Universidad Nacional Hermilio Valdizán

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1 AÑO DE LA INTEGRACIÓN NACIONAL Y EL RECONOCIMIENTO DE NUESTRA DIVERSIDAD Universidad Nacional Hermilio Valdizán FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS E.A.P. AGRONOMÍA INFORME DE PRACTICAS DE MICROBIOLOGIA DOCENTE : Ing. MARIA GUTIEREZ SOLORZANO CURSO : MICROBIOLOGIA Y NEMATOLGIA AGRICOLA INTEGRANTES: DURAN VILLANUEVA JORGE LUIS HUARAUYA GERONIMO ADRIANO EDGAR ESPINOZA FIRMA BEATRIZ RODRIGUEZ ARTETA JAUN AÑO/ SEMESTRE : tercero - VI HUÁNUCO PERÚ 2013-I

2 MEDIOS DE CULTIVO 1. DEFINICIONES (Eduardo y Teddy 1980: 33) sostienen las siguientes definiciones: MEDIOS DE CULTIVO Son soluciones estériles que tienen macro y micronutrientes, sustancias que permiten el crecimiento de organismos. Un medio de cultivo es un sustrato o una solución de nutrientes que permite el desarrollo de microorganismos. En las condiciones de laboratorio para realizar un cultivo, se debe sembrar sobre el medio de cultivo elegido las muestras en las que los microorganismos van a crecer y multiplicarse para dar colonias LOS MICROORGANISMOS Son los seres más abundantes de la tierra, pueden vivir en condiciones extremas de ph, temperatura y tensión de oxígeno, colonizando una amplia diversidad de nichos ecológicos. Entre los requerimientos más importantes para su desarrollo están el carbono, el oxígeno, nitrógeno, dióxido de carbono e hidrógeno. Muchas bacterias sin embargo necesitan del aporte extra de factores de crecimiento específicos en forma de suero, sangre y extracto de levadura entre otros. CULTIVO Es el producto del crecimiento de organismos o grupos de organismos, establecidos con fines experimentales o industriales.

3 CULTIVO PURO Es la presencia de una sola especie de microrganismo libre de todo contaminante, a esto que también se le denomina AXENICO. OBJETIVO Aprender la clasificación y uso de los medios de cultivo. Preparar medios de cultivo y manejar adecuadamente la autoclave. PROCEDIMIENTO 1) Sacar las proporciones. 2) Pesar sustancias. 3) Medir el agua destilada y trasvasarlo a matraz de Erlenmeyer. 4) Homogenizar las sustancias más el agua 5) Hervir, este proceso se realiza de acuerdo a que medio se va a preparar. 6) Añadir y homogenizar las sustancias, hasta disolver las sustancias. 7) Trasvasar a la botella. 8) Acondicionar el medio. 9) Rotular 10) Esterilizar (autoclave) 11) usar el medio de cultivo.

4 1. AGAR-AGAR AGENTES SOLIDIFICANTES (Eduardo y Teddy 1980: 34) refiere que el agar agar es una gelatina vegetal, un polisacárido que se extrae de las algas por medio del ácido sulfúrico diluido a una temperatura de 80 ºC. La especie de producción comercial se extrae de las siguientes especies: Gelidium corneum; gracillaria; gigartina y pterocladia. PROPIEDADES (Eduardo y Teddy 1980: 35) indica las propiedades del agar agar: Se derrite a ºC. Tolera altas temperaturas de esterilización sin descomponerse. Se solidifica a ºC. Adquiere firmeza en medios de cultivos a concentraciones de 1,5 a 2,0 %. Se hidroliza a ph de 2 y ph 9. Su valor nutritivo es casi nulo y contiene algunos factores de crecimiento. 2. GELATINA (Eduardo y Teddy 1980: 35) es una sustancia derivada de huesos, ligamentos y piel de animales, por ebullición de ácido clorhídrico diluido.

5 Propiedades Se derrite a 37 ºC Se solidifica a 20 a 25 ºC, usando 10 a 12 % en solución y también se derrite a esa temperatura. Se descompone a 121 ºC y es digerida por los microorganismos. A ph extrema se hidroliza. A ph ácidos no se solidifica. TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVOS POR SU CONSISTENCIA: 1. Líquidos (Eduardo y Teddy 1980: 35) indican que los medios líquidos se usan en principalmente en el incremento de bacterias, en la determinación de sus propiedades fisiológicas, para el incremento masivo de bacterias y hongos con fines de experimentales (generalmente bajo agitación) y para estudios de crecimiento de microorganismos. Industrialmente tienen uso en la preparación de productos accesorios al crecimiento los microorganismos, (ácidos orgánicos, antibióticos, etc.). 2. Sólidos (Eduardo y Teddy 1980: 35) también sostiene que el uso de principal de medios solidos es para el aislamiento de hongos y bacterias, y para su mantenimiento. Se prepara en frascos, placas Petri y tubos de prueba.

6 SEGÚN SUS PROPIEDADES NUTRITIVAS (Eduardo y Teddy 1980: 35) indican las siguientes propiedades: A. CARENTES DE NUTRIENTES Agua El agua es para el mantenimiento de bacterias en estado latente e inmutable, o clamidosporas de fusarium (el agua destilada en destiladores metálicos es a veces toxico y letal para las bacterias; es preferible usar agua desmineralizada o agua potable no clorinada). Sustancias que son carentes de nutrientes: Laboratorio Caño Destilatorio Dicionizada Agar agua (sustancia solida) Nitrógeno líquido: componente para mantener y preservar sustancias como semen de animales. B. NUTRITIVAS 1. NATURALES Constituyen únicamente de material vegetal natuarl 2. SEMISINTETICOS COMPLEJOS El componente posee 50 % natural y 50 % de sustancias químicas.

7 3. SINTÉTICOS DEFINIDOS Es químicamente definido. PROCEDIMIENTO EN LA PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVOS Se realiza el cálculo de la proporciones para 500 ml de preparado del medio del cultivo, utilizando 1 litro de agua destilada. 1. Sacar las proporciones A. PDA (PAPA AGAR DEXTROSA) PAPA: 200 gramos. DEXTROSA: 10 gramos. AGAR - AGAR: gramos. EXTRACTO DE CARNE: 5 gramos. AGUA DESTILADA: 1000 ml/ 1lt. 500 ml de preparado Proporciones para preparado de 1 litro de medio del cultivo PAPA: 200gr 1000ml de H 2 O X 500ml de H 2 O X = 100 gramos. DEXTROSA: 10gr 1000ml de H 2 O X 500ml de H 2 O X = 5 gramos. AGAR - AGAR: 15gr 1000ml de H 2 O

8 X 500ml de H 2 O X = 7. 5 gramos. EXTARCTO DE CARNE: 5gr 1000ml de H 2 O X 500ml de H 2 O X = 2. 5 gramos. PREPARADO DEL MEDIO DE CULTIVO I. PDA (AGAR PAPA DEXTROSA). PROCEDIMIENTO 1. proporciones para preparado de 115 ml. PAPA: 200gr 1000ml de H 2 O X 115ml de H 2 O X = 23 gramos. DEXTROSA: 10gr 1000ml de H 2 O X 115ml de H 2 O X = gramos. AGAR AGAR: 15gr 1000ml de H 2 O X 115ml de H 2 O X = gramos. EXTARCTO DE CARNE: 5gr 1000ml de H 2 O X 115ml de H 2 O

9 X = gramos. 2. LAVADO, PELADO Y PICADO DE PAPA FIGURA 2 FIGURA 1 3. PESADO DE SUSTANCIAS FIGURA 3

10 4. MEDIR AGUA DESTILADA FIGURA 4 5. HOMOGENIZAR EL AGUA MÁS LA PAPA FIGURA 5

11 6. HERVIR: durante 30 minutos FIGURA 6 7. COLAR: con gaza o tamiz ( si hubiera)

12 FIGURA 7 8. HOMOGENIZAR LA SOLUCIÓN DE PAPA MÁS OTROS COMPONENTES QUÍMICOS, HASTA DISOLVER LAS PARTÍCULAS. FIGURA 8

13 9. TRASVASAR: se transfiere del matraz a la botella antes que se enfrié el medio. FIGURA 9

14 10. ACONDICIONAR: (con una torunda de algodón y sobre ello sellarlo con parafilm) 11. ROTULAR 12. USAR II. OMA (OAL MEAL AGAR)

15 (Sifuentes 1990: 9) es medio de cultivo adecuado para Pythium sp, Phytophthora sp, Fusarium sp., Phoma sp, y otros patógenos. Ingredientes Quaker: g. Dextrosa: 10 g. Agar: g. Agua destilada: 1000 ml. Para preparado de 100 ml. 1. CALCULO DE PROPORCIONES Quaker: 20gr 1000ml de H 2 O X 100 ml de H 2 O X = 200 gramos. Dextrosa: 10gr 1000ml de H 2 O X X 1 gramo. 100ml de H 2 O Agar - Agar: 15gr 1000ml de H 2 O X 100 ml de H 2 O X 15 gramos. 2. PESO DE SUSTANCIAS FIGURA 1

16 3. MEDIR AGUA DESTILADA 4. Medir el agua destilada

17 5. HOMOGENIZAR 6. HERVIR: este proceso tiene una duración de 30 a 45 minutos, removiendo constantemente, para evitar la ebullición.

18 7. HOMOGENIZAR HASTA DISOLVER LAS OTRAS PARTICULAS. 8. HOMOGENIZAR LA SOLUCIÓN DE PAPA MÁS OTROS COMPONENTES QUÍMICOS, HASTA DISOLVER LAS PARTÍCULAS.

19 9. TRASVASAR 13. ACONDICIONAR (con una torunda de algodón y sobre ello sellarlo con parafilm).

20 14. ROTULAR 15. USAR

21 III. AGAR HARINA DE MAÍZ (AHM) (Eduardo y Teddy 1980: 38) menciona que es útil para el aislamiento y esporulación de algunas especies de Phytophthora. PROCEDIMIENTO 1) CALCULO DE PROPORCIONES Harina de maíz: 1000 ml de agua destilada 20gr. de harina 600 ml de agua destilada X X = 12gr. de harina de maíz Para dextrosa: 1000ml. de agua destilada 10gr. de dextrosa 600ml. de agua destilada X X = 6 gr de dextrosa Para agar: 1000ml. de agua destilada 15gr. de agar 600ml. de agua destilada X X = 9 gr de agar

22 2) PESAR 2.6GR DE MAÍZ, 1.3GR DE DEXTROSA Y 1.95GR DE AGAR. FIGURA 1 3) LUEGO EN UN ERLENMEYER ADICIONAR 130ML. DE AGUA DESTILADA CON LA AYUDA DE LA PROBETA.

23 4) HOMOGENIZAR AGUA MÁS HARINA DE MAÍZ 5) HERVIR

24 6) ADICIONAR LA DEXTROSA Y AGAR. 7) HOMOGENIZAR HASTA QUE QUEDE UNIFORME.

25 8) TRASVASAR 9. ACONDICIONAR CON UNA TORUNDA DE ALGODÓN Y PARAFIL

26 10. ROTULAR 11. USAR

27 IV. SABOURAUD (Cañedo 2004: 21) sostiene que es el medio de cultivo muy utilizado para aislar hongos de animales. Sirve para el aislamiento y mantenimiento de hongos en tubo inclinado. Debido a su composición, los hongos crecen exageradamente y esporulan bien. Además, al medio de cultivo, pueden agregarse otros agentes selectivos de crecimiento. FORMULACION CUADRO N 01: Fórmula gramos por litro PEPTONA 5,0 TRIPTEINA 5,0 GLUCOSA 40,O CLORANFENICOL 0,05 AGAR - AGAR 15,0 ph Final : 5,6 ± 0,2 Fuente: Laboratorios Británicos S.A. 2001

28 USO Medio utilizado para el aislamiento, identificación y conservación de hongos patógenos y saprófitos. También es útil para el cultivo de levaduras. CARACTERISITCAS DEL CULTIVO Medio de cultivo deshidratado: color beige claro, homogéneo, libre deslizamiento. Medio de cultivo preparado: color ámbar claro, ligeramente opalescente sin precipitado. RESULTADOS En el siguiente cuadro se muestran las características que tiene el medio de cultivo para el crecimiento adecuado de los microorganismos. Cuadro N 02: Crecimiento de los Microrganismos. Microorganismos Saccharomyces cerevisiae Aspergillus niger Candida albicans Crecimiento Bueno Bueno Bueno Fuente: Laboratorios Británicos s.a NOTA: mantener en lugar fresco, pues la exposición al calor aumenta la hidrólisis de los componentes.

29 MEDIO. PROCEDIMIENTO PARA EL PREPARADO ADECUADO DEL 1. Calculo de proporciones litro de agua Para un 47 gramos por litro. prepara 150 ml de solucion 47 g 1000 ml H 2 0 X 150 ml H Pesar sustancias X = 7,05 ml de sabouraud

30 3. En un Erlenmeyer adicionar 150 ml de agua destilada. 4. Homogenizar el sabouraud más agua destilada

31 5. Calentar hasta desaparecer las partículas 6. Trasvasar el contenido a una botella.

32 7. Acondicionar 8. Rotular

33 CONCLUSIONES: Al concluir la práctica se concluyó en lo siguiente: Se logró conocer los diferentes medios de cultivos para sembrar microorganismos. Aprendimos los pasos para elaborar un medio de cultivo, sus cálculos respectivos de las cantidades necesarias para su preparación. Se determinó la importancia que tiene los medios de cultivo en una investigación en el campo agrícola como en la medicina, industria alimentaria ya que gracias a ello se puede hacer el aislamiento de microorganismos tanto patógenos como benéficos y así identificarlos para su posterior uso. Como estudiantes de agronomía gracias a la práctica en el laboratorio de microbiología desarrollamos nuestros conocimientos en lo que respecta a medios de cultivo y así poder aplicar en nuestra vida profesional.

34 AISLAMIENTO DIRECTO Objetivo general Purificar hongos y bacterias. Objetivos específicos Aprender las técnicas generales para separar a los Hongos de los demás microorganismos. Obtener y comprobar la pureza de los cultivos aislados. Equipos Cámara microboy Cámara de incubación Horno microondas Materiales Muestra: Hoja Medio de cultivo PDA Mechero alcohol Placa Petri Vaso de precipitados Matraz de Erlenmeyer Alcohol de 96 Bisturí Pinza Algodón Papel toalla Papel aluminio Parafilm Lapicero de tinta indeleble

35 EQUIPOS Y MATERIALES UTILIZADOS. EQUIPOS: CAMARA INCUBADOR HORNO MATERIALES: ALCOHOL PLUMON MECHERO PLACAS PDA VASO

36 BISTURI Y PINZA HOJA DE ROSA PAPEL NOTA: Cuando una enfermedad causada por hongos no puede ser identificada fácilmente a través de la consulta bibliográfica, o la producción de signo en cámara húmeda es necesario proceder al AISLAMIENTO.

37 PROCEDIMIENTO 1. licuar el medio de cultivo (PDA) en el horno microondas hasta que se disuelva, posteriormente se hace el proceso de plaqueado. 2. Luego se procede a desinfectar la cámara microboy (parte interna y externa), utilizando alcohol, para evitar la contaminación de los medios de cultivo durante el aislamiento.

38 3. Lavar el material vegetal (hoja) con agua de caño. 4. En un vaso precipitado con contenido de alcohol introducimos el material enfermo por 2 segundos. 5. Luego esterilizar el material vegetal enfermo con una solución de Hipoclorito de sodio por un espacio de dos minutos.

39 6. Plaquear, se procede la siguiente manera: El matraz de Erlenmeyer se destapa cerca del mechero, se flamea el extremo del matraz por la llama y se vierte el medio de cultivo a un medio estéril, se vuelve a flamear el extremo del matraz y se lo tapa nuevamente. 7. Realizar pequeños cortes de la zona de avance de la infección, donde el patógeno está en activo desarrollo.

40 8. 4 pedacitos de igual tamaño más o menos de 1 cm deben ser colocados en una placa Petri contenida con PDA en forma de un cuadrado. 9. Acondicionarlo y utilizando un lapicero de tinta indeleble se procede a la rotulación. 10. Para concluir la práctica, incubar la placa de Petri a 25ºC, aproximadamente de 4 a 5 días.

41 RESULTADOS: 11. A la semana siguiente a partir de los trozos sembrados se observó la formación de los micelios del hongo, en función de los tipos de micelio desarrollados será el número de repiques a realizar para llegar a obtener un cultivo puro.

42 AISLAMIENTOS POR ESTRÍAS Fundamento (García y paredes 1994:78) sostiene que se practica para obtener cultivos puros de muestras que contienen flora polimicrobiana; es también útil para estudiar la morfología y propiedades hemolíticas de las colonias asociadas. Preparar el medio de cultivo ya sea: OMA; PDA; BAUVERIA. Esterilizar el anza de pt

43 Inocular Beauveria al medio de cultivo en forma de estrías, zig-zag Esterilizar otra vez el anza de pt

44 Rotular Sellar Colocar las placas en bolsa de propileno

45 Acondicionar en la incubadora. AISLAMIENTO CON LA ESPÁTULA DE DRIGASKY Se realiza el mismo procedimiento del aislamiento por estrías solo que es con la espátula de drigalsky. Preparar el medio de cultivo

46 Esterilizar la espátula de drigalsky Inocular Beauveria al medio de cultivo en forma de zig-zag Esterilizar otra vez la espátula de drigalsky

47 Rotular Sellar Colocar las placas en la bolsa de propileno Acondicionar en el autoclave

48 CONCLUSIONES Una de las actividades más apasionante del trabajo con hongos es el aislamiento de hongos. Entre las miles de especies que existen en la naturaleza el micólogo o el cultivador necesita aislar una para poder trabajar con ella. Para el que se inicia en esta actividad es bueno conocer las técnicas más usuales que le ayuden rápidamente a desarrollar su intuición y su habilidad. El aislamiento de hongos de la naturaleza es uno de los primeros aprendizajes que debe adquirir quién desee trabajar con hongos.

49 AISLAMIENTO POR SERIES DE DILUCION O DILUCIONES SUCECIVAS Se aprovecha la propiedad que tienen los medios de cultivo con agar (medios sólidos), de permanecer líquidos a temperatura relativamente baja, lo que permite la incorporación de la mezcla microbiana, o bien se realizan diluciones en solución fisiológica del inoculo primario se vuelcan en cajas de Petri estériles, se les agrega el medio de cultivo fundido a baja temperatura. El material incorporado se disemina por toda la masa del medio de cultivo y una vez solidificado, quedan los microorganismos inmovilizados y separados uno de otro, originando colonias que se pueden contar. Siembra por diluciones seriadas este método consiste en realizar diluciones sucesivas de la muestra con el objeto de sembrar después cantidades conocidas de esas diluciones en capsulas de Petri. Este método nos permite conocer el número de microorganismo viable. La viabilidad en microorganismo se define como la capacidad del microorganismo para multiplicarse en un medio de cultivo. Dado es muy pequeña una probabilidad de orden 0.05 cuando se siembra un gran número de tubos con un inoculo de esta dimensión puede calcularse mediante la teoría de probabilidades que la fracción que el tubo recibe el organismo es 0.048: la fracción que recibe tres organismos es Como resultado de ello si un tubo muestra algo de crecimiento, existe una elevada probabilidad de que este en crecimiento sea el resultado de la introducción de un solo organismo disminuye

50 rápidamente a medida que aumente el número medio de organismo en el inocuo Por lo tanto es esencial aislar a partir de una serie de tubos cuya gran mayoría no muestre ningún crecimiento. Objetivo. Que el estudiante conozca el aislamiento por dilución y otra forma para aislar microorganismos de tejido vegetal enfermo, particularmente bacteria. El método de dilución para el caso de bacterias ofrece mayor sencillez y menor cantidad de contaminantes y es uno de las maneras más comunes en el aislamiento de este tipo de microorganismos Es inocular una serie de tubos con una suspensión microbiana tan diluida que la probabilidad de introducir siquiera un solo individuo dentro de un tubo Materiales: Matraz. Erlenmeyer. Tubos de ensayo. Mechero de bunsen Placa Petri. Hipoclorito de sodio 1%Agua destilada Esterilizada. Pipeta. Tubo de ensaye. plástico adherente. Material vegetal enfermo Cámara de aislamiento. Gradilla.

51 Cinta. Tubos con caldo y agar Nutritivo PROCEDIMIENTO Limpieza (desinfección, del material) Factores de inoculación. Temperatura. Densidad de siembra. Luz. Nutrición. Uniformización de inocuo(cantidad calidad) Por diluciones sucesivas consiste en hacer diluciones seriadas de la muestra o del inóculo, ésta se utiliza cuando se tienen muestras líquidas agua, se realiza haciendo diluciones a las muestras: 1:100, 1:1

52 000, 1: etc. Luego se siembra cada dilución en placas de Petri con medios de cultivo. Una vez obtenidos los cultivos, se puede proceder al examen macroscópico: morfología de las colonias, actividades bioquímicas o características. METODOLOGÍA: Manejo del asa bacteriológica o de siembra: 30 Tomado de Microbiología Tomo II de Granados 2ª edición Técnica de siembra por diluciones sucesivas

53 ANEXO

54 BIBLIOGRAFÍA Eduardo R, French y Teddy t Heber Métodos De Investigación Fitopatológica. COSTA RICA. Pedro García Y Fernando Paredes 1994.Microbiologia Clínica (Practica) 2º Edición. UNIVERSIDAD DE CADIZ. Practica De Patología Vegetal Universidad De Murcia. Verónica Cañedo Teresa Ames Cip Manual De Laboratorio Para Manejo De Hongos Entomopatógenos. Lima Perú.