11 knúmero de publicación: kint. Cl. 7 : G01N 33/573. k 72 Inventor/es: Stenman, Ulf-Hakan y

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1 k 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 knúmero de publicación: kint. Cl. 7 : G01N 33/573 k 12 TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA T3 k k k k 86 Número de solicitud europea: Fecha de presentación: Número de publicación de la solicitud: Fecha de publicación de la solicitud: k 54 Título: Determinación de tripsinógeno-2 libre y en forma de complejo. k 30 Prioridad: FI k 73 Titular/es: Ulf-Hakan Stenman Heikelsvägen Grankulla, FI k 45 Fecha de la publicación de la mención BOPI: k 72 Inventor/es: Stenman, Ulf-Hakan y Hedström, Johan k 45 Fecha de la publicación del folleto de patente: k 74 Agente: Díez de Rivera de Elzaburu, Alfonso ES T3 Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, Madrid

2 DESCRIPCION Determinación de tripsinógeno-2 libre y en forma de complejo Esta invención se refiere a un método para diferenciar entre pancreatitis y otras enfermedades pancreáticas por una parte, y entre pancreatitis y las enfermedades gastrointestinales no pancreáticas por otra, mediante la determinación, bien del tripsinógeno-2 libre en orina o bien de la tripsina-2 conjugada con alfa-1-antitripsina (tripsina-2-aat) en suero. Antecedentes de la invención Los tripsinógenos son serín proteasas secretadas por células exocrinas del páncreas (Travis J y Roberts R, Biochemistry 1969; 8: ; Mallory P y Travis J, Biochemistry 1973; 12: ). Se han caracterizado dos tipos principales de isoenzimas del tripsinógeno, el tripsinógeno-1, también llamado tripsinógeno catiónico, y el tripsinógeno-2 o tripsinógeno aniónico. Las proenzimas del tripsinógeno se activan para dar tripsinas en el intestino por acción de la enteroquinasa, que elimina un péptido de activación del extremo N-terminal de los tripsinógenos. Los tripsinógenos presentan un alto grado de homología de secuencia, pero pueden ser separados basándose en su diferencia de cargas mediante electroforesis o cromatografía de intercambio iónico. La forma mayoritaria de tripsinógeno en el páncreas y en el jugo pancreático es el tripsinógeno-1 (Guy CO et al., Biochem Biophys Res Commun 1984; 125: ). En el suero de sujetos sanos, el tripsinógeno-1 también es la forma mayoritaria, mientras que en pacientes con pancreatitis, el tripsinógeno-2 está mucho más elevado (Itkonen et al., J Lab Clin Med 1990; 115: 712-8). Los tripsinógenos también aparecen en determinados tumores de ovario, donde la forma mayoritaria es el tripsinógeno-2 (Koivunen et al., Cancer Res 1990; 50: ). La tripsina-1 complejada con la alfa-1-antitripsina, también llamada alfa-1-antiproteasa, se ha encontrado en suero de pacientes con pancreatitis (Borgstrom A y Ohlsson K, Scand J Clin Lab Invest 1984; 44: 381-6), pero la determinación de este complejo ha resultado no ser útil para diferenciar entre enfermedades pancreáticas y otras enfermedades gastrointestinales (Borgstrom et al., Scand J Clin Lab Invest 1989; 49: ). El tripsinógeno-1 y el tripsinógeno-2 están estrechamente relacionados desde el punto de vista inmunológico (Kimland et al., Clin Chim Acta 1989; 184: 31-46; Itkonen et al., 1990), pero empleando anticuerpos monoclonales (Itkonen et al., 1990) o por absorción con antisueros policlonales (Kimland et al., 1989), es posible obtener reactivos que permitan realizar mediciones específicas de cada forma de tripsinógeno. Cuando la tripsina activa alcanza la circulación sanguínea, es inactivada por los principales inhibidores de la tripsina, la alfa-2-macroglobulina y la alfa-1-antitripsina (AAT). La AAT es un inhibidor de serín proteasas de 58 kilodalton sintetizado en el hígado, y es uno de los principales inhibidores de proteasas en sangre. Mientras que los complejos entre la tripsina-1 y la AAT son detectables en suero (Borgstrom y Ohlsson, 1984), los complejos con la alfa-2-macroglobulina no son medibles con ensayos basados en anticuerpos (Ohlsson K, Acta Gastroenterol Belg 1988; 51: 3-12). La pancreatitis aguda es una enfermedad grave y potencialmente letal que requiere un diagnóstico rápido. Para este propósito se emplean rutinariamente las determinaciones de amilasa en suero o en orina, pero estos métodos tienen el inconveniente de la falta de especificidad, que limita su utilidad clínica. Por ello, el empleo de otros marcadores pancreáticos, por ejemplo proteasas y lipasas, ha ganado interés (Ogawa et al., Nippon Geka Gakkai Zassshi 1985; 86: ). La determinación de tripsinógeno-1 y -2 en suero (Itkonen et al., 1990) y de tripsinógeno-1 en orina (Lake-Bakaar et al., Lancet 1979; ii: ) se han usado también para el diagnóstico de las enfermedades pancreáticas. En la presente invención se ha demostrado que los pacientes con enfermedades pancreáticas tienen concentraciones muy elevadas de tripsinógeno-2 complejado con alfa-1-antitripsina en suero, y de tripsinógeno-2 libre en orina. Por ello, este descubrimiento ha demostrado ser muy útil en el diagnóstico de la pancreatitis. Breve descripción de los dibujos Figura 1: Presenta la caracterización del complejo tripsina-2-alfa-1-antitripsina en el calibrador por filtración en gel. La elución de la inmunoreactividad del tripsinógeno-2 se muestra para comparación. Las flechas indican las posiciones de elución para la IgG y la albúmina. Figura 2: Presenta la curva de respuesta a la dosis para el ensayo inmunofluorométrico del complejo tripsina-2-alfa-1-antitripsina con el calibrador empleado. 2

3 Figura 3A: Presenta la concentración de tripsinógeno-2 en muestras de suero de 120 controles sanos, 11 pacientes con obstrucción biliar extrahepática, 34 pacientes con trastornos abdominales agudos de origen extrapancreático y 29 pacientes con pancreatitis aguda. Las líneas horizontales indican los límites de referencia superiores. Figura 3B: Presenta la concentración del complejo tripsina-2-alfa-1-antitripsina y de la amilasa sérica en los mismos pacientes de la figura 3A. Figura 4: Muestra una representación gráfica característica del funcionamiento del receptor (ROC)de tripsina-2-aat, tripsinógeno-2 y amilasa en suero de 29 pacientes con pancreatitis aguda. Los pacientes con trastornos abdominales agudos de origen extrapancreático se emplearon como grupo control. Se indican los valores de varios puntos de corte. La figura demuestra que la tripsina-2-aat tiene la mejor capacidad de discriminación entre pancreatitis y trastornos abdominales agudos no pancreáticas. Figura 5: Presenta la concentración de tripsinógeno-2 y amilasa en muestras de orina de 46 pacientes con trastornos abdominales agudos de origen extrapancreático y de 22 pacientes con pancreatitis aguda. La figura demuestra que el tripsinógeno-2 en orina tiene la mayor exactitud diagnóstica. Figuras 6A-6D: Muestran las concentraciones de tripsinógeno-2 y amilasa en muestras de orina y suero de pacientes con pancreatitis leve (I) y con pancreatitis grave (II). Los pacientes con trastornos abdominales agudos de origen extrapancreático sirven como controles (AC) HC = controles sanos. La línea discontinua horizontal indica el límite de referencia superior. Figuras 7A-7B: Ilustran diagramas ROC que muestran la capacidad de diversos ensayos para diferenciar entre la pancreatitis aguda y las enfermedades gastrointestinales extrapancreáticas (Figura 7A), y entre la pancreatitis aguda grave y leve (Figura 7B). Descripción detallada de la invención Los rasgos característicos de la invención se presentan en la reivindicación 1. La invención se refiere a métodos para diferenciar entre la pancreatitis y otras enfermedades pancreáticas por una parte, y entre pancreatitis y enfermedades no pancreáticas por otra parte, bien basándose en la determinación de la concentración de tripsina-2-aat en suero, o bien en la concentración de tripsinógeno-2 en orina. Pueden usarse métodos de ensayo competitivos o no competitivos. De acuerdo con una realización preferible, el complejo de tripsina-2-aat o el tripsinógeno-2 libre se miden mediante métodos no competitivos empleando al menos dos anticuerpos diferentes, estando el anticuerpo de captura fijado a una fase sólida. Son marcadores adecuados, por ejemplo, las enzimas, radioisótopos, marcadores fluorescentes, fosforescentes o luminiscentes y partículas coloreadas que sean visibles o detectables. Se debe entender que la palabra marcador también incluye un sitio de unión capaz de unirse a los marcadores mencionados. La invención se describirá mediante los siguientes ejemplos no restrictivos. Materiales empleados en los ejemplos descritos a continuación: Anticuerpos monoclonales Los anticuerpos monoclonales se produjeron en ratones mediante procedimientos convencionales. Se analizó la especificidad de los anticuerpos por el tripsinógeno-2 (Itkonen et al., 1990) mediante tripsinógeno-1 y tripsinógeno-2 separados por cromatografía de intercambio iónico como se describe en la referencia (Koivunen et al., 1990). 2. Reactivos y tampones El antisuero policlonal contra la AAT fue obtenido en Dako (Glostrup, Dinamarca). El tampón de reacción empleado en el ensayo inmunofluorimétrico (IFMA) fue Tris-HCl 50mM, ph 7,7, con 9 g/l de NaCl (TBS) que contenía, por litro, 5 g de albúmina de suero bovino, 0,15 g de globulina bovina y 0,5 g de NaN 3.Lasolución de lavado contenía, por litro, 9 g de NaCl, 0,5 g de NaN 3 y 0,2 g de Tween 20. La solución de amplificación procedía de Wallac Biochemical laboratories (Turku, Finlandia). 3

4 3. Muestras Las muestras de suero se obtuvieron de 29 pacientes con pancreatitis aguda, 11 pacientes con obstrucción biliar extrahepática y 34 pacientes con trastornos abdominales agudos de origen extrapancreático. Las muestras fueron extraídas en el plazo de las 24 horas del ingreso y antes de iniciar el tratamiento. El diagnóstico de pancreatitis aguda se basó en hallazgos clínicos y de laboratorio (amilasa sérica y de orina y CRP), según el criterio de Ranson (Ranson et al., Surg Gynecol Obstet 1974; 139: 69-80). El diagnóstico se confirmó mediante tomografía de contraste computerizada del páncreas. Los diagnósticos de la obstrucción biliar extrahepática y de los trastornos abdominales agudos de origen extrapancreático se basaron en métodos clínicos normales (clínica, laboratorio, ultraecografía y exámenes radiológicos o hallazgos quirúrgicos). Las úlceras gástricas y duodenales así como la esofagitis y la gastritis se diagnosticaron mediante endoscopia. Para establecer los valores de referencia se empleó el suero de 120 donantes obtenido del Banco de Sangre de la Cruz Roja Finlandesa. Todas las muestras se almacenaron a -20 C hasta el momento del análisis. 4. Filtración en gel El fraccionamiento del calibrador de la tripsina-2-aat se realizó por filtración en gel empleando una columna de 1 x 30 cm de Superdex 200 HR 10/30 (Pharmacia, Suecia) y tampón TBS para la elución. El caudal fue de 30 ml/h, y se recogieron fracciones de 0,5 ml de volumen. Los tubos se llenaron previamente con 50 µl deltampón de reacción que contenía aprotinina (1,0 mg/l) para prevenir la proteolisis y la adsorción inespecífica a los tubos. Los volúmenes de elución de la IgG (150 kd) y de la albúmina (69 kd) se emplearon para una calibración tosca de la columna. 5. Determinación de la amilasa La amilasa se midió mediante un ensayo colorimétrico enzimático usando un analizador automático (Hitachi 705E) y reactivos de Boehringer Mannheim. Los valores de referencia del método son U/l en suero y U/l en orina. Ejemplo 1 Preparación de tripsina-2-alfa-1-antitripsina (tripsina-2-aat) para su empleo como calibrador Se preparó un calibrador para el complejo tripsina-2-aat partiendo de AAT humana purificada (Sigma Chemical Co., St. Louis, USA) y tripsina-2 purificada como se ha descrito anteriormente (Itkonen et al., 1990) de la orina de un paciente con pancreatitis aguda. El tripsinógeno-2 se autoactivó a +37 C durante 2 h y entonces se incubó durante 16 h a +20 C con un exceso molar de siete veces de AAT en tampón TBS. La mezcla de incubación se separó por filtración en gel y se estimó el contenido de tripsinógeno-2 y tripsina-2-aat en las fracciones mediante un ensayo IFMA de tripsinógeno-2 (Figura 1). La incubación con AAT redujo la concentración de tripsinógeno-2 a un 6 % del contenido del control incubado con aprotinina. El porcentaje de reacción cruzada con la tripsina-2-aat en el ensayo IFMA del tripsinógeno-2 es del 3,3 % (Figura 1). Basándose en esto, se ha calculado que el 94 % de la tripsina-2 se complejó con AAT. Esta preparación se empleó para la calibración del ensayo de tripsina-2-aat. Los calibradores se prepararon diluyendo el complejo con tampón de reacción para que contuviera tripsina- 2-AAT a las concentraciones de 0,1, 0,5, 1,0, 10 y 100 µg/l. Ejemplo Ensayo inmunofluorimétrico no competitivo de tripsinógeno-2 y tripsina-2-aat El tripsinógeno-2 se determinó mediante un ensayo inmunofluorimétrico no competitivo de desarrollo temporal, usando dos anticuerpos monoclonales (Itkonen et al., 1990). El intervalo de referencia para el tripsinógeno-2 en suero fue de µg/l (mediana 39 µg/l). Para el ensayo de la tripsina-2-aat, se recubrieron los pocillos de una placa de microtitulación con un anticuerpo monoclonal de captura frente a la tripsina-2 (14F10) (Itkonen et al., 1990) que reaccionaba tanto frente al tripsinógeno-2 libre como frente al complejo tripsina-2-aat. Un anticuerpo policlonal de conejo frente a AAT (Dako, Dinamarca), marcado con un quelato de europio (Hemmilä et al., Anal Biochem 1984; 137: ), se empleó como anticuerpo detector. Se pipetearon 25 µl de muestra y 200 µl detampón de reacción en los pocillos recubiertos. Tras una incubación de una hora, se vaciaron los pocillos y se lavarondos veces con solución de lavado usando un lavador automático (DELFIA Platewash , Wallac, Turku, Finlandia). Se añadieron 200 ng de anticuerpo trazador en 200 µl detampón 4

5 de reacción y, después de una incubación de una hora, los pocillos se vaciaron y se lavaron cuatro veces. Se añadieron 200 µl desolución de amplificación y, después de 5 min, se midió la fluorescencia con un fluorímetro DELFIA 1234 (Wallac, Turku, Finlandia). La curva de respuesta a la dosis para el ensayo IFMA de la tripsina-2-aat se muestra en la figura 2. El límite de detección del ensayo fue de 0,05 µg/l, y la curva patrón era lineal para 100 µg/l. El intervalo de referencia determinado basándose en los percentiles 2,5 y 97,5 de 120 sueros de donantes de sangrefuede2,3-12µg/l, y el valor de la mediana fue 4,2 µg/l. Tripsina-2-AAT y tripsinógeno-2 en suero en el diagnóstico de la pancreatitis. Se estimó la eficacia clínica del ensayo en suero determinando las concentraciones de tripsina-2-aat, tripsinógeno-2 y amilasa en muestras de suero de pacientes con pancreatitis aguda, pacientes con obstrucción biliar extrahepática y pacientes con trastornos abdominales agudos de origen extrapancreático. En los pacientes con pancreatitis aguda, los niveles de tripsina-2-aat y tripsinógeno-2 estaban fuertemente elevados. La concentración mediana de tripsina-2-aat era 59 veces mayor que en los controles sanos. La del tripsinógeno-2 era 19 veces mayor y, la de la amilasa, 5,4 veces mayor que en controles sanos (Tabla 1). TABLA 1 Valores de la mediana y del intervalo de tripsina-2-aat, tripsinógeno-2 y amilasa en sueros de controles sanos y diferentes grupos de pacientes (AAT abreviatura de alfa-1-antitripsina) Tripsina-2-AAT Tripsinógeno-2 Amilasa (U/l) (µg/l) (µg/l) Mediana Intervalo Mediana Intervalo Mediana Intervalo Controles sanos 4,2 2, Obstrucción biliar 6,0 3, , Trastornos abdominales agudos 7,6 2, , Pancreatitis aguda No hubo superposición en los valores de tripsina-2-aat entre los pacientes con pancreatitis aguda y aquellos con enfermedad no pancreática. En el caso de tripsinógeno-2 se observó superposición en 4 pacientes (14 %), y en el caso de la amilasa en 14 pacientes (48 %) (Figuras 3A y 3B). La capacidad de varios analitos para diferenciar entre los pacientes con pancreatitis y con enfermedades no pancreáticas se estimó por un análisis ROC. El área bajo la curva ROC fue 1,00 para la tripsina-2-aat, 0,996 para el tripsinógeno-2 y 0,929 para la amilasa, indicando que la sensibilidad y la especificidad eran mejores para la tripsina-2-aat que para las otras determinaciones (Figura 4). Ejemplo 3 a) Purificación de tripsinógeno-2 a partir de orina Se filtró un litro de orina con altas concentraciones de tripsinógeno-2, para eliminar los constituyentes insolubles, y se ajustó el ph del filtrado a 7,4 con NaOH 1 mol/l. El filtrado se pasó através de una columna de cromatografía de inmunoafinidad preparada uniendo 20 mg del anticuerpo monoclonal 14F10, que es específico para tripsinógeno-2, a sepharosa activada con bromuro de cianógeno (Pharmacia, Uppsala, Suecia). Se han descrito las características del anticuerpo (Itkonen et al., 1990). Después de lavar la columna con NaCl 1 mol/l se eluyó conácido trifluoroacético (TFA) al 0,1 %. El eluído fue luego purificado por cromatografía de fase inversa usando un tampón de TFA al 0,1 % y eluyendo con un gradiente de acetonitrilo. El contenido de las fracciones fue seguido para proteínas basándose en su absorbancia a 280 nm. Las fracciones obtenidas fueron neutralizadas inmediatamente con tampón Tris 1 mol/l. El contenido de tripsinógeno-2 en las fracciones se determinó por inmunoensayo. Se concentraron las fracciones que contenían tripsinógeno-2. El tripsinógeno-2 purificado por este método tenía una pureza mayor del 95 % como se evidenciaba por una única banda en una electroforesis con dodecil-sulfato sódico. 5

6 b) Tripsinógeno-2 en orina en el diagnóstico de la pancreatitis 5 10 Se estimó laeficaciaclínica del ensayo en orina para el tripsinógeno-2 determinando las concentraciones en muestras de orina de 22 pacientes con pancreatitis aguda y 46 pacientes con trastornos abdominales agudos de origen extrapancreático. Se usó comocomparación la amilasa en orina. En pacientes con pancreatitis aguda, los niveles de tripsinógeno-2 estaban fuertemente elevados, siendo las concentraciones medianas 4000 veces mayores que en los pacientes con trastornos abdominales agudos. La diferencia correspondiente para la amilasa era sólo de 4 veces (Tabla 2). TABLA 2 Valores de la mediana y el intervalo para tripsinógeno-2 y amilasa en muestras de orina de 46 pacientes con trastorno abdominal agudo de origen extrapancreático y de 22 pacientes con pancreatitis aguda Tripsinógeno-2 (µg/l) Amilasa (U/l) Mediana Intervalo Mediana Intervalo Trastorno abdominal agudo Pancreatitis aguda No había superposición en los valores de tripsinógeno-2 entre los pacientes con pancreatitis aguda y el grupo de control con trastornos abdominales agudos de origen extrapancreático. En el caso de la amilasa, sólo cuatro pacientes con pancreatitis tenían valores más altos que los más altos observados en el grupo control (Figura 5). Ejemplo Tripsinógeno-2 en orina como marcador de pancreatitis aguda comparado con el tripsinógeno-2 en suero y la amilasa en suero o en orina Se estudió la utilidad clínica de las determinaciones de tripsinógeno-2 en orina en el diagnóstico temprano y la determinación de la gravedad de la pancreatitis aguda (AP). Como métodos de referencia se usaron el tripsinógeno-2 en suero, la amilasa en orina y la amilasa en suero. Se estudiaron un total de 59 pacientes con diagnóstico de AP y 42 controles con enfermedades abdominales superiores agudas de origen extrapancreático (AC) en el Hospital Universitario Central de Helsinki. Los pacientes con AP se clasificaron de acuerdo con su estado clínico en dos grupos: AP leve (grupo I, 40 pacientes) y AP grave (grupo II, 19 pacientes). Se usaron muestras de orina de pacientes sin sgnos de enfermedad abdominal aguda, como controles sanos (HC). La amilasa y el tripsinógeno se determinaron de acuerdo con los métodos descritos anteriormente. Todos los casos de pancreatitis aguda (AP) tenían concentraciones altas de tripsinógeno-2 en orina en el inicio y una concentración por debajo del valor superior de referencia excluía dicho diagnóstico. Por el contrario, 17 (28 %) de los pacientes con pancreatitis tenían niveles normales de amilasa en orina. El valor más bajo de tripsinógeno-2 en pancreatitis aguda (15 µg/l) era 1,4 veces mayor que el límite superior de referencia de los controles sanos. La mediana de la concentración de tripsinógeno-2 en orina de pacientes con AP era 102 veces mayor que el límite superior de referencia. Como comparación, los niveles de amilasa en orina eran sólo 2,0 veces mayores y los de amilasa en suero 3,4 veces mayores que el límite superior de referencia. El análisis ROC se empleó para comparar pacientes de pancreatitis aguda (AP) con controles que tenían trastornos abdominales agudos extrapancreáticas (AC). El AUC (área bajo la curva) era de 0,980 para el tripsinógeno-2 en orina, y de 0,842 para la amilasa en orina. El tripsinógeno-2 en orina tenía una exactitud tan buena como el tripsinógeno-2 en suero (AUC = 0,998) y la amilasa en suero (AUC = 0,965), véase Figura 7A. El análisis ROC mostraba que el tripsinógeno-2 en orina tenía la mayor exactitud de todos los marcadores estudiados para diferenciar la AP leve de la grave (AUC = 0,741, Figura 7B), y que era ligeramente mejor que el tripsinógeno-2 en suero en este cometido. La amilasa tenía peor capacidad para diferenciar la AP grave de la leve y, de hecho, los niveles de amilasa en orina eran menores en la enfermedad grave queenlaleve(figura6c). 6

7 5 10 Estos resultados demuestran que el tripsinógeno-2 en orina es un marcador de elevada exactitud para la pancreatitis aguda. Todos los pacientes con pancreatitis aguda tenían valores elevados, y el número de resultados falsos positivos para el tripsinógeno-2 en pacientes con otros trastornos gastrointestinales es menor que para la amilasa en orina. Además, el nivel de tripsinógeno-2 refleja la gravedad de la enfermedad, lo que no hace el nivel de amilasa. Por ello, el tripsinógeno-2 es claramente superior a otros análisis de orina en el diagnóstico de la pancreatitis aguda, y es equivalente al análisis de tripsinógeno-2 en suero. Es obvio con los datos presentados que la determinación de tripsina-2-aat en suero, o de tripsinógeno-2 en orina, proporciona una mayor exactitud clínica que los métodos usados actualmente como el tripsinógeno-2 en suero, la amilasa en suero o la amilasa en orina

8 REIVINDICACIONES Un método para diferenciar enfermedades pancreáticas, incluyendo pancreatitis, de otras enfermedades no pancreáticas usando un inmunoensayo para medir la concentración de un analito en una muestra, caracterizado porque dicho analito es bien i) tripsina-2 complejada con alfa-1-antitripsina (tripsina-2-aat) en suero, o ii) tripsinógeno-2 en orina. 2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque la muestra que contiene el analito mencionado se incuba con un anticuerpo de captura con especificidad por dicho analito. 3. El método de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado porque la incubación de la muestra se lleva a cabo en presencia de un analito competidor marcado. 4. El método de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado porque el analito se incuba con un anticuerpo detector marcado con especificidad por otro sitio del analito diferente al del anticuerpo de captura. 5. El método de acuerdo con las reivindicaciones 2, 3 ó 4, caracterizado porque el anticuerpo de captura está unido a una fase sólida. 6. El método de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el analito es la tripsina-2-aat, caracterizado porque el complejo tripsina-2-aat unido al anticuerpo de captura es separado de la AAT libre antes de la incubación con el anticuerpo detector. 7. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, caracterizado porque el marcador es una enzima, un radioisótopo, un marcador fluorescente, fosforescente o luminiscente, una partícula coloreada o un sitio de unión capaz de unir dicho marcador. 8. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, caracterizado porque el anticuerpo de captura es específico para tripsinógeno-2 o tripsina El método de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado porque el anticuerpo detector es específico para la AAT NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del , no producirán ningún efecto en España en la medida en que confieran protección a productos químicos y farmacéuticos como tales. Esta información no prejuzga que la patente esté onoincluída en la mencionada reserva. 8

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