Por qué necesitamos cristales para ver difracción? Amplificación de la señal. Difracción: 1. Cuándo dispersan en fase dos ó más ondas?

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Estefania Ana Belén Moya Cruz
hace 7 años
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1 Proteína purificada Cristales Difracción de rayos X Obtención de fases Por qué necesitamos cristales para ver difracción? Amplificación de la señal.(efecto de interferencia a tener en cuenta!) Mapa de densidad electrónica molécula celda unidad cristal Construcción de modelo Refinamiento Validación Difracción: Cada electrón dispersa Las ondas emitidas se suman y se restan!! El resultado final depende de las fases relativas de las ondas adicionadas en cada dirección Ley de Bragg : nλ = 2d sin θ Difracción: ondas en fase 1. Cuándo dispersan en fase dos ó más ondas? Cuando recorren la misma trayectoria Usar el sitio interactivo ProjectJava/Bragg/home.html como en el fenómeno de la reflexión de luz

2 Difracción: ondas en fase 2 Cuándo dispersan en fase dos ó más ondas? Cuando sus trayectorias difieren por un múltiplo de la longitud de onda Difracción: ondas en fase Cuanto mayor es el ángulo de difracción, más pequeño es el espaciamiento para el que la difracción es sensible λ = 2d sin θ 2 sin θ / λ = 1 / d λ = 2d sin θ como en el fenómeno de la difracción de luz Cambiando la dirección del haz entrante Mirando diferentes planos en el cristal Difracción: ondas en fase Qué clase de información obtenemos de esto? ~posición relativa de los centros dispersores (scatterers), esto es, los átomos, en la dirección perpendicular a los planos considerados En la dirección del ángulo negro va a registrarse baja intensidad difractada según el rojo, mayor Por qué? Cuándo vemos difracción de un cristal? Un cristal amplifica la difracción en ciertas direcciones, aquéllas para las que la totalidad de las celdas unidad dispersan en fase y las elimina en las otras direcciones Antes que nada: sólo planos repetitivos pueden dispersar en fase debido a la simetría del cristal (repetición de la celda), esos planos tienen relaciones enteras con los ejes de la celda!!

3 Cuándo vemos difracción de un cristal? Cuándo vemos difracción de un cristal? a b c : los tres ejes de la celda unidad Los planos de Bragg conectan divisiones enteras de cada eje plano plano Ahora mirando diferentes orientaciones en 2 dimensiones plano plano plano Indices de Miller h k l Resolución Grado de detalle detalle distancia entre planos ordenados del cristal

4 El límite de resolución en proteínas Si los átomos estuvieran quietos y el orden cristalino fuera perfecto, la resolución estaría limitada sólo por la λ Eía este no es el caso : desorden, alto contenido de solvente (~50%), flexibilidad. 4 Å mala 3 Å más o menos Å razonable 1.5 Å muy buena <1 Å excepcional La difracción n ocurre en el espacio recíproco Si cualquier punto en el cristal puede ser definido como un vector tridimensional r = xa + yb + zc entonces, la difracción ocurre en un espacio recíproco de manera que s = ha* + kb* + lc* Cada eje de esta celda recíproca queda definido teniendo una dirección perpendicular a los otros dos ejes del espacio real y una longitud igual a la recíproca del espaciamiento entre los planos definidos por dichos ejes Espacio recíproco Construcción de la esfera de Ewald QuickTime et un décompresseur Vidéo sont requis pour visualiser cette image.

5 Espacio recíproco de un verdadero cristal de proteína Teoría de Fourier El patrón de difracción está relacionado al objeto que difractó las ondas, a través de una operación matemática denominada transformada de Fourier QuickTime and a TIFF (Uncompressed) decompressor are needed to see this picture. Teoría de Fourier El patrón de difracción está relacionado al objeto que difractó las ondas, a través de una operación matemática denominada transformada de Fourier QuickTime and a TIFF (Uncompressed) decompressor are needed to see this picture.

6 Teoría de Fourier El patrón de difracción está relacionado al objeto que difractó las ondas, a través de una operación matemática denominada transformada de Fourier ρxyz=1 V Importante! r F hkl hkl [ 2πi( hx+ky+lz) ] e Esta integral puede invertirse. Atención a F, es un vector! El problema de las fases Dado que F hkl es un vector, tiene una magnitud Y una fase (se comporta como una onda!) r F hkl=fhkl iα e F hkl 2 es directamente proporcional a la intensidad medida I hkl pero la información sobre α se perdió! Soluciones al problema de las fases : Hipótesis estructura conocida (re)emplazo molecular Perturbar la estructura (y con ella la difracción) Reemplazo isomorfo Difracción anómala Fitting y refinamiento Con la densidad electrónica proyectada en una estación gráfica, uno tiene que construir un modelo atómico que encaje bien en la densidad tenga sentido químico y físico Este modelo predice un patrón de difracción (a través de una transformada de Fourier inversa), y uno usa luego programas para minimizar la diferencia entre las amplitudes F hkl calculadas y observadas

7 Construyendo el primer modelo Los mapas de densidad electrónica son el resultado final del experimento de difracción. Su interpretación en términos de un modelo molecular es la primer tarea del cristalográfo Construyendo el primer modelo Con lo que el problema de fitear un modelo se asemeja al de 'no perder de vista los árboles en el bosque' esqueletonización Construyendo el primer modelo Construyendo el primer modelo 1. Con estos mapas esqueletonizados, lo primero es trazar la cadena principal (ayuda: los Cα están a ~3.8 Å unos de otros!) 2. Luego, se ajustan las cadenas laterales QuickTime et un décompresseur GIF sont requis pour visualiser cette image.

8 Validación de modelos Chequear la geometría del modelo construido: parámetros estereoquímicos, distancias y ángulos de enlace, ángulos dihedros permitidos, etc, etc, etc. Gráfico de Ramachandran de ángulos dihedros ϕ y φ Fases experimentales!! (solvent flattened SAD) Dispersión anómala de los S and Cl -, a la λ Cu Kα (1.542Å) Lisozima «made in Uruguay» : 1.4Å resolución R work =15.1% R free =18.2% Estructura de un represor transcripcional (FapR) : MAD (1 Se/21kDa) + DM Estructura 3D de FapR 0 min 1 min Protein cleaved during purification/storage!! 50 mm Tris ph 8.5, 10 mm MgCl 2,15% PEG4000 P , a=b=59.1 Å, c=157.8 Å, resol: 3.5 Å 50 mm Tris ph 8.5, 10 mm MgCl 2,15% PEG4000 P , a=b=59.1 Å, c=157.8 Å, resol: 3.5 Å 5 min Soaking de Mal-CoA

9 Complejo FapR 43 -malonil-coa Buenos sitios www para ver : Buenos libros para leer : T.L. Blundell & L.N. Johnson (1976), "Protein Crystallography", Academic Press: London. Jan Drenth (2007), "Principles of Protein X-ray Crystallography", 3rd edition. Springer-Verlag: New York. Schujman et al., EMBO J, 2006 D. Sherwood (1976), "Crystals, X-rays and Proteins", Longman: London. Conceptos básicos b de difracción: ondas, interferencia y espacio recíproco Qué son los Rx? Fotones = propagados como una onda Muchas gracias! E α (fase) t amplitud longitud de onda E(t) = A cos(ωt + α) ω=2π/λ

10 Qué son los Rx? Ondas Fotones = propagados como una onda Ondas Si combinamos la variación en el espacio y en el tiempo E α (fase) x amplitud longitud de onda E(x) = A cos(ωx + α) ω=2π/λ A cos[2π(νt-x/λ)] efectos opuestos del tiempo y la distancia + Adición de ondas Sumando el valor del campo eléctrico para cada punto t + Interferencia destructiva Diferencia de fase = 180 da el campo total en t = La suma de dos ondas con longitud de onda λ siempre produce una onda resultante de long de onda λ. interferencia constructiva : la amplitud aumenta. = La amplitud disminuye

11 Sumando ondas como vectores Si queremos sumar todas las ondas dispersadas por el elctron e - de una proteína, usando expresiones de la función de onda obtenemos operaciones trigonométricas MUY feas A cos(α+φ1) + B cos(α+φ2) + Dado que tenemos dos tipos de información (variables) en cada onda, mplitud y fase, podemos usar la notación de vectores para facilitar las operaciones Imaginar una rotación const. del vector 1; y graficar el cos o el sin de φ iempo Sumando ondas como vectores Ahora la adición y sustracción se vuelven una operación geométrica simple Algunas disgresiones matemáticas ticas Este formalismo usando números complejos en lugar de vectores "simples", es de enorme utilidad! Las ondas pueden siempre separarse en sus componentes de ondas simples coseno y seno E(t) = A cos(ωt + α) Usando la regla de la suma de ángulos: A cos(ωt + α) = A cosα cosωt - A sinα sinωt amplitud del componente coseno amplitud del componente seno Algunas disgresiones matemáticas ticas E(t) = A cos(ωt + α) Usando la regla de la suma de ángulos: A cos(ωt + α) = A cosα cosωt - A sinα sinωt amplitud del componente coseno i A α amplitud del componente seno r Ahora las ondas pueden ser sumadas sumando los dos componentes: real e imaginario.

12 Algunas disgresiones matemáticas ticas Los números complejos son del tipo z = a + ib donde i = -1 Con lo que, A cos(ωt + α) = A cosα cosωt - A sinα sinωt, para ωt constante puede escribirse A cosα + i A sinα ó aun, Diagram de Argand (plano complejo) La rotación en el plano complejo es posible por multiplicación de vectores i = 45 A e iα α = fase z1z2 = z1 exp(iα1) z2 exp(iα2) = z1 z2 exp[i(α1 + α2)] Algunas disgresiones matemáticas ticas Teorema de Euler La suma del coseno de α más veces el seno e iα de α es = el número cosα e elevado + ia i veces sinα.

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