COMPORTAMIENTO DE LA PENDIENTE EN EL ENSAYO DE LINEALIDAD DEL RAPIGLUCO-TEST
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- Juan Antonio Rey Márquez
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1 Rev Cubana Farm 2001; 35(1):23-7 Empresa de Productos Biológicos "Carlos J. Finlay" COMPORTAMIENTO DE LA PENDIENTE EN EL ENSAYO DE LINEALIDAD DEL RAPIGLUCO-TEST María Victoria Licea Tornés 1 y Marcia Martínez de Santelices Cuervo RESUMEN Se estudió el comportamiento de la pendiente y el coeficiente de determinación en el ensayo de linealidad del RapiGluco-Test, a partir del análisis de los lotes producidos en Se examinaron las curvas de calibración mediante un análisis de regresión lineal simple; además, se aplicaron otras herramientas de estadística descriptiva para el análisis de los resultados. Para la evaluación de ensayo de linealidad además del coeficiente de determinación (r 2 0,98), se propuso incluir la pendiente de la curva y se estableció para la aprobación del RapiGluco-Test un rango de 0,058 a 0,064. DeCs: QUIMICA FARMACEUTICA/métodos; TECNOLOGIA FARMACEUTICA; CALIDAD DE LOS MEDICAMENTOS; GLUCOSA DE LA SANGRE/análisis; MODELOS LINEALES; REACTIVADORES ENZIMATICOS; ESTADISTICAS NO PARAMETRICAS. La enfermedad más común relacionada con el metabolismo de los carbohidratos es la diabetes mellitus, síndrome caracterizado por una secreción anormal de insulina que se refleja en una tendencia a la hiperglicemia, por lo que la determinación de glucosa sanguínea es de vital importancia para la detección y seguimiento de los pacientes diabéticos. 1 La historia recoge numerosos métodos desarrollados para la determinación de glucosa. Actualmente se considera como método rutinario el desarrollado por Trinder 2 que sigue siendo el mejor método enzimático colorimétrico para este analito, por ser el sistema cromogénico altamente específico y libre de interferencias significativas y utilizarse para un amplio rango de concentraciones de glucosa. Se ha demostrado la correlación de dicho método con el de la hexoquinasa, método de referencia para este analito. Desde 1996 en nuestra Empresa se produjo un reactivo único en forma líquida 1 Licenciada en Química. Investigadora Agregada. 2 Licenciada en Química. Investigadora Agregada. Especialista en Control de Medicamentos. 23
2 basado en el método enzimático desarrollado por Trinder, el cual fue registrado por el CECMED y ha sido ampliamente utilizado en toda la red hospitalaria de nuestro país, con buenos resultados. Para garantizar la calidad del reactivo se establecieron las especificaciones de calidad para el envase, materias primas, parámetros del proceso tecnológico, así como los métodos de control de proceso y para el producto envasado. Es requisito para la aprobación de los reactivos que el resultado de cada ensayo esté comprendido dentro de los límites de aceptación. Para la aprobación del reactivo se realizan diferentes ensayos; uno de los más importantes lo constituye la evaluación de la linealidad analítica. Con el objetivo de evaluar de manera más rigurosa el ensayo, se establecieron los límites de aceptación de la pendiente. Para cada concentración se realizaron tres réplicas. Se seleccionaron 30 lotes de RapiGluco-Test elaborados durante Se utilizó para la evaluación de la linealidad analítica del RapiGluco-Test un juego de soluciones de referencia Preciset Glucosa de la firma comercial Boehringer Mannheim, con un rango de concentraciones desde 2,78 hasta 16,7 mmol/l. Se calculó para cada lote el coeficiente de determinación así como la pendiente (coeficiente de regresión). 3,4 Como criterio adicional para la evaluación del coeficiente de regresión se determinó el factor de proporcionalidad P (relación entre el valor de absorbancia correspondiente a cada una de las réplicas de las soluciones de referencia y su concentración) y el coeficiente de variación. Las expresiones utilizadas para el cálculo de estos parámetros fueron: MÉTODOS P in = Y in La determinación de la linealidad analítica del RapiGluco-Test se realizó según lo establecido en el Procedimiento Normalizado de Operación de la Empresa de Productos Biológicos Carlos J. Finlay, el cual se describe a continuación: - Se adicionó 4 ml de RapiGluco-Test a cada tubo de ensayo. - Se añadió 40 µl de cada una de las - Se preparó de igual forma un blanco con 40 µl de agua destilada. - Se mezclaron suavemente y se incubaron durante 10 min a 37 C. - Se retiraron los tubos del baño de incubación. - Se leyó la absorbancia de cada una de las soluciones de referencia contra blanco a 505 nm. X i DE CV = 100 P donde: Y: absorbancia de cada réplica de las X: concentración de cada una de las i: de 1 a 5. n = 15 P: promedio del factor de proporcionalidad. DE: desviación estándar. Para la evaluación estadística de estos resultados se utilizaron el método de regresión lineal simple, la prueba de Kolmogorov-Smirnov y el gráfico de control por variable de elementos individuales. 5 24
3 0,068 0,066 0,064 0,062 0,060 0,058 0,056 0,054 0,052 Linealidad Límites de control superior e inferior Lotes analizados Límites de control Análisis estadístico de los límites de la pendiente: L S + 3,0 sigma = 0, subgrupos analizados L S = 0, subgrupo excluido L S - 3,0 sigma = 0,0584 FIG. Gráfico control del RapiGluco-Test. Límites de la pendiente. RESULTADOS En la tabla 1 se presentan los resultados del coeficiente de determinación (r 2 ) y coeficiente de regresión obtenidos para cada lote del producto. En la figura se observa el comportamiento del coeficiente de determinación en los 30 lotes analizados. Los límites de control están comprendidos entre 0,058 y 0,064. En la tabla 2 se ofrecen los valores del factor de proporcionalidad P, así como el coeficiente de variación (CV) calculado para cada lote. DISCUSIÓN Los valores obtenidos del coeficiente de determinación para cada lote analizado (tabla 1) cumplieron con el criterio de linealidad establecido r 2 0,98, es decir, en cada lote la relación lineal simple es altamente significativa. 25 TABLA 1. Resultados del ensayo de linealidad Coeficiente Coeficiente Lote de regresión de determinación 1,061,9983 2,061,9974 3,067,9952 4,064,9977 5,061,9970 6,062,9973 7,063,9988 8,060,9952 9,062, ,063, ,063, ,063, ,063, ,059, ,059, ,059, ,060, ,061, ,061, ,061, ,062, ,060, ,060, ,062, ,061, ,063, ,060, ,062, ,063, ,061,9986 Prueba Kolmogorov-Smirnov: estimated Kolmogorov statistic DPLUS =,145955; estimated Kolmogorov statistic DMINUS =,120712; estimated overall stastistic DN =,145955; approximate significance level =,
4 TABLA 2. Factor de proporcionalidad y coeficiente de variación calculado para cada lote Factor de Coeficiente Lote proporcionalidad de variación (%) 1,060 1,8 2,061 2,9 3,062 2,1 4,064 2,3 5,064 2,5 6,063 2,1 7,062 3,0 8,064 2,0 9,062 3,0 10,061 2,9 11,063 1,9 12,063 2,0 13,063 3,0 14,064 1,5 15,064 3,0 16,062 2,5 17,062 2,1 18,063 2,3 19,064 2,6 20,062 1,5 21,062 1,3 22,063 2,0 23,061 1,5 24,063 2,1 25,064 1,3 26,064 2,0 27,063 2,2 28,063 1,7 29,063 2,6 30,062 2,3 Mediante la prueba de Kolmogorov- -Smirnov se comprobó que los coeficientes de regresión obtenidos siguen una distribución normal, ya que el nivel de significación es mayor que 0,05. El gráfico de control por variables nos permite conocer la tendencia de la característica analizada. En la figura se observa que los coeficientes de regresión, excepto uno, se encuentran dentro de los límites de control determinados para 3 sigma, con un nivel de confianza del 99,73 %. El valor promedio del factor de proporcionalidad para cada lote (tabla 2) se encuentra dentro de los límites de control establecidos para el coeficiente de regresión. De igual forma el coeficiente de variación fue menor o igual que el 3 %. Estos 2 parámetros sirven para la evaluación de los límites de control del coeficiente de regresión del RapiGluco-Test. Este estudio propone incluir en el ensayo de linealidad analítica del reactivo único para la determinación de glucosa en suero (RapiGluco-Test) el cálculo de la pendiente de la curva de calibración y los límites de aceptación de ésta, lo cual permite evaluar de manera más rigurosa dicho ensayo en el Laboratorio de Control de nuestra Empresa, para la aprobación de este reactivo. El intervalo de pendiente establecido es válido cuando se realiza el ensayo de linealidad en un intervalo de concentración de 2,78 a 16,7 mmol/l. El intervalo de la pendiente establecido para el RapiGluco-Test está comprendido entre 0,058 y 0,064. SUMMARY The behavior of the slope and the coefficient of determination in the lineality test of the RapiGluco-Test were studied by analyzing those batches produced in The calibration curves were examined by simple linear regression analysis. Other tools of descriptive statistics were applied to anlyze the results. Besides the coefficient of determination for the evaluation of the lineality test (r 2 ³0.98), the slope of the curve was also included and a range from to was established for the approval of the RapiGluco-Test. Subject headings: CHEMISTRY, PHARMACEUTICAL; TECHNOLOGY, PHARMACEUTICAL; DRUG QUALITY; BLOOD GLUCOSE/analysis; LINEAR MODELS; ENZYME REACTIVATORS; STATISTICS, NONPARAMETRIC. 26
5 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Pesce AJ, Kaplan AL. Methods in clinical chemistry. Missouri: Mosby, 1987: Trinder P. Determination of glucose blood using glucose oxidase with an alternative oxygen acceptor. Ann Clin Chem 1969;6: Sigarroa A. Biometría y diseño experimental. La Habana: Editorial Pueblo y Educación, 1985: Virteneu A. Regression-based reference limits. Determination of sufficient sample size. Clin Chem 1988;44(11): Grisell JR. Los gráficos de control. Una herramienta en el control de la calidad. Quality Prog 1990;2:1-5. Recibido: 11 de septiembre del Aprobado: 28 de octubre del Lic. María Victoria Licea Tornés. Empresa de Productos Biológicos. "Carlos J. Finlay". Infanta No esquina Manglar, Centro Habana, Ciudad de La Habana, Cuba. 27
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