de látex recubiertas con anticuerpos anti albúmina, ph = 8.2. Calibrador: solución con concentración conocida de albúmina. Su concentración varía de lote a lote y está declarada en el rótulo. MUESTRA Orina de 24 horas, ocasional o primera micción matinal. Centrifugue antes de ensayar. Aditivos Se recomienda ajustar el ph a 7 con hidróxido de sódio o ácido clorhídrico 1 mol / l. Adicione azida de sódio 1 g/l para evitar contaminación. CONDICIONES DE CONSERVACIÓN DE LAS MUESTRAS Conservación: Refrigerador (2-8º C). estable 7 días. Estabilidad: estable 3 meses. Interferentes Las muestras deben ser centrifugadas antes de ensayar. Para obtener información completa sobre factores analíticos y fisiológicos que interfieren en el método, se recomienda la lectura del trabajo de D.S. Young (véase Referencias Bibliográficas).

3 PROCEDIMIENTO Condiciones de reacción: Longitud de onda: 54 nm (53-55 nm); ajuste a. D.O. con agua destilada. Temperatura: 37ºC PREVIAMENTE, ATEMPERE LOS REACTIVOS. Homogeneice antes de pipetear. En cubetas de lectura marcadas C (Calibrador) y M (Muestra) agregue R1 8µl 8µl R2 2µl 2µl Calibrador 1µl ---- Muestra µl Mezcle y lea inmediatamente la absorbancia A1 y la A2 exactamente a los 2 minutos de mezclar. NOTAS 1. Los volúmenes de muestra y Reactivo pueden disminuir o aumentar manteniendo las proporciones esta blecidas en Procedimiento. Están disponibles adaptaciones para diferentes analizadores automáticos. 2. Para evitar subestimar valores se recomienda procesar simultáneamente la muestra sin diluir y diluida alo 1/3 en solución fisiológica. CÁLCULOS Calcule A = A2-A1 para las cubetas C y M. (A2-A1) de M Microalbuminuria mg/l = x Concentración de Calibrador (A2-A1) de C C M d- Efecto prozona: No se observa hasta valores de 3 mg/l. e- Reproducibilidad: Se procesaron pooles de muestras de personas caucásicas, adultas, sin antecedentes de patologías y sin medicación para el caso del nivel normal, y sin otras patologías asociadas. Las muestras se conservaron congeladas a -2ºC durante todo el tiempo entre ensayos. Los resultados obtenidos dentro del mismo ensayo y en ensayos diferentes se muestran en las TABLA II y TABLA III. f- Especificidad: El factor reumatoide puede provocar interferencias a valores superiores a 3 UI/ml. Se recomienda consultar los trabajos de Young, que describen distintos tipos de interferencias fisiológicas (ver D. Young, en Referencias Bibliográficas). Los resultados de experimentos realizados con potenciales interferentes se muestran en la TABLA IV. g- Inexactitud e Imprecisión: El tratamiento estadístico de la inexactitud e imprecisión están desarrollados más arriba en Comparación con otros métodos y en Reproducibilidad. Resultados incorrectos pueden obtenerse si no se respetan estrictamente las indicaciones dadas en el Manual de Instrucciones sobre Procedimientos de Uso, Calidad de la Muestra, uso de anticoagulante, etc. h- Recuperación: La recuperación obtenida por agregado de cantidades conocidas de albúmina a muestras biológicas estuvo entre el 96,2 y el 11,2%, dentro del rango establecido en c-. SUSTANCIAS DE REFERENCIA Y /O PATRO- NES EMPLEADOS El Calibrador ha sido referenciado al siguiente patrón: Control Reference Material CRM 47/RPPHS (Institute for Reference Materials and Measurements, IRMM). EVALUACIÓN DE DESEMPEÑO DEL MÉTODO a- Comparación con otros métodos: En el desarrollo del producto se efectuaron comparaciones de muestras contra reactivos comerciales, uno de origen europeo aprobado por la Administración Nacional de Medicamentos, Alimentos y Tecnología Médica de Argentina (ANMAT) y otro de origen brasileño aprobado también por la Agência Nacional de Vigilância Sanitária de Brasil (ANVISA), tomados como referencia. Los resultados están mostrados en la TABLA I y graficados en los GRAFICO 1 y GRAFICO 2. b- Sensibilidad: La sensibilidad en espectrofotómetro a 54 nm, leyendo en cubetas de caras paralelas con un paso de luz de 1 cm, es aproximadamente 3 mg/l. c- Linealidad: La reacción cumple con la ley de Lambert & Beer hasta 1 mg/l. Para valores superiores, diluya la muestra en solución fisiológica antes de ensayar; el resultado obtenido deberá multiplicarse por la dilución efectuada. 3 CONTROL DE CALIDAD Se recomienda procesar juntamente con las muestras, sueros control normal y anormal para controlar el desempeño del ensayo. Se aconseja el uso de Qualiset Sueros Control Nivel 1 y 2 GT Lab (Códigos 6215 y 6225) Cada Laboratorio debe diseñar su propio sistema de Control de Calidad Interno y establecer las medidas correctivas si se superan los límites de tolerancia aceptables. USO EN AUTOMATIZACIÓN La TABLA V indica los parámetros a usar en la aplicación de la técnica a instrumentos automatizados. Están disponibles adaptaciones para diferentes auto analizadores. Solicítelos a infoprofesional@gtlab.com.ar. VALORES DE REFERENCIA Hasta 3 mg/24 horas y hasta 2 mg/l en la primera orina matinal. Es recomendable que cada laboratorio establezca sus propios valores normales.

4 Cada laboratorio debe determinar su propio rango de acuerdo a la población involucrada. TABLA I Comparación con métodos tomados como referencia (resultados expresados en mg/l) Reactivo Origen Brasil Reactivo GT en ensayo Reactivo Origen Europeo 77,8 136,7 1,2 13,7 84,8 48,6 66,3 26,6 93,9 11,2 19,5 12,4 116,1 68,8 14,8 53,5 11,6 86,7 2,7 3, 143,6 75,5 14,2 13,6 13,3 84,1 47,2 68, 27,2 93,8 113,3 17, 12,5 121,2 69,5 18,6 55, 15,5 89,2 19,7 31,1 147, 77,9 136,1 15,8 13,7 87, 47,6 66,6 26,6 92, 118,5 13,7 16,4 119,3 7,7 11,8 55,4 1,4 9, 18,9 32,5 147, Contra Reactivo brasilero Ecuación de regresión y= 1,21 x -,862 Coeficiente de correlación:,998 Contra reactivo europeo Ecuación de regresión y= 1,3 x -,439 Coeficiente de correlación:,998 TABLA II Reproducibilidad intra ensayo Conc mg/l Muestra ,5 5,9 5,9 51,3 5,1 5,2 5,2 5,7 51,6 51, 73,3 74,2 76,7 73,4 73,2 74,1 74,7 74,7 77,7 73,7 199,7 2, 23, 2,2 198,7 198,8 24,5 22,7 197, 198,7 Promedio 5,6 74,6 2,3 SD mg/dl +,637 C.V. % + 1,26 1,496 2,1 2,339 1,17 4

5 TABLA III Reproducibilidad inter ensayo AVANCE Conc mg/l Muestra ,2 51,1 5,7 51, 51, 5,8 49,3 51,1 49,9 49,5 77, 77,9 77,6 75,7 77,8 77,4 74,2 74,3 76,5 75,6 23, 197,2 22,2 199,9 21,2 23,2 198,3 24,7 198,8 23,1 Promedio 5,4 74,4 21,2 SD mg/dl +,796 C.V. % + 1,58 1,39 1,82 2,51 1,25 TABLA IV Ensayos interferentes INTERFERENCIA DE FACTOR REUMATOIDEO INTERFERENCIA DE HEMOGLOBINA Conc FR (UI/ml) (UI/ml) µalb teórica µalb ensayo Conc Hb (g/l) µalb teórica µalb ensayo < , 7,8 69,8 68,2 73,4 72,8 71,5 69,2 187,2 3,4 5,7 8, 9,9 211,3 29,8 28,4 27,2 213,4 28,5 213,5 21, 29, INTERFERENCIA DE BILIRRUBINA INTERFERENCIA DE BILIRRUBINA Conc Br µalb teórica µalb ensayo Lipemia (g/l) µalb teórica µalb ensayo 75, 11,4 177,3 28,9 25,2 21,3 194, 19,5 213,4 22,8 197,4 197,5 191,9,8 1,3 1,7 2,5 211,3 21,2 29,2 27,2 213,4 21,1 27,8 29,4 21, 5

6 TABLA V Parámetros para automatización NOMBRE DEL TEST/ NOME DO TESTE / TEST NAME MICROALBUMINURIA Kit: GT Lab Tipo de reacción / Tipo de reação / Reaction type Cinética 2 puntos / Cinética 2 pontos Kinetic 2 points Blanco de muestra/branco de amostra: Sample blanc: Longitud de onda primaria/primária/main: 54 nm Comprimento de onda/wavelength secundaria/secundária/reference : N.A. no / não no Unidades/Units: mg/l Decimales/Decimais/Decimals: Dirección/Direção/Direction: Volúmenes /Volumes /Volums MuestraAmostra/Sample: 3 µl R1: 24 µl R2: 6 µl Temperatura/Temperature: 37ºC Preincubación /Pré-incubação/Preincubation : 1 seg Tiempo entre reactivos/tempo entre reagentes/time between reagents: 1 seg Tiempo de retardo/tempo de retardo/lag time: N.A. Intervalo de lectura /Intervalo entre leituras /Reading time /?T: 12 seg Tiempo de reacción /Tempo de reação / Reaction time : N.A. Control de calidad/control de qualidade/quality control Abs min: -,2 Abs max:,2 Intervalo de verificación /Intervalo de verificação /Verification time : 16 hs Linealidad /rango dinámico Lineridade /faixa dinâmica Linearity/dynamic range 1 mg/l Calibración/Calibragem /Calibration Factor/Fator/Factor: N.A. Nº calibradores /Calibrators number : 5 Concentraciones /Concentrações /Concentrations : 1 xx.x 2 xx.x 3 xx.x 4 xx.x 5 xx.x Interpolación /Interpolação /Interpolation : lineal/linear Repetición /Repetição /Repetition : -1 Valores normales/ Valores normais Bajo/Baixo/Low: 4 mg/l Normal values Alto/High: 2 mg/l Comercial : infocomercial@gtlab.com.ar Profesional: infoprofesional@gtlab.com.ar ( 341 ) y rot. 6

7 Comparación con reactivo brasilero Rvo. GT Lab Rvo. brasilero Comparación con reactivo brasilero Rvo. GT Lab Rvo. brasilero 7

8 Referencias Biográficas 1. Worwood M. Blood Reviews 199; 4: Mazza J et al. Can Med Assoc J 1978; 119: Rodriguez Perez J et al. Revista Clinica Española 198: 156 (1): Corali Vicente et al.j Lab Clin Med 199: 116 (6): Milman N et al. Eur J Haematol 1994: 53: Gudrun Wiedemann et al. Eur J Clin Chem Clin Biochem 1993; 31: Young DS. Effects of drugs on clinical laboratory test, 4th ed. AACC Press,