USO DE AISLADOS NACIONALES EN BIOREMEDIACION ACUICOLA

Transcripción

1 USO DE AISLADOS NACIONALES EN BIOREMEDIACION ACUICOLA John Salazar Fiallo Arkeaslab S.A Sociedad Latinoamericana de Acuicultura 2016

2 ALGAS MOP MICRO ORGANISMOS CAMARONES Y/O PECES ALIMENTO BALANCEADO FERTILIZANTES MELAZA CAL OTROS HECES SOLIDAS / LIQUIDAS MUDAS + MO DEL SUELO Y OTROS MATERIALES CAPACIDAD DE CARGA?

3 Acumulación e Inhibición Población Natural de Microorganismos Materiales de Desecho en Aumento

4 El estado de los fondos de los estanques es proporcional a nuestro conocimiento y habilidad en el manejo de piscinas?

5 Los bajos niveles de profundidad influyen en el rápido crecimiento y acumulación de poblaciones de algas bentonicas Beatriz Borrega

6 La generación de lodos reducidos no mineralizados, tiende a producir metabolitos tóxicos afectativos Beatriz Borrega

7 La acumulación de hierro no mineralizado, genera acidez y produce mortalidades de carácter permanentes. Yader Rodríguez

8 Alternativas Posibles de Corrección : Condicionantes: Alimento Densidad de Población Renovación Insumos Adicionales Limo en Suspensión Suelos Agrícolas Material Orgánico Histórico Suelo Biológicamente Pobre Alternativas: Comederos o Automatización Capacidad de Carga Recirculación Puesta de lo Necesario Corrección de Suelos Evaluación Previa Bioremediación

9 Bioremediacion Se define como el uso de microorganismos vivos, componentes celulares y sus enzimas para transformar y/o mineralizar, materiales orgánicos, residuos de agentes contaminantes y provocar una alteración del estado Redox de metales. En 1980, Yasuda y Taga anticiparon que las bacterias serian útiles como agentes de control biológico de enfermedades y como activadores de la tasa de regeneración de nutrientes en acuacultura.

10 Componentes necesarios para un proceso de Bioremediacion Aceptor de Electrones SUSTRATO CONTAMINADO Bacterias Células Donador de Electrones CO2

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12 Acetato Residuos Domésticos Lípidos DONADORES DE ELECTRONES Carbohidratos Piruvato Proteínas Metanol

13 BACTERIAS INTERACCION METABOLICA JUEGAN UN ROL IMPORTANTE EN LA DINAMICA DE NUTRIENTES EN LOS SISTEMAS DE PRODUCCION DE ACUACULTURA OXIDACION REDUCCION PRINCIPALES RESPONSABLES DE MANTENER EL EQUILIBRIO ECOLOGICO ENTRE MATERIALES VIVOS O MUERTOS EN EL SUELO Y AGUA CARBONO NITROGENO AZUFRE FOSFORO HIERRO MANGANESO Todos los ciclos biogeoquimicos estan vinculados y el metabolismo relacionado con la transformacion de estos nutrientes, tiene impacto global. (Prescott et.al 2002) CICLO BIOGEOQUIMICO

14 Cuestionario Base En que radica la importancia de manejar cepas propias de una comercial. Es necesario llevar a cabo un proceso de Bioremediacion en piscinas de producción acuícola? Hacia donde va dirigida la eficiencia del producto biológico a usar? Que resultados debo de observar una vez iniciado el proceso? El balance bioquímico del agua se puede afectar debido a la densidad poblacional del consorcio bacteriano? Que tipo o clase de agentes biológicos debemos usar?

15 Diagrama Conceptual del Flujo de Carbono durante la Descomposición de un Sustrato MODELO AGREN & BOSSATA Co2 BIOMASA MICROBIANA SUELO SUSTRATO - DETRITUS

16 CICLO DEL NITROGENO N2 MO NH3 AMONIACO

17 Que hace la Bioremediacion La actividad biológica generada por un consorcio microbiológico, altera la estructura molecular de los materiales y el grado de alteración determina si se ha producido biotransformacion o mineralización. BIOTRANSFORMACION DESCOMPOSICION DE UN COMPUESTO ORGANICO EN OTRO SIMILAR NO CONTAMINANTE O MENOS TOXICO. MINERALIZACION ES LA DESCOMPOSICION A DIOXIDO DE CARBONO, AGUA Y COMPUESTOS CELULARES.

18 ph Parámetros Necesarios de control en una Bioremediacion viable Temperatura Metabolismo del suelo : co2 Redox : suelo / agua Amonio Nitritos Nitratos Evaluacion visual y olfativa de lodos

19 Consorcio Bacteriano Remediador HETEROTROFO NITRIFICANTE

20 Generación de Aislados Alpha I 1.- Evaluación metabólica del suelo y Redox. 2.- Toma de muestras dilución siembra y aislados. 3.- Micro bioquímica de identificación inicial y/o secuenciación molecular. 4.- Preservación Alpha II (inserto) Inserto (+) Inserto(-)

21 1.-Evaluación del Metabolismo del Suelo Los suelos sanos y activos están en constante producción de Co2. La generación de Co2 es la resultante de la digestión de los materiales orgánicos presentes, procurando de esta manera la eliminación de los mismos. La eficiencia de un producto biológico sobre un sustrato o suelo es medible y va en directa relación con la cantidad de Co2 liberado.

22 Ubicación de muestras de Campo y Control campo control Pablo Valcare

23 Procedimiento in Situ 1.- Se hacen dos cuadrados en el suelo de un metro por lado. Uno en el sitio expuesto y el otro (control) en un área aparte. 2.- Coloca en recipiente pequeño con hidróxido de potasio 0,1 N, cubriendo con el vaso grande enterrado inhibiendo el contacto exterior de la muestra. 3.- Después de 24 horas se titra con gotas de fenolftaleína y acido clorhídrico 0,1 N.

24 Respirometria FRASCO DE VIDRIO CO2 CO2 HIDROXIDO DE SODIO FONDO / SUSTRATO

25 HIDROXIDO DE SODIO En Laboratorio

26 Mapeo de Redox

27 Toma de Muestras de Suelo

28 Bolsas para transporte de Muestras Estériles

29 Hisopo de Transporte de Muestras Medio Stuart

30 Medio de Transporte Stuart Esta es otra forma de tomar Muestras preservadas para transportar al laboratorio. Medio especifico para recolección, transporte y conservación de muestras aptas para estudios microbiológicos. Tiene un mínimo aporte de nutrientes que permite la recuperación de los microorganismos sin que haya replicación. Medio semi-solido, no nutritivo de Tioglicolato de Sodio El ph alto minimiza la destrucción bacteriana por acidificación.

31 Tratamiento de Muestras Procedimiento: Tomar con tubos de PVC de 6 cm. de diámetro. Introducir el tubo máximo a 15 cm de profundidad del fondo. Evitar remover la superficie. Colocar los tubos en fundas estériles de transporte. Mantener cadena de frio en transporte o mantener en refrigeración no mayor a 5 horas. Diluciones: Solución salina (hacer diluciones hasta 5 tubos). Sembrar en agar AN, TSA o AM: 0,1 ml y/o 1mL Incubar entre 27 y 30C por 24 a 72 horas. Contar Colonias observadas.

32 Aislamiento Siembra por estría y agotamiento en agar TSA o agar Nutriente. Establecer mínimo Línea III de Pureza. Observación Morfológica de Colonias.

33 Contaje de Colonias mediante: CFU Scope v1.1

34 Protocolos de Verificacion Forma Motilidad Tinción Enzimas Micro Bioquímicas

35 En Microbiología, los estándares de McFarland son usados como una referencia para ajustar la turbidez de las suspensiones bacterianas hasta que el número de bacterias llegue al rango establecido específicamente para identificación y pruebas de susceptibilidad. Tubos de Macfarland El estándar de Mc- Farland mas utilizado es al 0.5% y corresponde aproximadamente a una suspensión homogénea de 1.5 x 10 a la 8e células bacterianas / ml.

36 3.- Micro bioquímica, dilución del Inoculo y siembra en Micro galerías Sistema de Identificación Microgen 0,5 Macfarland

37 Dosificación de Reactivos en Micro galerías

38 Interpretación de Resultados Microgen GN ID Panel A+ Panel B

39 4.- Preservación de Cepas de Reserva en Viales Cryobank

40 Inoculo en Viales de Cryobank VIAL DE CRYOBANK BACTERIAS CONGELACION GLICEROL MICROPERLAS POROSAS

41 Preparacion de Medios Bases Medio para Nitrificantes Agua 1L. Cloruro de amonio 1 g. Fosfato di potásico 1 g. Carbonato de calcio 1 g. Sulfato de magnesio 10 g. Sulfato ferroso 10 mg. Cloruro de calcio 10 mg. Sales inorgánicas 0,02 mg. de: Mn, Mo, Cu, Co, Zn. Medio para Heterotofas AGUA 1 L. PEPTONA O TRIPTONA 5g. EXTRACTO DE CARNE 3g.

42 Bioreactor

43 Escalados I,II,III

44 Crecimiento Bacteriano Fase Lag o de Adaptación El crecimiento microbiano puede medirse en términos de concentración celular (número de células por unidad de volumen de cultivo) o densidad celular (peso seco de las células por unidad de volumen de cultivo). Fase Log o Exponencial Fase Estacionaria En organismos unicelulares la multiplicación conduce a un aumento en el número de individuos dando lugar a una población o a un cultivo Fase Senescente

45 Log. del numero Celulas viables Fase Lag o de adaptación NO HAY DIVISION CELULAR NO HAY INCREMENTO NETO DE MASA LA CELULA ESTA SINTETIZANDO NUEVOS COMPONENTES CELULAS ENVEJECIDAS CARECEN DE PROVISION SUFICIENTE DE ATP LA INOCULACION EN UN MEDIO QUIMICAMENTE DIFERENTE GENERA UNA FASE DE LATENCIA MAS LARGA TIEMPO

46 Fase Log o Exponencial CRECEN Y SE DIVIDEN A LA VELOCIDAD MAXIMA POSIBLE QUE LE PERMITE SU POTENCIAL GENETICO LAS CONDICIONES DE CULTIVO SON OPTIMAS SI SE HAN ADAPTADO A LA NATURALEZA DEL MEDIO DURANTE ESTA FASE LA POBLACION ES MUY UNIFORME EN CUANTO A SUS PROPIEDADES QUIMICAS Y FISIOLOGICAS TIEMPO

47 Fase Estacionaria EL CRECIMIENTO SE DETIENE Y LA CURVA SE HACE HORIZONTAL EN ESTA FASE LOS CULTIVOS LLEGAN A 1 x 10? E EL TAMAÑO DE LA POBLACION FINAL VARIA EN FUNCION DE LA DISPONIBILIDAD DE NUTRIENTES, OTROS FACTORES Y EL TIPO DE MICROORGANISMO TIEMPO

48 Fase Senescente INCAPACIDAD DE CRECER Y REPRODUCIRSE CNV RESPUESTA GENETICA DESENCADENADA MUERTE CELULAR PROGAMADA

49 Factores a Considerar Adaptación Incapacidad de contacto Sobrevivencia y competencia Micro habitad y nutrientes Carga energética Depredación

50 Factores de Afectacion El inoculo puede convertirse en fuente importante de alimento de depredadores del suelo Incapacidad de contactar los compuestos a degradar Incapacidad del inoculo de competir y sobrevivir con los autóctonos

51 Características de un Aislado Natural Contener un mínimo de tres, máximo 6 cepas. Deberá tener características nitrificante y heterótrofa. Manejable en ph 6-8. Estabilidad biológica soportada mínimo 90 días en sustratos solidos, semisólidos y líquidos. No generar gases. Exclusión comprobada contra vibrios, pseudomonas y aeromonas.

52 Tareas Especificas Es importante y necesario conocer de manera técnica la eficiencia de un consorcio bacteriano antes de usarlo. Evaluar su expresión sobre el objetivo o fin especifico por el que fue aislado o adquirido. Muestreos microbiológicos paralelos a los análisis químicos de agua y suelo. La tendencia debe de estar orientada a que el aislado sea de cepas autóctonas. Producir cepas para Bioremediacion y Pre - digestión.

53 Piscinas Inoculadas Beatriz Borrega

54 Piscina Inoculada Beatriz Borrega

55 Gracias por su atención