AVANCE. Publicación de contenido científico editada por GT Laboratorio S.R.L. Necochea 3274 Rosario

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1 Publicación de contenido científico editada por GT Laboratorio S.R.L. Necochea 3274 Rosario AVANCE N 6 Julio 2012 Método enzimático directo. Colesterol ligado a lipoproteínas de baja densidad (LDL - colesterol) GT Lab ha introducido un método enzimático directo (sin requisito de precipitación previa) para determinar el colesterol ligado a lipoproteínas de baja densidad. Los reactivos son presentados en forma líquida y listos para su uso. El método puede emplearse en analizadores automáticos capaces de usar dos reactivos por método. 1

2 INTRODUCCIÓN El colesterol está vinculado a la formación de ateromas. Numerosos estudios epidemiológicos han demostrado una estrecha relación entre los niveles de colesterol elevados y la aparición de enfermedad cardíaca coronaria. El colesterol no puede disolverse en la sangre sino que tiene que ser transportado desde las células por las lipoproteínas hacia los hepatocitos, donde es metabolizado. Desde el hígado, el colesterol es excretado a la bilis como tal o transformado en ácidos biliares. Se han clasificado a las lipoproteínas en tres tipos de acuerdo a su densidad e identificadas por las siglas de sus nombres en inglés: las de alta densidad o HDL (high density lipoproteins), las de baja densidad o LDL (low density lipoproteins) y las de muy baja densidad o VLDL (very low density lipoproteins). Cuando hay alta concentración de colesterol ligado a las lipoproteínas de alta densidad (LDL-colesterol), éste se va acumulando en las arterias. Efectivamente, en unión con la elastina de las arterias y otras sustancias, se van formando las llamadas placas, que estrechan peligrosamente el diámetro de las que irrigan al corazón y al cerebro, haciéndoles perder la flexibilidad y dando origen a la condición denominada aterosclerosis. (Figura 1) En caso de formarse un coágulo que bloquea una arteria así estrechada, se origina un infarto. Alrededor del % del colesterol sanguíneo es transportado por las lipoproteínas de alta densidad (HDL-colesterol), actuando como un removedor del colesterol. Es por eso que se busca aumentar la proporción del mismo, dado que favorece el ingreso del colesterol a los hepatocitos y, consecuentemente, su eliminación. Una baja concentración del HDL-colesterol, contrariamente, resulta en un incremento del riesgo coronario, haciéndose más peligroso por debajo de los 40 mg/dl. La liporproteína Lp(a) es una variante genética de las LDL. Una concentración elevada de Lp(a) es considerada un factor de riesgo significativo de desarrollo prematuro de depósitos grasos en las arterias. Si bien su rol no es totalmente entendido, parecería actuar con sustancias presentes en la pared arterial y contribuir a la formación de dichos depósitos. En consecuencia, el dosaje de colesterol y su distribución en las lipoproteínas de alta densidad y baja densidad (HDL y LDL colesterol) son de alto valor en la prevención de tales patologías. Numerosos estudios clínicos apuntan al colesterol ligado a las lipoproteínas de baja densidad (LDL colesterol) como el principal factor en la patogénesis de la arteriosclerosis y de la enfermedad arterial coronaria. PRINCIPIO DEL ENSAYO Un polímero polianiónico contenido en el reactivo R1 solubiliza las lipoproteínas no-ldl permitiendo que la colesterol esterasa y la colesterol oxidasa consuman el colesterol ligado a ellas pero destruyendo el agua oxigenada producida antes de la acción de la peroxidasa, por ende, sin producir color. 2 Un detergente no iónico contenido en el reactivo R2 solubiliza las LDL permitiendo la reacción completa de colesterol esterasa, colesterol oxidasa y peroxidasa con desarrollo de color por oxidación copulativa de la 4-aminofenazona (4AF) y la N,N-bis (4-sulfobutil)-m-Toluidine-disódica (DSBT). El color formado es directamente proporcional a la concentración del LDL colesterol en la muestra. La presencia de ascorbato oxidasa evita la interferencia de ácido ascórbico COMPOSICIÓN DE LOS REACTIVOS PROVISTOS Los reactivos se proveen listos para usar. R1: MES Buffer 200 mmol/l (ph 6.3) Polímero polianiónico 1% 4-aminofenazona 2 mmol/l Colesterol oxidasa >60 U/l Colesterol esterasa >120 U/l Peroxidasa >500 U/l Ascorbato oxidasa >10 U/l R2: MES Buffer 200 mmol/l (ph 6.3) Detergente no iónico 0.5% N,N-bis (4-sulfobutil)-m-Toluidine-disódico 0.4 mmol/l CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD Conserve los reactivos refrigerados (2-8ºC) sin congelar. La estabilidad alcanza la fecha de vencimiento indicada en la caja. PRECAUCIONES Y ADVERTENCIAS SOBRE SU USO Los reactivos son para uso IN VITRO. La caja y los envases contenidos en este producto no deben ser reusados, debiendo descartarse como residuos peligrosos una vez empleados, de acuerdo a la legislación vigente. El personal que manipula los mismos debe ser debidamente capacitado para su manejo y descarte por la institución o laboratorio que lo emplea. REACTIVOS NECESARIOS PERO NO PROVISTOS QUALISET CALIBRADORES (Código : 1 x 5 ml Nivel 2). MUESTRA Suero o plasma obtenido con EDTA o heparina, luego de horas de ayuno. CONDICIONES DE CONSERVACIÓN DE LAS MUESTRAS - Refrigerador (2-8ºC): estable 2 días - Congelador (-20ºC): estable 4 meses SUSTANCIAS INTERFERENTES Hemólisis y bilirrubinemia moderadas, no interfieren. La hiperlipemia puede causar turbidez al finalizar el ensayo. En tal caso, procesar una dilución de la muestra. ENSAYO Procedimiento: PREVIAMENTE, ATEMPERE EL REACTIVO. En tres tubos marcados B (blanco), E (estándar) y D (desconocido)

3 agregue: B E D Muestra - 3µl - Calibrador - - 3µl R1 300 µl 300 µl 300 µl Mezcle e incube 5 minutos a 37 C R2 100 µl 100 µl 100 µl Mezcle e incube 5 minutos a 37 C Lea a 546/660 nm A E y A D llevando a cero D.O. con B El color desarrollado es estable 60 minutos. CÁLCULOS A D x concentración del Calibrador =mg/dl de LDL colesterol A E Estudio de Precisión Se procesaron pooles de muestras de personas caucásicas, adultas, sin antecedentes de patologías y sin medicación para el caso del nivel normal, y de las mismas características etáreas con antecedentes de dislipidemia, sin otras patologías asociadas. Las muestras se conservaron congeladas a -20ºC durante todo el tiempo entre ensayos. Intraensayo (n=10) Promedio Rango D.S. CV % 160 mg/dl mg/dl ± 2,9 mg/dl ± 1,8 290 mg/dl mg/dl ± 4,5 mg/dl ± 1,5 Interensayo (n=10) ADAPTACIONES PARA AUTOMATIZACIÓN El método es adaptable a analizadores automatizados. Están disponibles adaptaciones para diferentes instrumentos. En la Tabla I se indican los parámetros genéricos a emplear en automatización. VALORES DE REFERENCIA Deseable: < 130 mg/dl Límite de riesgo: m/dl ( mmol/l) Riesgo elevado: > 160mg/dl (4.14mmol/l) Cada laboratorio debe establecer los valores normales correspondientes a su población. EVALUACIÓN DE DESEMPEÑO DE LDL DIRECTO PLUS Estudio de comparación Se efectuaron comparaciones de muestras contra reactivos comerciales de igual fundamento técnico y aprobados por ANMAT, tomados como referencia. Los resultados se muestran en la Tabla II y en los Gráficos 1 y 2 expresados en mg/ dl de colesterol. Sensibilidad La sensibilidad en espectrofotómetro a 505 nm, leyendo en cubetas de caras paralelas con un paso de luz de 1 cm, es aproximadamente 0,66 mg/dl. Especificidad El método es específico para LDL colesterol (libre o esterificado). La hemólisis, la bilirrubinemia y la hiperlipemia moderadas no interfieren en el método. Linealidad La reacción cumple con la ley de Lambert & Beer entre 0 y 500 mg/dl. Recuperación La recuperación obtenida por agregado de cantidades conocidas de LDL Colesterol a muestras biológicas estuvo entre el 98,2 y el 100,4%, dentro del rango establecido en c-. 3 Promedio Rango D.S. CV % 163 mg/dl mg/dl ± 3,8 mg/dl ± 2, mg/dl mg/dl ± 6.3 mg/dl ± 2,2 Resultados incorrectos pueden obtenerse si no se respetan estrictamente las indicaciones dadas en el Manual de Instrucciones sobre Procedimientos de Uso, Calidad de la Muestra, uso de anticoagulante, etc. SUSTANCIAS DE REFERENCIA Y/O PATRONES EMPLEADOS La calibración del método ha sido referenciada a los siguientes patrones: Standard Reference Material #909b (National Institute of Standards and Technology, EEUU): suero humano Standard Reference Material #1951a (National Institute of Standards and Technology, EEUU): suero humano

4 GRÁFICO 1 GRÁFICO 2 FIGURA1 4

5 TABLA 1 NOMBRE DEL TEST/NOME DO TESTE / TEST NAME LDL colesterol/ldl cholesterol Kit: GT Lab Tipo de reacción / Tipo de reação / Reaction type Punto final / Ponto final / End point Blanco de muestra/ Branco de amostra: Sample blanc: no/não no Longitud de onda Comprimento de onda/wavelength primaria/primária/main: secundaria/secundária/reference: 546 nm 660 nm Unidades/Units: Decimales/Decimais/Decimals: mg/dl 1 Volúmenes/Volumes/Volums Dirección/Direção/Direction: Muestra/Amostra/Sample: R1: R2: 3µl 300 µl 100 µl Volúmenes/Volumes/Volums Preincubación/Pré-incubação/Preincubation: Tiempo entre reactivos/tempo entre reagentes/time between reagents: Tiempo de retardo/tempo de retardo/lag time: Intervalo de lectura/intervalo entre leituras/reading time / T: Tiempo de reacción/tempo de reação/ Reaction time: 300 seg 300 seg Control de calidad/control de qualidade/quality control Abs min: Abs max: Intervalo de verificación/intervalo de verificação/verification time : -0,2 0,2 16 hs Linealidad/rango dinámico Lineridade/faixa dinâmica Linearity/dynamic range 700 mg/dl Calibración/Calibragem/Calibration Factor/Fator/Factor: Nro calibradores /Calibrators number: Concentraciones/Concentrações/ Concentrations: Inmunoquant Calibrador Inmunoquant Calibrador N.A xx.x xxx.x Interpolación/Interpolação /Interpolation: Repetición/Repetição/Repetition: lineal/linear-100 Valores normales/valores normais Normal values Bajo/Baixo/Low: Alto/High: 130 mg/dl 5

6 TABLA 2 Reactivo importado Reactivo GT En ensayo Reactivo nacional 129,0 169,0 192,3 203,1 204,0 216,9 221,9 242,9 239,7 244,9 249,8 278,3 297,5 324,9 335,7 362,1 389,4 420,8 403,4 420,1 461,7 130,2 172,1 200,0 200,9 201,5 219,6 225,4 228,9 242,6 248,3 260,9 300,1 301,0 320,9 333,8 370,4 395,7 402,9 418,0 429,1 459,7 133,4 155,2 189,3 203,0 209,3 220,9 250,0 236,1 250,6 245,1 205,4 287,3 289,6 309,6 347,2 352,9 380,4 389,9 408,1 425,1 455,9 Contra reactivo importado Ecuación de regression y = 0,998 x + 3,10 Coeficiente de correlación: 0,986 Contra reactivo nacional Ecuación de regresión y = 1,01 x + 3,54 Coeficiente de correlación: 0,986 6