El Virus DENGUE. Prof. Mayling Alvarez Vera, Investigadora Titular, Laboratorio de Arbovirus, Departamento de Virología, IPK

Transcripción

1 El Virus DENGUE Prof. Mayling Alvarez Vera, Investigadora Titular, Laboratorio de Arbovirus, Departamento de Virología, IPK

2 Outline 1. Características Generales del virus Dengue 2. Estructura del virus Dengue 3. Nuevos conocimientos en relación a los epítopes responsables de una respuesta serotipo específica potente en Dengue

3 Familia Flaviviridae Familia Flaviviridae Género Flavivirus: Virus de dengue (DEN1-4); Fiebre amarilla; Nilo Occidental, Encefalitis Japonesa, Encefalitis de St.Louis, y Encefalitis transmitida por garrapata Género Hepacivirus: Virus de Hepatitis C Género Pestivirus: Bovine viral diarrhea virus, Classic swine fever classic swine fever

4 El Dengue Es una enfermedad infecciosa causada por cualquiera de los 4 serotipos del Complejo Dengue, que se trasmite al hombre a través de la picadura de del género Aedes, que puede dar lugar a una infección: Inaparente Fiebre indiferenciada Dengue Clásico FHD/SCD Fiebre del dengue Dengue severo

5 Los Virus del Dengue Familia Flaviviridae Género: Flavivirus Complejo Dengue: Den-1, Den-2, Den-3 y Den-4 Virión envuelto, esférico nm Genoma ssrna, lineal, polaridad positiva, 11kb, infectivo Velocidad de sedimentación: S Densidad de flotación: 1,19-1,23 g/cm % difieren en la E de cada serotipo Diferentes genotipos por serotipo que varían alrededor de un 3 %

6 Dengue Virus La microscopía electrónica muestra como el core o nucleocápside lo rodean una bicapa lipídica (la membrana y la envoltura). Las cuales están dispuestas en una simetría icosaédrica Sensibles al tratamiento con cloroformo,formaldehido, peróxido de hidrogeno, alcohol y yodo Nature Structural Biology 10, (2003),Kuhn et al. Cell (2002)

7 Proteínas estructurales Proteínas no estructurales 1.Molécula de ARN positiva con caperuza en el extremo 5 y no presenta cola poliadenilada en el extremo 3 2.Marco abierto de lectura que codifica para una larga poliproteína precursora de más de 3000 aa. Los genes ubicados hacia el ext 5 codifican para 3 proteínas estructurales: Cápside, Membrana y Envoltura mientras que las proteínas no estructurales son codificadas por genes ubicados en el extremo 3 denominadas NS1, NS2 A y B, NS3, NS4 A y B y NS5.

8 Proteínas estructurales Cápside: Proteína pequeña 11 KD y su secuencia aa altamente básica le permite su interacción con el ARN viral favoreciendo la formación de la ribonucleoproteína. Primer polipéptido viral sintetizado durante la traducción. Su dominio carboxilo terminal actúa como secuencia señal a través de la membrana mediando el transporte del precursor prm en el interior del lumen del RE. PrM: 26 KB, Es escindida proteolíticamente por la enzima furina liberándose su extremo amino terminal para dar lugar a la proteína M de 8 KD. La formación de M a partir de prm es crucial en la morfogénesis del virus. Su función principal es proteger a la E durante su paso por la vía secretora como en el heterodimero prm-e donde la prm estabiliza los epítopes de la proteína E sensibles a bajos ph evitando cambios conformacionales irreversibles durante la secreción de la partícula viral. Envoltura: 53 KD, principal proteína estructural del virus. Dividida en 3 dominios antigénicos. Aparece dentro de la célula como un heterodímero prm-e y como un homotrímero en la superficie del virion maduro. Esta proteína media el enlace al receptor celular, fusión de membrana catalizada por ácidos, maduración viral, inducción de anticuerpos neutralizantes e inhibidores de la hemaglutinación y epitopos de células T. Presenta determinantes antigénicos de especificidad de grupo, complejo y tipo.

9 NS1: KD. Puede encontrarse asociado a la célula, en el RE unida al complejo de replicación viral, en la superficie celular y en forma extracelular. Presenta determinantes antigénicos de serotipo y de grupo. La célula infectada al expresar esta proteína en la superficie celular es diana de células T citotóxicas y de Acs específicos que la hacen diana del complemento o de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos. NS2: Constituida por dos proteínas A y B (22KD). Puede encontrarse atravesando la membrana y localizada en posibles sitios de replicación. Participa en el ensamblaje del virión y presenta epitopos de células T. La NS2B esta asociado a la membrana y es un cofactor requerido para la función serina proteasa de NS3. NS3: Segunda proteína mas grande del virus 70KD, su estructura se divide también en 3 dominios. Es un componente de la maquinaria enzimática de replicación del ARN viral. Es multifuncional con actividad de serina proteasa helicasa y nucleótido trifosfatasa. Es fuente principal de epitopos de linfocitos T citotóxicos y puede inducir apoptosis NS4: La conforman la NS4 A y B de 16 y 27 KD. La NS4 A participa en la replicación del ARN, anclando componentes de la replicasa a membranas celulares. La NS4 B se localiza en sitios de replicación, dispersa en la membrana citoplasmática y en el núcleo. NS5: Es la proteína mayor 103 KD. Funciona como ARN polimerasa ARN dependiente y metiltransferasa en la metilación de la caperuza del extremo 5. Se ha demostrado la inducción por esta proteína de traducción y transcripción de la IL 8 favoreciendo la diseminación viral. Proteínas no estructurales

10 Dominios I y II : Son péptidos discontinuos que se conectan entre si por péptidos de unión conocidos como bolsillo de unión o EDI/EDII hinge. Dominio III es un péptido continuo que se extiende desde el dominio I formando un lazo con este. Los epítopes Nts se ubican en el péptido fusión entre EDI y EDII. Las regiones de unión entre los dominios participan en arreglos estructurales para convertir las partículas no inmaduras en infecciosas Estructura cristalina del ectodominio de la E muestra que este consiste de 3 dominios: DI, DII y DIII

11 Dominio II se muestra como una entidad estructural discontinua compuesta de regiones distantes en la secuencia primaria, específicamente aa 50 al 125 (contiene 3 puentes disulfuro) y aa 200 al Dominio II (A) contiene fundamentalmente epitopes cross-reactivos de grupo y subgrupo. - Se le denomina Dominio de dimerización, contiene el péptido de fusión interna altamente conservado entre los flavivirus - Lazo fusión se sobrelapan los epítopes cross reactivos inmunodominantes que generan predominantemente anticuerpos poco o no neutralizantes Modis & Harrison 2003 PNAS

12 Análisis de la secuencia de las variantes antigénicas indico que el Fab del monoclonal 1 A5 de chimpancé parece reconocer un nuevo epítope que involucra dos aa en diferentes dominios pero cercanos espacialmente cuando se forma el homodímero de la proteína E. Goncalvez 2004

13 Identificación de 2 epitopes determinantes: Gly en el lazo de fusión del Dom II e Leu 107 en el Dom III Estos resultados sugieren que tanto la Gly posición 106 como la Leu en la posición 107 son epítopes determinantes para el reconocimiento del Fab para DENV 4 Las sustitución de Gly 106 por Val en DENV 4 reduce la afinidad de unión al Fab 1 A5 en 80 veces mientras que sustituciones de leu 107 por Phe tienen poco efecto en esta comparado con el virus parental. La secuencia altamente conservada del péptido de fusión entre los flavivirus sugiere que el lazo de fusión juega un papel central en la fusión a la membrana y en la replicación viral. Las variantes con mutaciones en esta región pudieran ser consideradas una desventaja evolutiva.

14 La unión del mab 1A1D2 provoca cambios mayores en la estructura del virión responsables de inhibir la unión del virus a las células El complejo Fab-Dom III muestra cambios en 2 de las 3 moléculas en cada una de las 60 unidades icosaédricas asimétricas Estructura cristalina del Fab del mab 1 A1D2 unido al Dom III de la envoltura muestran que el epitope pudiera estar ocluido en el virus maduro Lok et al. Nat. Struct. Mol. Biol (2008)

15 - Identificaron los epitopes involucrados en la inducción de anticuerpos cross-reactivos contra la proteína E.

16 La reactividad de los anticuerpos anti-e, anti-ns1 y anti-prm se pierde completamente bajo condiciones de reducción, sugiriendo un reconocimiento de tipo conformacional

17 Mas del 90% de los anticuerpos anti-e que se generan tras la infección primaria son crossreactivos y mas del 90% de los anticuerpos anti-e que se generan tras la infección primaria no neutralizan con eficiencia a los serotipos heterólogos. Repertorio de anticuerpos generados tras la infección por dengue van a estar dirigidos hacia la inducción de una respuesta neutralizante menos potente por epitopes inmunodominantes del lazo fusión Dominio II y una respuesta neutralizante serotipo especifica mas potente por epítopes del Dominio III.

18 El Dom III se produjo en el periplasma de E- coli. La estabilidad termodinamica de fue medida y comparada en experimentos de equilibrio inducido por cambios quimicos o por calor y monitoreado a traves de la fluorescencia de la proteina. La baja estabilidad del Dom EDIII de DENV3 se incrementó por 3 cambios de residuos en la proteina Core sin afectar su reactividad con los sueros humanos inmunes a DENV. Cambios adicionales mostraron que la estabilidad del Dom III varía con los genotipos de DENV 3 Para el DENV 3 se encontró que la estabilidad del dominio III varía para los diferentes genotipos de este serotipo Zidane, N., et al., el, (6): p

19 Se determinó la serotipo especificidad y crosreactividad de un panel de sueros humanos por un ELISA (MAC-ELISA) empleando como antígeno el Dom III de los 4 serotipos RESULTADOS. La discriminación por el DIII por los sueros infectados homotípicamente a cada serotipo dismiuyeron en el orden decreciente DENV1 > DENV2 > DENV3 > DENV4. El Dom III DENV1 dio la mayor discriminacion entre los sueros infectados y no infectados, permitiendo asi el empleo de un Dom III universal para la deteccion de IgM a dengue.el patron de crosreactividad y discriminacion varió con el serotipo. Table Number of residue changes between ED3 domains of different serotypes Serotype DENV1 DENV2 DENV3 DENV4 DENVc DENV DENV DENV DENV DENVc DENVc, consensus ED3 domain. La discriminación de los sueros varió con los serotipos Zidane, N., et al., BMC Infect Dis, : p. 302

20 Caracterización del la interacción entre el DIII de DENV 3 de diferentes genotipos y el AcM Murino BA1. Se caracterizó la habilidad de este monoclonal de unirse y neutralizar a diferentes genotipos de DENV 3, demostrándose que las mutaciones en las posiciones 301 y 383 del Dom III son responsables de la neutralización diferente a los genotipos de DENV 3 Zhou, Y., et al., Virology, (1): p

21 La estructura cristalina mostro que la molécula de Fab se une a los dominios (DI), and DI-DII hinge de la proteína E. El monoclonal HMAb 1F4 puede neutralizar a diferentes etapas de la entrada del virus a las células y depende de los receptores celulares (Vero o U 937) HMAb 1 F4 HMAb 14c10 HMAb 5 H2 Comparacion de epitopes reconocidos por ldiferentes monoclonales. Los. Epítopes son coloreados en verde Mecanismo por el cual este Ac bloquea la infección viral Determinaci,ón de la estructura de DENV 1 en complejo con el fragmento Fab del HMAb 1F4, conociendo que este se une al virus y no a la proteína de la envoltura por ELISA. Guntur Fibriansah, EMBO Mol Med. Mar 2014; 6(3):

22 La región domain I/II hinge) es el mayor blanco para los Acs protectores después de una infección primaria. Estos resultados son importantes para el desarrollo de vacunas, pues las mismas deben estimular anticuerpos contra esta región Representacion de la E DENV-3 con EDI (rojo), EDII (amarillo), and EDIII (azul). La region EDI/EDII hinge aparece circulada. Localizacion de los residuos criticos asociados con las mutaciones de escape a la Nt son mostradas al trasplantar esta region de DENV 4 en DENV 3 William B. Messer, Proc Natl Acad Sci U S A. Feb 4, 2014; 111(5):

23 -Poblaciones de Ig reconocen epítopes cross-reactivos dominantes alrededor del péptido de fusión del Dominio II fueron mayores y altamente variables, entre un 50 y 30 % en sueros de infección primaria y secundaria respectivamente. - Ig reconocen epítopes cross-reactivos del Dominio III exhibieron comportamiento similar pero las magnitudes fueron mucho mas bajas y la respuesta IgM fue mucho mayor que la de IgG tanto en sueros primarios como secundarios. - Poblaciones de Ig reconocen epítopes específicos al Dominio III fueron muy pequeñas aunque la respuesta IgM fue mayor que la IgG, el reconocimiento para este epítope fue solo de 1 %, correlacionándose la respuesta IgG con la magnitud de la respuesta neutralizante independientemente del tipo de infección.

24 15 sustituciones aa en 8 residuos diferentes del Dominio III -Sustituciones K305 fueron las únicas sustituciones en el Dominio III que significativamente afecto el reconocimiento del Ac tipo específico D2. - Algunos de los Acs que vieron afectado sus reactividad con el péptido fusión Dominio II se vieron ahora afectados por las sustituciones en el Dominio III. - Combinando sustituciones en los Dominios II y III obtuvieron una significativa reducción de la reactividad a la mayoría de los AcM en el panel representado por distintas clases de reactividades. Epítopes específicos del Dominio III pudieran ser los responsables de la respuesta serotipo especifica observada en humanos tras la infección por dengue y que además estimulan una respuesta neutralizante potente y protectora.

25 - Anticuerpos que reconocen al Dominio III constituyen solo una pequeña fracción de los anticuerpos totales en sueros inmunes a dengue. - Estudios con sueros inmunes humanos depletados de anticuerpos que reconocen al Dominio III demostraron que los anticuerpos que reconocen a esta región juegan un rol minoritario en la neutralización viral.

26 -Estos resultados demuestran que los anticuerpos reactivos Dominio III desarrollados después infección primaria son específicos al serotipo causante de la infección. - Después de una infección primaria los anticuerpos serotipo específicos que reconocen al Dominio III se encuentran en un rango de % de los anticuerpos totales, en caso infección secundaria 0.2 a 4.0% sugiriendo que tras la recuperación de una infección quedan bajos niveles de anticuerpos reactivos al Dominio III que son serotipo específicos en el caso de una infección primaria.

27 - Estos resultados indican que los anticuerpos reactivos Dominio III contribuyen minoritariamente a la capacidad neutralizante de sueros inmunes a dengue.

28 CONCLUSIONES 1. Se necesitan nuevos estudios para el conocimiento de nuevos epítopes de Acs Nts específicos a dengue. 2. Los epítopes responsables de la respuesta serotipo específica que estimulan una respuesta potente y protectora no solo se encuentran en el Dom III sino también en el Dom I y en el péptido fusión DI/DII. 3. La unión de estos epítopes provocan cambios en la estructura del virión los que son responsables de la inhibición de la unión del virus a las células.

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