tumefaciens y bombardeo de partículas biolística.

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1 Métodos de transformación en plantas 1 1 Métodos de transformación en plantas mediado por Agrobacterium tumefaciens y bombardeo de partículas biolística. Methods in plant transformation by Agrobacterium tumefaciens and bombardment of particles "biolistic". Israel Giovanni González M. ¹ RESÚMEN La transformación vegetal se define en sentido estricto como el proceso de cambio del fenotipo de un organismo a través de la introducción de ADN foráneo al genoma. En plantas esta técnica ha avanzado vertiginosamente, con el objeto de lograr mayor conveniencia y eficiencia, en un rango de genotipos más amplio y de características moleculares deseadas en las plantas transformadas. En la base de la biotecnología agrícola contemporánea, existe un rango considerable de técnicas y herramientas disponibles que varían ampliamente en sofisticación y en el tiempo necesario para producir resultados, estas técnicas en su mayoría parten del aislamiento de células, tejidos y órganos de plantas y el crecimiento de estos bajo condiciones in vitro, en la actualidad existen dos tipos de técnicas básicas, la primera introduce el ADN a las células vegetales usando un vector plasmidico Ti (Agrobacterium), una bacteria que infecta los tejidos vegetales, modifica el genoma de estas y provoca crecimientos tumorosos. La otra técnica involucra la introducción directa de ADN desnudo usando distintos métodos, como el bombardeo de partículas, la electroporación o mediada por glicol polietilénico (PEG). Todas estas técnicas que convergen en la ingeniería genética conllevan a obtener Organismos Genéticamente Modificados (OGM); a usar marcadores moleculares y sondas para el mapeo de genes y la identificación clara de genotipos a través de la secuenciación de DNA. PALABRAS CLAVES: Transformación vegetal, biotecnología agrícola, vector plasmidico Ti, electroporación, PEG, OGM. 1 M.V. Docente facultad de ciencias agrarias, Universidad de Pamplona.

2 Métodos de transformación en plantas 2 ABSTRACT Plant transformation is defined in a strict sense as the process of changing of the phenotype of an organism by introducing foreign DNA to the genome. In plants this technology has advanced rapidly, in order to achieve major convenience and efficiency, in a wider range of genotypes and molecular characteristics desired in the transformed plants. contemporary agricultural biotechnology, there exists a considerable range of technologies and available tools which vary greatly in sophistication and in the necessary time to produce results, These techniques usually start with the isolation of cells, tissue and organs of plants and the growth of those under in vitro conditions, At present there exist two types of basic techniques exist. The first one introduces DNA to plant cells using a plasmid vector Ti (Agrobacterium), a bacteria that infects the plant tissues; it modifies the genome of these and provokes tumour growth Another technique involves the direct introduction of isolated DNA using different methods, as the bombardment of particles, the electroporation or happened for glycol polyethylene (PEG). All these techniques that converge on the genetic engineering bear to obtain Genetically Modified Organisms(GMO); by using molecular markers and sounds for the gene mapping and the clear identification of genotypes trough DNA sequencing. KEY WORDS: Plant transformation, agricultural biotechnology, plasmid vector Ti, electroporation, PEG, GMO.

3 Métodos de transformación en plantas 3 Introducción El mejoramiento vegetal se originó aproximadamente hace años, cuando el hombre se hizo agricultor y comenzó la domesticación de las plantas, el traspaso del material genético de interés de un individuo a otro, fue incentivado por las considerables perdidas económicas de $30-$50 billones anuales por causa de los daños por fitopatogenos en los cultivos o cosechas almacenadas (Baker et al., 1997). Además la aplicación de los pesticidas no solo incrementa significativamente los costos también son considerados como un serio peligro ambiental, pero también contribuyen a la resistencia antimicrobial de las especies (Khan et al., 2006). La transgénesis vegetal partió del principio de que el código genético es universal y la información contenida en los genes es interpretada de la misma manera en todos los seres vivos esto hizo posible pensar en la producción de organismos transgénicos. Popelka 2004 afirmó que la transferencia de genes incorpora una información definida desde un organismo vivo a un nuevo huésped y pueden ayudar a proveer soluciones a muchos problemas que afectan la producción vegetal. Este mejoramiento genético se basa en principios de existencia de variabilidad genética a través de los caracteres que se pretenden mejorar y la reproducción sexual para incorporación de los mismos. La transformación en plantas se empezó a trabajar en el siglo XX, a partir del experimento de Broglie et al. (1984), En el cual un callo de petunia expresó un gen de guisante y se demostró que los genes introducidos pueden expresarse en células transformada, la incorporación de cruzamientos sexuales, el conocimiento de la biología floral de las especies y los avances de la genética y la estadística experimental influyeron en el desarrollo de las técnicas contemporáneas de mejoramiento genético en plantas. En la actualidad se utilizan técnicas y herramientas que convergen en la ingeniería genética y la tecnología del ADN recombinante, estas nos permiten modificar en un solo gen el patrimonio genético de una variedad de cultivo obtenida por técnicas de mejora tradicionales, permitiéndonos cambiar el fenotipo de un organismo a través de incorporación de un ADN foráneo en su genoma. Métodos para la transformación vegetal La transformación genética en plantas presenta varios métodos que permiten la introducción e integración de ADN foráneo en el genoma y así poder seleccionar eficientemente las células transformadas permitiendo la regeneración completa de las células transformadas, este ADN puede ser introducido a nuestra planta de interés de diferentes formas, Agrobacterium tumefaciens, o directamente, por bombardeo con partículas, por microinyección (Neuhaus y Spangenberg,1990), el método mas comúnmente utilizado hace uso de un sistema de transferencia de ADN que ocurre naturalmente. Este sistema está basado en una bacteria del suelo denominada Agrobacterium que transfiere a través de su factor plasmidico inductor de tumores (Ti) una porción específica de su ADN a las células de algunas especies de

4 Métodos de transformación en plantas 4 plantas modificándoles su genoma. Otro método es el conocido como biolística o método de ADN libre, usa una pistola para disparar partículas microscópicas de oro o tungsteno dentro de células vegetales cultivadas. Las partículas se cubren primero con el ADN que acarrea el gen de interés, aislado de la bacteria en la cual fue clonado., también es ampliamente usada la electroporación (Fromm et al., 1986, Lindsey y Jones, 1990) o las técnicas mediadas por glicol polietilénico (PEG) (Potrykus, 1990). 1. Agrobacterium tumefaciens Chilton et al. (1977) Evidenciaron la presencia de un pequeño fragmento de ADN de la bacteria Agrobacterium tumefaciens a nivel de lesiones tumorales axénicas de la agalla de la corona del tabaco, de esta forma se demostró la capacidad de esta bacteria de transferir información genética de un organismo a otro, A. tumefaciens es el único organismo natural capaz de transformar genéticamente una célula vegetal (Zupan y Zambryski, 1995). Agrobacterium tumefaciens es una bacteria presente en el suelo que causa la enfermedad conocida como agalla, se caracteriza por el crecimiento de neoformaciones en los tejidos vegetales. Esos crecimientos tumorales son la integración estable en el genoma vegetal de un segmento de ADN, ADN-T (ADN transferido), proveniente de un vector plásmidico, Ti (plásmido inductor de tumor), el cual está presente en un pequeño porcentaje de las poblaciones naturales de A. tumefaciens. (Zupan y Zambryski, 1995). La caracterización molecular de estos plásmidos, el proceso de transferencia y las causas de la sintomatología que producen han sido estudiadas con gran detalle (Drapper y scout, 1991; Zupan et al., 2000) Los genes El ADN-T está delimitado por repeticiones directas de 25 pares de bases, y cualquier ADN entre estos bordes será transferido al ADN de la célula vegetal. Este ADN puede integrarse en diferentes lugares en el cromosoma vegetal (Stam et al., 1997), ADN-T tienen dos tipos de genes, oncogénicos codificados por enzimas presentes en la síntesis de auxinas y citoquinas responsables de la formación tumoral; y los genes que codifican para la producción de opinas, productos resultantes de la condensación de aminoácidos y azucares (Opabode 2006) estos derivados de los aminoácidos son aprovechados por las bacterias (Valderrama et al., 2005) al ser excretados por la corona de las células de la agalla, y son consumidas como fuente de carbón y nitrógeno (Opabode 2006) Para lograr esta trascripción, el ADN-T contiene secuencias eucarióticas de control como las cajas TATA y CAAT y señalas vegetales de poliadenilación (McLean, 1998). Dentro del plásmido Ti encontramos los genes vir importantes en la transferencia e incorporación del ADN en el genoma de la planta (Valderrama et al., 2005). La región vir esta compuesta por 30kb, organizada por seis operones esenciales en la transferencia de ADN-T (vira,virb,vird,virg) o para incrementar la eficiencia en la transferencia (virc y vire) (Zupan y Zambryski, 1995; Jeon et al., 1998). La proteína vira detecta los compuestos fenólicos secretados

5 Métodos de transformación en plantas 5 por las células heridas y provoca la fosforilación de la proteína virg, provoca una cascada de trascripción de las demás proteínas vir, que se encargan, a través de un proceso aún no completamente caracterizado, de la transferencia e integración del ADN-T (Zupan y Zambryski, 1995, McLean, 1998). Se han observado tumores de Agrobacterium bajo condiciones naturales en 643 especies en 331 géneros de dicotiledóneas y gimnospermas (McLean, 1998). Este A. tumefaciens junto con las especies A. rhizogenes y A. vitis son patógenos reconocidos de las plantas y tienen la capacidad de integrar establemente parte de su material genético dentro del genoma de su hospedero (Tzfira y Citovsky 2000). Las monocotiledóneas no se generalmente susceptibles a A tumefaciens, Aunque se ha logrado la transferencia de genes a especies de monocotiledóneas de importancia económica como el arroz (Cheng et al., 1998), el banano (May et al., 1995) el maíz (Ishida et al., 1996), el trigo (Cheng dicotiledonias y monocotilidoneas transformadas por A. tumefaciens. (Tomado de Opabode 2006). Tzfira y Citovsky 2000 describen siete eventos fundamentales para que exista una buena interacción entre A. tumefaciens y la planta; I reconocimiento y adherencia, II identificación de las señales de las plantas, III activación de los genes vir, IV generación del ADN-T, V exportación del ADN-T a la planta, VI importación del ADN-T al núcleo de la planta, VII integración del ADN-T en el genoma del hospedero. Table 1. Transformación mediada por Agrobacterium de algunas plantas dicots TF-frecuendia de transformación; nptii-neomicina fosfotransferasa; CN-nodo cotilodenario;ec-callo embrionario; MP-protoplasma mesófilo; H Hypocotyl; IS-segmento internodal. et al., 1997) y la caña de azucar (Arencibia et al., 1998). En las tablas 1 y 2 se observan las plantas Host plant Strain plasmid marker Explant TF(%) Reference Pigeon pea (Cajanus cajan L.) ICP787 LBA4404 (pdhdps-gus) nptii CN 93.2 Thu et al.2002 Broad be an (Vicia faba L.) Lobab C58C1 (para4b) none IS 92.5 Jelenic et al.2000 lippoi Canola (Brassica napus L.) Westars GV3850 (pbinmgfp5-er) nptii H 17.0 Cardoza and Stewart 2003 Maplus GV3850 (pnk55-resy.kcs) nptii MP 25.0 Wang et al.2005 Chickpea (Cicer arientum L.) Semsen AGL1 (prm50) nptii CN 0.5 Sarmah et al.2004 Soybean (Glycine max L. Merill) Lambaré LBA4404 (pcambia 1303) hpt CN 16.4 Olhoft et al.2003 Cotton (Gossypium hirsutum) Ekang 9 LBA4404 (pbin438) nptii EC 33.0 Wu et al.2005

6 Métodos de transformación en plantas 6 Table 2. Transformación mediada por Agrobacterium de algunas plantas monocotiledoneas Host plant Strain plasmid marker Explant TF(%) Reference Banana (Musa spp.) Grand Nain (AAA) LBA4404 nptii MCS 2.0 May et al (pbi141) Barley (Hordeum vulgare L.) Winter (igri) LBA4404 (psbi: hpt PC 2.2 Kumlehn et al.2006 VG35PAT) Rice (Oryza sativa L.) Indica (basmati 370) EHA101 hpt EC 22 Rashid et al.1996 (pigi21hm)) Japonica (Taipei 309) LBA4404 (ptok233) hpt PCIE 3.0 Uze et al.1997 Rye (Secale cereale L.) Spring (L22) AGLO (pjfnptii) nptll PCIE 3.5 Popelka and Altpeter,2003 Sugarcane (Saccharium officinarium L.) Ja60-5 LBA4404 (pbi141) hpt SC Arencibia et al.,1998 Sorghum (Sorghum bicolor L.) C401 EHA101 (ppzp201) pmi IE 3.3 Gao et al Pioneer 8505 EHA101 (ppzp201) pmi IE 2.8 Gao et al.2005 Maize (Zea mays L.) A188 EHA101 (ptf102) Bar FIIE 5.5 Frame et al.2002 A188 LBA4404 (ptok233) hpt FIIE Ishida et al.1996 Wheat (Triticum aestivum L.) Spring(Bobwhite) ABI (pmon18365) nptii EC 10.5 Cheng et al.2003 Winter(Candenza) AGLI (pal151) Bar IE 1.7 Wu et al.2003 TF- Frecuencia de transformación; nptii-neomicina fofotransferasa; hpt-hygromycina fosfotranferasa; pmi-fosfo manosa isomerasa; Bar-bialafos-gen resistente ; PCIE- precultura de embrión inmaduro; EC-callo embriogénico; FIIE- embrión inmaduro recién aislado; SC- cultura de suspensión; IE - embrión inmaduro; MCS Meritemcorn slice; PC-cultura de Polen 1.1 Métodos de transformación mediada por Agrobacterium Existen diversos métodos para la transformación con Agrobacterium, todo esto depende de la especie tratada y su resistencia a la infección y al cultivo in vitro. Es mejor establecer primero las condiciones para la transferencia de genes y luego trabajar en la regeneración de las células transformadas (Birch, 1997). El laboratorio de Monsanto trabajó inicialmente con la metodología (Fraley et al., 1983, Horsch et al., 1985, Broglie et al., 1984) regeneraba las plantas transformadas a partir de protoplastos. Un método que se volvió estándar es el de los discos foliares (Horsch et al., 1985). Aquí se trabaja con discos de 6 mm de hojas de tabaco esterilizadas y se sumergen en un cultivo de A. tumefaciens en caldo luria. Los discos se ponen al revés en platos de cultivo con un medio que estimula brotes a partir de las células foliares y después de 2 o 3 días, los discos son pasados a platos petri con un medio que contiene carbenicilina y kanamicina, las plantas transformadas que incorporaron el gen NOS-NPTII- NOS de resistencia a la kanamicina. Después de cuatro semanas más tarde, los brotes que

7 Métodos de transformación en plantas 7 crecieron fueron separados de los callos y transplantados a otro medio inductor de raíces con carbenicilina y kanamicina y de ahí a suelo. Es importante que el material vegetal tenga heridas que estimulen la infección por Agrobacterium. Además puede optimizarse con el uso de inductores de genes vir tales como la acetosiringona o extractos de células heridas (Birch, 1997). También se han obtenido mutantes de Arabidopsis thaliana resistente a la transformación con Agrobacterium con los cuales se espera entender el papel de los genes y las proteínas de las plantas que median el proceso de transformación (Zhu et al., 2003). Además se ha usado en conjunto con técnicas de embriogénesis somática en regeneración de árboles tropicales como Azadirachta excelsa (Morimoto 2006). 1.2 Pruebas utilizadas para la detección de mutantes Se requieren pruebas genotípicas, a través de un análisis Southern utilizando sondas para los genes introducidos y enzimas de restricción que generen fragmentos de hibridización de diferentes longitudes en diferentes sitios de integración (Birch, 1997). Se puede confirmar analizando bandas amplificadas con PCR (Rao y Rohini, 1999). Además una prueba fenotípica que muestre la expresión estable de los genes introducidos en las plantas que resultan positivas en la prueba anterior, mas no en los controles sin transformar. En muchos casos se utiliza el gen reportero de la b-glucuronidasa o GUS (uir A) con un promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), el cual puede ser detectado con medios espectrofluorofotométricos o histoquímicos. Se asume que a la hora de aplicar el método con fines prácticos, el gen reportero puede ser reemplazado por un gen de interés económico o científico. El uso de esta bacteria como herramienta en ingeniería genética de plantas ha proporcionado cimientos en la formulación de modelos de señalización celular, transporte de célula a célula, importe nuclear de proteínas y ADN y mecanismos de integración genómica (Tzfira y Citovsky 2000). 2. Método directo de transformación biolístico. Estos métodos físicos tienen la capacidad de introducir ADN foráneo en cualquier célula o tejido vegetal y cuentan con un único y exclusivo interés de proteger al vector de la degradación mecánica y enzimática. Potrycus y Spangenberg (1995) afirma que algunos de estos métodos están limitados al uso en células que se encuentran formando un tejido. 2.1 Transformación por bombardeo con partículas biolística El bombardeo de partículas para la introducción de ADN en las células fue introducido en 1987 por Sanford y sus colaboradores con el nombre de biolística balística biológica (Rusell et al., 1992). Este método transforman células completas de un órgano o tejido a partir de un bombardeo con micro proyectiles de oro o tungsteno (1,3µm) estos están recubiertos de nuestro ADN de interés, estas partículas son

8 Métodos de transformación en plantas 8 aceleradas por cargas explosivas y descargas eléctricas, expansión de gases inertes a alta presión (helio), o aire comprimido (Christou y Yang, 1994). 2.2 Ventajas de la biolística Con un exceso de optimismo se propuso el bombardeo de partículas como una manera de eliminar el uso de Agrobacterium (Klein et al., 1988). Este método actualmente es el más usado en especies en las que la transformación con Agrobacterium tumefaciens es renuente. Entre las ventajas del bombardeo de partículas, por ser un método físico, no discrimina el tipo de célula blanco y ha sido utilizado no sólo para introducir ADN exógeno a células vegetales, sino a células de una gran variedad de organismos tales como bacterias, algas, hongos, células animales, y aún animales y plantas intactas. Birch (1997) menciona que se ha logrado introducir hasta 12 plásmidos separados y 600 kilobases de ADN 2.3 Limitaciones de la biolística Klein et al., (1988) uso partículas de tungsteno aceleradas con un dispositivo a base de pólvora. La utilización de esta metodología biolística provoca un trauma a nivel celular por el impacto del gas el shock acústico además de la toxicidad del tungsteno reduciendo la eficiencia de la recuperación de la planta con transformación estable. Sin embargo La técnica fue mejorada usando partículas de oro y un acelerador de partículas con flujo de helio (Kim y Minamikawa, 1996). Algunos problemas asociados con la biolística como método para la transformación vegetal incluyen la frecuente integración de múltiples copias de los transgenes (Birch, 1997) y la dificultad de superar la etapa de expresión transiente y lograr integración estable (Potrykus, 1990). Otras limitantes son la resistencia natural a la penetración de las partículas, dada por cutículas endurecidas, paredes celulares lignificadas o superficies vellosas y la baja relación entre el total de células sometidas al bombardeo y el número de células que logran incorporar de manera permanente la información genética transferida, como así también la alta frecuencia de múltiple inserción de copias del transgén o re-arreglos del mismo, dentro del genoma vegetal. 3. Aplicaciones para la investigación En la actualidad La aplicación de estas tecnologías para la investigación son diversas. En la investigación aplicada, la inserción de genes específicos en cultivos de uso agrícola permite la obtención de fenotipos deseables en mucho menos tiempo que con los métodos tradicionales investigar en esta área de la biotecnología agrícola es complicado por el hecho de que muchos de los rasgos de una cosecha son codificados no por un gene sino por muchos genes que trabajan juntos. Los métodos de transformación vegetal permiten insertar genes específicos (gen de interés) en el genoma de una planta, los investigadores utilizan estas técnicas como una herramienta singular para el estudio de la expresión de genes y de la fisiología vegetal. Se hizo posible así la

9 Métodos de transformación en plantas 9 validación directa de hipótesis que habían sido imposibles o muy difíciles de resolver utilizando otros métodos (Birch, 1997). Potrykus (1990) cita algunas las áreas sobre las que se ha obtenido información gracias al uso de la transformación vegetal, incluyendo conocimientos sobre promotores, mejoradores, silenciadores, terminadores y secuencias regulatorias con especificidad de órgano, tejido o etapa de desarrollo, al igual que sobre elementos de actividad cis que responden a luz, temperatura, patógenos o heridas otras áreas en que se ha trabajado es en estudios de regulación de fotosíntesis (Dai et al y Heineke et al., 1999), Estudio de los mecanismos de defensa (Ryals et al., 1994), Introducción de genes para la inspección visual de procesos moleculares (Liang et al. 1989) y El silenciamiento genético (Stam, et al., 1997 ; Kooter et al., 1999 y Waterhouse,1999). Conclusiones La biotecnología aplicada incursiona con fuerza cada día mas en el ámbito agrícola, esto depende en su medida de las necesidades de la comunidad mundial, Por lo tanto, una necesidad primaria es identificar todos los genes que funcionen como un sistema para expresar una característica particular. Este conocimiento se puede entonces aplicar a alterar las líneas germinales de los cultivos alimenticios comercialmente importantes. Una exitosa transferencia de genes y de uso de la ingeniería genética o técnicas de ADN recombinante requiere de la identificación del gen o grupo de genes que controla caracteres económicamente ventajosos y su aislamiento. Las técnicas de DNA recombinante son utilizadas para la producción de individuos transgénicos, e incluyen aislamiento, clonación, recombinación y reinserción de material genético por varios métodos. Variedades transgénicas en cultivos alimenticios han sido liberadas con genes incorporados para resistencia a herbicidas, cambios medioambientales, insectos o virus. En la actualidad los métodos de la ingeniería genética para mejorar la fruta y plantas van encaminados a resaltar características tales como gusto, la textura, el tamaño, el color, la acidez o el dulzor, y el proceso de maduración, se están explorando como estrategia potencialmente superior al método tradicional de cruce. Este procedimiento requiere éxito en muchas áreas: clonación de genes y secuenciación, desarrollo de vectores de genes adecuados para células vegetales, transferencia exitosa de los genes, expresión de genes, estabilidad genética y transmisión de genes a través de la subsiguiente reproducción sexual. Aunque las herramientas de la ingeniería genética están disponibles, se requiere más conocimiento de la biología molecular de plantas. La obtención de cultivos mejorados a través de la ingeniería genética es el resultado de un esfuerzo de grupo que incluye por lo menos un biólogo celular y molecular, especialistas en cultivo de tejidos vegetales y mejoradores. Estas técnicas se refinan día a día, son mas la especies de plantas que lograr integrar y expresar genes foráneos con intereses económicos o investigativos.

10 Métodos de transformación en plantas 10 Referencias Biliograficas ARENCIBIA, A. et al En efficient protocol for sugarcane (Saccharum spp. L) transformatiom mediated by Agrobacterium tumefaciens. En transgenic Research. Vol. 7. p BAKER, B., ZAMBRYSKI, P., STASKAWICZ, B. and DINESHKUMAR, S.P Signaling in plant-microbe interactions. Science 267: BIRCH, R.G Plant transformation: problems and strategies for practical application. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 48: BROGLIE, R., CORUZZI, G., FRALEY, R. T., ROGERS, S. G., HORSCH, R. B., NIEDERMEYER, J. G., FINK, C. L., FLICK, J. S. y CHUA, N. H Light-regulated expression of a pea ribulose-1,5- bisphosphate carboxilase small subunit gene in transformed plant cell. Science 224: CHENG, X.Y. et al. Agrobacteriumtransformed rice expressing synthetic cry1ab and cry1ac genes are highly toxic to striped stem borer and yellow sterm borer En: Procceedings of the National Academy of Sciences USA. Vol.95 p CHENG M. et al Genetic transformation of wheat mediated by Agrobacterium tumefaciens.. En plant Physiology. Vol. 115 p CHILTON, M. D. et al Stable incorporation of plasmid DNA into higher plant cells: the molecular bases of gall tumorigenesis. Cell 11, No 2: Christou, J., Yang, N.S Particle bombardment technology for gene transfer. Oxford University press. Draper, J., Scout, R Gene transfer to plants. In: Plant Genetic Engineering. Plant Biotechnology Series. Vol. I (Grierson, D., ed.) Blackie/Chapman and Hall, pp FRALEY, R. T., ROGERS, S. G., HORSCH, R. B., SANDERS, P.R., FLICK, J. S., ADAMBS, S. P., BITTNER, M. L., BRAND, L. A., FINK, C. L., FRY, J. S., GALLUPPI, G. R., GOLDBERG, S. B., HOFFMANN, N. L. y WOO, S. C Expression of bacterial genes in plants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: FROMM, M. E., TAYLOR, L. P. y WALBOT, V Stable transformation of maize after gene transfer by electroporation. Nature 319: HEINEKE, D., KAUDER, F., FROMMER, W., KÜHN, C., GILLISSEN, B., LUDEWIG, F. y SONNEWALD, U Application of transgenic plants in understanding responses to atmospheric change. Plant, Cell and Environment 22: HORSCH, R. B., FRY, J. E., HOFFMANN, N. L., EICHHOLTZ, D., ROGERS, S. G. y FRALEY, R. T A simple and general method for transferring genes into plants. Science 227: ISHIDA, Y. et al High efficiency transformation of maize (Zea mayz L.) metiated by Agrobacterium tumefaciensen: Nature Biotechnology. Vol. 4 p JEON, G.A., and EUM JSSIM, W.S The repeat

11 Métodos de transformación en plantas 11 (IR) sequence of the viregene expression in Agrobacterium tumefaciens ptiag. Molecules and cell 8:49-53 KHAN, R.S., NISHIHARA, M., YAMAMURA, S., NAKAMURA, I. and MII, M Transgenic potatoes expressing wasabi defensing peptide confer partial resistance to gray mold (Botrytis cinerea). KIM, J. W. y MINAMIKAWA, T Transformation and regeneration of French bean plants by the particle bombardment process. Plant Science 117: KLEIN, T. M., HARPER, E. C., SVAB, Z., SANFORD, J. C., FROMM, M. E. y MALIGA, P Stable genetic transformation of intact Nicotiana cells by the particle bombardment process. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: KOOTER, J. M., MATZKE, M. A. y MEYER, P Listening to the silent genes: transgene silencing, gene regulation and pathogen control. Trends in Plant Science 9: LIANG, X., DRON, M., SCHMID, J., DIXON, R. A. y LAMB, C Developmental and environmental regulation of a phenylalanine ammonia-lyase-b-clucuronidase gene fusion in transgenic tobacco plants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: LINDSEY, K. y JONES, M. G. K Electroporation of cells. Physiologia plantarum 79: MAY, G.D. et al Generations of transgenic banana (Musa acuminata) plants via Agrobacterium- mediated transformation. En: Biotechnology. Vol. 13 p McLEAN, P Agrobacteriummediated Transformation. mcclean/plsc731/transgenic/transge nic3.htm. MORIMOTO, M. NAKAMURA,K Y SANO,H Regeneration and genetic Engineering of a tropical tree, Azaridachta excelsa., Plant Biotechnology 23: NEUHAUS, G. y SPANGENBERG, G Plant transformation by microinjection techniques. Physiologia Plantarum 79: OPABODE, J Agrobacteriumtransformation of plants: emerging factors that influence efficiency. Biotechnology and molecular biology review 1, No 1: POTRYKUS, I Gene transfer to plants: assessment and perspectives. Physiol. Plant. 79: POPELKA, J C, TERRYN, N AND HIGGINS T Gene technolofy for grain legumes: can it contribute to the food challenge in developing countries? Rao KS, Rohini VK, Agrobacterium mediated transformation of sunflower (Helianthus annuus L.) a simple protocol. Ann Bot 83; RYALS, J., UKNES, S. y WARD, E Systemic Acquired Resistance. Plant Physiology 104: RUSELL, J. A, ROY, M.K. SANFORD, J.C Physical trauma and tungsten toxicity reduce the efficiency of biolistic transformation. Plant Physiology. V98. p

12 Métodos de transformación en plantas 12 Sanford, J.C The Biolistic Process - a new concept in gene transfer and biological delivery. Trends Biotechnol. 6: STAM, M., MOL, J. N. M. y KOOTER, J. M The silence of genes in transgenic plants. Annals of Botany 79:3-12. TZFIRA, T., and CITOVSKY, V From bost recognition to T- DNA integration: the function of bacterial and plant genes in the Agrobacterium-plant cell integration. Molecular plant pathology 1, No 4: VALDERRAMA, A. M., ARANGO, R. Y AFANADOR, L Trasformación DE plantas mediadas por Agrobacterium Ingeniería genética natural aplicada. Nal Agr: Medellín 58, No 2: ZHU, y. et al. Identification of Arabidoesis vat mutants Plant Physiology 132, No2: ZUPAN, J. R. y ZAMBRYSKI, P Transfer of T-DNA from Agrobacterium to the plant cell. Plant Physiology 107: Zupan, J.R. Ruth, T.R., Draper. O., Zambryski, P The transfer of DNA from Agrobacterium tumefaciens into plants: a feast of fundamental insights. Plant J. 23,