Cultivo in vitro de Babesia bovis y Babesia bigemina

Transcripción

1 Cultivo in vitro de Babesia bovis y Babesia bigemina Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Parasitología Veterinaria FOLLETO TÉCNICO No.5 DICIEMBRE 2009

2 Cultivo in vitro de Babesia bovis y Babesia bigemina Autores: Carmen Rojas Martínez Julio Vicente Figueroa Millán Jesús Antonio Álvarez Martínez INSTITUTO NACIONAL DE INVESTIGACIONES FORESTALES AGRICOLAS Y PECUARIAS CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN DISCIPLINARIA EN PARASITOLOGÍA VETERINARIA JIUTEPEC, MORELOS,MÉXICO Diciembre de 2009

3 No esta permitida la reproducción total o parcial de este libro, ni la transmisión en ninguna forma o por cualquier medio, ya sea electrónico, mecánico, por fotocopia, por registro o por otros métodos, sin el permiso previo y por escrito de los titulares. La información contenida en cada uno de los capítulos es responsabilidad del autor. Primera edición 2009 Impreso en México Esta obra se terminó de imprimir En Diciembre del 2009 Editores de la publicación: Dr. Carlos A. Vega y Murguía. ISBN Folleto Técnico No. 5, Diciembre de 2009 CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN DISCIPLINARIA EN PARASITOLOGÍA VETERINARIA Carretera Federal Cuernavaca-Cuautla No Col. Progreso , Morelos Teléfono:(777) ext. 137 Fax: (777) ext 129 Correo electrónico: alvarez.jesus@inifap.gob.mx

4 CONTENIDO Introducción... 3 Ciclo Biológico de Babesia spp... 4 Control de la babesiosis bovina... 5 Cultivo in vitro de Babesia... 6 Materiales y metodología... 7 Área del cultivo... 7 Higiene... 8 Preparación de material... 8 Bovinos donadores... 8 Obtención de eritrocitos y suero... 9 Cepas de Babesia Medio de cultivo completo Suspensiones de eritrocitos Inicio de cultivo Mantenimiento de B. bovis y B. bigemina Temperatura Atmósfera Cambio de medio de cultivo Recipientes Monitoreo del crecimiento

5 Frotis Tinción Porcentaje de eritrocitos parasitados (PEP) Expansión Criopreservación Cultivo in vitro de Babesia Antecedentes La vacuna viva atenuada Literatura recomendada Apéndice. Reactivos y Soluciones... I. Antibióticos y antifungales II. Solución III. Medio Base IV. Medio de cultivo completo

6 Introducción La babesiosis bovina es una enfermedad conocida también como fiebre de Texas, fiebre de la garrapata o aguas rojas; causadas por protozoarios intraeritrocíticos del género Babesia que son transmitidos por garrapatas. La forma clínica de esta enfermedad se caracteriza por: fiebre, anemia hemolítica, hemoglobinuria, aborto en hembras gestantes después del primer tercio y la muerte de animales afectados. En animales susceptibles las tasas de morbilidad y mortalidad en nuestro país suelen ser superiores al 50%. De las diferentes especies de Babesia que afectan a los mamíferos, las más importantes desde el punto de vista económico son B. bovis y B. bigemina Su presencia se asocia a la del vector, la garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus, Rhipicephalus decoloratus y Rhipicephalus annulatus en las regiones tropicales y subtropicales. El control de la enfermedad regularmente comprende: uso de ixodicidas para control del vector; movilización controlada de ganado; quimioterapia, quimioprofilaxis, y la utilización de ganado resistente. No obstante, la inmunización es el medio más apropiado para prevenir y controlar a la babesiosis bovina. Figura 1: Signos clínicos asociados a la babesiosis bovina. A) Bovino infestado con garrapatas Rhipicephalus (Boophilus) microplus Bovino afectado por Babesia bovis y Babesia bigemina. B) Mucosa bucal pálida por anemia hemolítica. C) P o s t r a c i ó n. D ) H e m o g l o b i n u r i a. E ) M u e r t e. 3

7 Ciclo Biológico de Babesia spp. En el vector, la garrapata Rhipicephalus ( Boophilus) microplus se infecta al tiempo de alimentarse sobre el bovino, especialmente durante las últimas 24 horas antes de que la garrapata se desprenda del bovino infectado. Los parásitos dentro del eritrocito en el lumen del intestino de la garrapata se convierten en células de cuerpo radiado, emergen y forman amplios agregados de células de cuerpos radiados multinucleados. Posteriormente se transforman en células de núcleo simple haploide (gametocitos); en seguida se fusionan en pares durante una fase sexual (singamia) y se forma el cigoto como una célula esférica diploide. Luego sucede una infección selectiva de células digestivas y de células basófilas que sintetizan vitelogenina. Esta etapa es la esquizogonia primaria que finaliza con la formación de quinetos, que pasan a la hemolinfa e infectan diferentes tipos celulares. Entonces en los ovocitos de la garrapata transcurren ciclos sucesivos de multiplicación, que constituyen la esquizogonia secundaria y ocurre la transmisión transovárica. De esta manera al alcanzar la madurez, la progenie de garrapatas se alimentan sobre otro hospedero y suceden ciclos de fisión múltiple en varios órganos de la garrapata. Por otra parte, cuando en el bovino se alimenta el vector, en este último ocurre un ciclo final de fisión múltiple en células epiteliales de las glándulas salivales, y se forma una gran cantidad de esporozoitos que inician su desarrollo en el animal. Las formas infectantes de Babesia bovis son inoculadas por las larvas y en el caso de Babesia bigemina se transmite por las ninfas y adultos. Las formas infecciosas al ser liberadas al torrente sanguíneo infectan eritrocitos del bovino. El periodo de incubación, esto es, entre la inoculación y la aparición de los signos varía entre 7 a 35 días. La penetración de los merozoitos a los eritrocitos del bovino comprende: Contacto entre merozoito y eritrocito; orientación de la porción apical del merozoito al eritrocito; fusión de membranas; descarga del contenido de las roptrias y finalmente la invaginación de la membrana del eritrocito. A partir de lo cual, se forma una vacuola parasitófora que se diferencia y se forman los trofozoitos. Posteriormente se producen los merozoitos que salen de los eritrocitos para invadir a otros eritrocitos. 4

8 La penetración de los merozoitos a los eritrocitos del bovino comprende: Contacto entre merozoito y eritrocito; orientación de la porción apical del merozoito al eritrocito; fusión de membranas; descarga del contenido de las roptrias y finalmente la invaginación de la membrana del eritrocito. A partir de lo cual, se forma una vacuola parasitófora que se diferencia y se forman los trofozoitos. Posteriormente se producen los merozoitos que salen de los eritrocitos para invadir a otros eritrocitos. Figura 2: Eritrocitos infectados de bovino A) Babesia bovis B) Babesia bigemina. Tinción Giemsa (100x). Control de la Babesiosis bovina. En la producción ganadera previamente se ha utilizado la premunición como un procedimiento primordialmente empírico, que consiste en la subinoculación de sangre infectante de un portador asintomático hacia animales susceptibles. Esta práctica tiene desventajas tales como la diseminación de diferentes enfermedades como: anaplasmosis, brucelosis, tuberculosis, IBR, BVD, leucosis, etc. La investigación sobre el control de la babesiosis ha sido dirigida hacia el desarrollo de inmunógenos elaborados a partir de protozoarios vivos atenuados ó recombinantes, capaces de prevenir la enfermedad en ganado susceptible. Como parte del desarrollo de vacunas, en Australia se han utilizado cepas de Babesia bovis y Babesia bigemina atenuadas mediante pases en terneros esplenectomizados. Aquellas se usan como un método inmunoprofiláctico por la reducida virulencia. Actualmente en México no existe ninguna vacuna comercial para el control de la babesiosis bovina. En el CENID PAVET del INIFAP, se dispone de la metodología para la elaboración de una vacuna y se tienen dos subpoblaciones de Babesia, una de B. bigemina y otra B. bovis ambas clonadas y restablecidas en cultivo in vitro. 5

9 Figura 3: Aplicación intramuscular de la vacuna del INIFAP contra Babesiosis bovina. Uso de vacuna viva atenuada bivalente con Babesia bovis y Babesia bigemina, derivada del cultivo in vitro. Cultivo in vitro de Babesia. Antecedentes. Los primeros estudios del cultivo de Plasmodium fueron la base para el cultivo in vitro para Babesia spp., con Plasmodium vivax y Plasmodium falciparum se logró crecimiento con el uso de sangre de humano en el laboratorio; asimismo se sabía que Plasmodium falciparum era capaz de infectar monos Aotus. Ante la disponibilidad de ambos sistemas; la utilización del cultivo in vitro y la inoculación biológica, y la necesidad de desarrollar inmunogenos, el cultivo fue categorizado como lo más apropiado para el desarrollo de vacunas contra el paludismo. A mediados de los años 70 con temperatura y atmosfera controladas se logró mantener el cultivo in vitro continuo de Plasmodium falciparum en eritrocitos de humano, demostrando además que la infectividad se mantenía. En el caso de Babesia se conocía de la fase eritrocítica como distintivo. Por lo que los eritrocitos son las células blanco de Babesia spp, que proporcionan los requerimientos metabólicos adecuados para su crecimiento y reproducción del parásito Con algunas modificaciones se pudo establecer el cultivo de Babesia bovis en una suspensión de eritrocitos en un medio definido químicamente, suplementado con un amortiguador de ph y suero bovino al 50% (v/v) en atmósferas y temperaturas definidas. Similarmente se estableció el cultivo de B. divergens y B. canis; posteriormente Babesia bigemina y Babesia rodhaini. El mejoramiento de la metodología permitió crecimiento continuo por mayores periodos e incrementó el porcentaje de eritrocitos parasitados. 6

10 Además se desarrolló el proceso de crecimiento en fase estacionaria microaerofílico que evitó el mantenimiento del cultivo en suspensión. La profundidad del fluido en el recipiente de cultivo se reconoció como factor determinante, mejorándose el grado de infección de parásitos a eritrocitos y un mayor periodo de mantenimiento. Una modificación importante fue la sustitución del amortiguador HEPES por TES (N-Tris (Hidroximetil)-methyl-2-aminoethanesulfonic acid). Con los avances descritos se pudo hacer la adaptación y conservación de diferentes cepas y se desarrolló un procedimiento de criopreservación para la recuperación de Babesia bovis para el cultivo in vitro. Posteriormente, se efectuó la clonación de Babesia bovis y de Babesia bigemina. En México se estableció el cultivo in vitro de Babesia bovis a finales de los años 70 y B. bigemina a mediados de los años 80. La importancia y aplicaciones del cultivo in vitro de Babesia además de la obtención de cepas atenuadas para la inmunoprofilaxis permiten realizar estudios para: la obtención de clonas, de comportamiento metabólico y reproductivo de las Babesias, de ultraestructura, y obtención de antígeno para diagnostico y pruebas de sensibilidad a drogas entre otras muchas aplicaciones. Materiales y metodología. El cultivo in vitro de Babesia spp., consiste básicamente en una suspensión de eritrocitos de bovino donador en un medio de cultivo definido químicamente, suplementado con suero normal de bovino adulto, al que se le denomina medio completo. Esta mezcla proporciona los nutrientes necesarios para sustentar el crecimiento y la multiplicación de los protozoarios parásitos. Área del cultivo. El sitio en donde se realiza la práctica del cultivo in vitro debe ser considerado y operado como un cuarto estéril. Por sus características el medio de cultivo completo permite el crecimiento de diferentes especies de microorganismos. Por lo que es indispensable mantener estrictamente las condiciones de asepsia y esterilidad. Cualquier material que se introduzca al área de trabajo deberán ser limpiado con alcohol etílico al 70%, esto incluye; envases, pipetas, tijeras, etc. Es conveniente utilizar como área de trabajo rutinario una campana de flujo laminar clase II. 7

11 Figura 4: Condiciones para el desarrollo del cultivo. El operador en el cultivo debe vestir bata de laboratorio y se requiere hacer el trabajo exclusivamente dentro de la campana de flujo laminar clase II. Higiene. El técnico laboratorista encargado del cultivo deberá utilizar siempre bata limpia dentro del área de cultivo. Es recomendable el uso de cubrebocas y guantes. No usar accesorios y joyas en los antebrazos y manos. Al inicio de las actividades deberá lavarse las manos y antebrazos, posteriormente realizar la desinfección con una solución de alcohol etílico al 70%. Preparación de material. El material del cultivo deberá ser exclusivo para ese fin y estar libre de residuos químicos y microorganismos. Todo material deberá ser esterilizado en la autoclave, sometiéndolo a una temperatura de 121ºC, a una presión de 1.2 kg /cm² (15 Lbs./pulgada) durante15 min. El material deberá ser recubierto con papel aluminio para protegerlo del exterior durante su almacenaje. Los líquidos deben ser esterilizados por ultrafiltración a través de membranas con poros de 0.22 µm de diámetro y se mantendrán a 4-7ºC hasta su uso. Bovinos donadores. Para la obtención eritrocitos y suero normales se deben utilizar bovinos Bos Taurus (Holstein Friesian; Pardo Suizo, etc.), preferentemente de 2 años de edad o mayores que estén clínicamente sanos y libres de Babesia, Anaplasma, brucelosis, tuberculosis, diarrea viral bovina, rinotraqueitis infecciosa bovina y leucosis bovina, para lo cual periódicamente se someterán a las pruebas diagnósticas correspondientes. 8

12 Figura 5: Características de un bovino donador. Bovino donador de eritrocitos y suero para el cultivo in vitro de Babesia bovis y Babesia bigemina. Es importante mantener a los animales donadores en unidades de aislamiento y con una dieta especial debido a que serán utilizados continuamente para colectar sangre. Es necesario tener presente que bovinos jóvenes poseen factores que pueden inhibir el crecimiento de Babesia en el cultivo in vitro. Obtención de eritrocitos y suero. Los eritrocitos son las células hospedadoras de Babesia spp y el suero es un componente indispensable para su mantenimiento y proliferación. Para la obtención de la sangre se aplicará el procedimiento de recolección de sangre desfibrinada, utilizando un matraz Kitazato con capacidad de 1000 ml, al que se introduce 10 % de su volumen de perlas de vidrio de 0.5 cm. de diámetro. Se deben hacer dos conexiones con manguera de látex y tubo de vidrio. Una será utilizada para hacer el vacío y la otra para obtener sangre del donador. Por lo que en esta última se debe colocar el barril de una jeringa con aguja de calibre del número 16. Una vez armado, el matraz se debe envolver en papel aluminio para ser esterilizado. Poco antes de su utilización se hará vacío mediante una bomba de vacío. Figura 6: Características de un matraz recolector. Armado del matraz para la colección de sangre de un bovino donador. 9

13 El sangrado se realiza por punción de la vena yugular del bovino donador, previa desinfección del área, manteniendo el matraz en agitación continua para la desfibrinización de la sangre colectada. En el laboratorio, la sangre se centrifuga a 2,740 g a 4 C por 25 min. El sobrenadante ó suero se retira y distribuye en alícuotas de 20 a 50 ml para su almacenamiento a -20 C hasta su uso. Al sedimento celular se le retira la capa flogística y el paquete de eritrocitos remanente debe ser lavado al menos tres veces con solución de VYM (ph ) (Apéndice). Posteriormente, se resuspende a una dilución 1:2 con la solución de VYM, esto constituye el banco de células sanas, el cual se almacena a 4 ºC hasta su uso. Figura 7: Ilustración del proceso para la obtención de eritrocitos y suero. Obtención de sangre del bovino donador para la separación del suero y paquete de eritrocitos. Cepas de Babesia. Si se dispone de algún estabilizado de Babesia bovis y/o Babesia bigemina mantenidos en criopreservación, estos podrían incorporarse al cultivo. Es importante conocer si han sido previamente adaptadas al cultivo bajo el sistema estacionario microaerofílico. En caso contrario, es recomendable iniciar a partir de un bovino infectado, pero se debe tener la certeza de que se trata de infección de una sola especie. Conviene recordar que en condiciones naturales comúnmente existe coinfección de ambas especies de Babesia. Por lo que puede ser necesario hacer el aislamiento y purificación de la especie de Babesia de interés. Medio de cultivo completo. El medio contendrá los nutrientes necesarios para mantener y reproducir los parásitos en condiciones in vitro. Se requiere el suministro diario de medio de cultivo completo, que contiene aminoácidos esenciales, glucosa, vitaminas y minerales, es conveniente utilizar el medio 199 (M-199), 10

14 adicionado con una sal tampón N-Tris(Hidroximetil)-methyl-2- aminoethanesulfonic acid (TES), bicarbonato de sodio NaHCO3 y con antibiótico penicilina 100 IU/ml, estreptomicina 100µg/ml.El medio se suplementa con 40% de suero de bovino; se sugiere que el suero haya sido congelado previamente para facilitar la filtración del mismo, debido a que la inclusión de suero fresco dificulta la filtración del medio completo. Suspensiones de eritrocitos. Para la multiplicación in vitro de Babesia bovis o de Babesia bigemina se recomienda utilizar una concentración de glóbulos rojos entre 5 a 10% (v/v) con medio de cultivo completo. Para la preparación de la suspensión se utiliza el paquete de eritrocitos mantenido en solución de VYM en refrigeración, como banco de eritrocitos sanos. Figura 8: Ilustración del medio completo y eritrocitos. Medio completo y suspensión de eritrocitos sanos mantenidos en solución de VYM. Inicio de cultivo. Si se dispone de material criopreservado (-196 C), primero se debe efectuar la descongelación. Para lo cual el material debe retirarse del nitrógeno líquido y hacer un descongelamiento súbito manteniendo el criovial en baño María a 37 C por un minuto. En seguida es necesario eliminar el crioprotector mediante un lavado con solución de VYM, centrifugando a 2,740 g por 15 min. Se elimina el sobrenadante y al paquete de eritrocitos infectados se adicionan suspensión de eritrocitos al 10% en medio completo. La suspensión resultante de eritrocitos infectados y no infectados con medio completo se deposita en una placa de cultivo de 24 pozos, en 2 volumen de 5 µl/mm. 11

15 Mantenimiento de B. bovis y B. bigemina. Los recipientes o contenedores del cultivo pueden ser placas de 24 pozos o bien botellas de cultivo de 25, 75, o 225 cm². Siempre será recomendable iniciar con el contenedor de menor tamaño y considerar los de mayor dimensión para el proceso de expansión. Las condiciones micro ambientales en las que se debe mantener el material biológico independientemente del tipo y tamaño de contenedor incluyen: Temperatura. Se utiliza una incubadora manteniendo la temperatura constante de 37ºC (± 0.3), es muy apropiado que sea una incubadora con camisa de agua En el interior de la incubadora se recomienda conservar una atmósfera saturada de humedad colocando un recipiente con agua destilada. Atmósfera. El suministro de gas debe mantenerse con una presión constante saturando el interior de la incubadora con la mezcla de gases de 90% aire, 5% O2 y 5% CO2. Esta mezcla es útil para ambas especies de Babesia, puede ser adquirida ya preparada comercialmente. También puede utilizarse una incubadora con inyectores que permitan el suministro de cada gas en la proporción indicada. Cambio de medio de cultivo. El manejo normal del cultivo in vitro de B. bovis y B. bigemina requiere que el sobrenadante de los cultivos se reemplace cada 24 hrs. Mediante la adición de medio de cultivo completo fresco. Esto permitirá la eliminación de metabolitos y mantendrá el microambiente favorable para los parásitos. Realizar la rutina antes descrita, constituye condiciones que favorecen el crecimiento y desarrollo para los parásitos. Como todas las actividades directamente relacionadas con el cultivo, el cambio de medio se debe hacer en condiciones de esterilidad en la campana de flujo laminar. Procedimiento: 1. El medio completo filtrado se coloca dentro de la incubadora para que alcance la misma temperatura que el material biológico que se mantiene en cultivo. 2. Siempre que la placa de cultivo sea retirada de la incubadora, deberá manipularse dentro de la campana de flujo. De esta manera se retira el sobrenadante. Si se trabaja en placa de 24 pozos se sugiere el uso de una micropipeta de 1000 µl. En recipientes mayores se facilita con el uso de pipetas serológicas. En cualquier caso se 12

16 debe evitar retirar el paquete de eritrocitos. Es importante hacer una revisión visual del contenido de los pozos, ya que la presencia de grumos en el fondo o cambio en el color pueden indicar contaminación. 3. Una vez retirado el medio es conveniente tomar una muestra de aproximadamente 1 a 3 µl aproximadamente y hacer un frotis para el monitoreo. 4. Se debe agregar el mismo volumen de medio que se le retiró. Finalmente se debe regresar a la incubadora. Figura 9: Ilustración del cambio de medio. 2 Cambio de medio en placa de 24 pozos y en botella de 225 cm. Recipientes. Los contenedores o recipientes para realizar el cultivo pueden ser de varios tipos (Cuadro 1). Los volúmenes totales y de cambio de medio dependerán de esos. Para ambas especies de Babesia, se pueden utilizar de manera indistinta tanto los recipientes como los volúmenes de medio. 13

17 Cuadro 1. Tipos de recipiente para el cultivo in vitro de B. bovis y B. bigemina. Volúmenes de medio total y de reemplazo. Monitoreo del crecimiento. Para conocer la condición del cultivo in vitro de Babesia spp. es necesario hacer un monitoreo diario mediante la elaboración y observación de un frotis. Frotis. El método de observación es necesario para observar a los parásitos en su morfología y en el grado de infección. Al mismo tiempo permite la detección de contaminación por hongos, levadura o bacterias por manejo deficiente del mismo. Para la elaboración del frotis y para facilitar el conteo de eritrocitos infectados, se recomienda tomar una muestra de eritrocitos sedimentados tratando de que no se mezclen con el sobrenadante. Se requiere de 1-3 µl de paquete que se extienden sobre un portaobjetos, para evitar el crenado de las células es conveniente mantener en la campana de flujo para que sequen rápidamente. Tinción. Las tinciones más utilizadas son Giemsa y Wright porque permiten observar fácilmente a los parásitos intraeritrocíticos. El colorante de Giemsa está formado de una mezcla de azul de metileno que forman los colorantes de azur II-eosina y azur II, en una proporción de 15:4. El azur tiñe la cromatina y la eosina tiñe el citoplasma de color rosa. Porcentaje de eritrocitos parasitados (PEP). El grado de infección se determina mediante el conteo de glóbulos rojos infectados y sanos. Una lectura representativa sugiere contar al menos 500 eritrocitos por cada frotis. Para hacer el conteo se han descrito cuatro métodos, especialmente para seleccionar las áreas en donde aplicar en el conteo. 1) Método de la orilla, en este se traza una línea recta sobre un borde del frotis. 2) Seccional en forma de greca. 3) Seccional cruzando, se trazan líneas inclinadas en forma de zig-zag. 4) Diagonal, se lee con una línea que cruza todo el frotis. 14

18 Figura 10: Métodos de observación del frotis para la determinación de eritrocitos parasitados. 1) Orilla, 2) Greca, 3) Zig-Zag, 4) Diagonal. El recorrido diagonal es el más recomendado, puede hacerse marcando diez círculos siguiendo una línea diagonal. Para obtener el PEP solo se consideran en la cuenta a los eritrocitos sin infectar y a los infectados, no se incluye a las formas extraeritrociticas. Se suman y se determina el porcentaje de eritrocitos parasitados o infectados. Cuando el PEP es menor a 1% se recomienda contar al menos 5000 células en total, equivalente a campos. Subcultivo. Este consiste en la adición de suspensión 5-10% de eritrocitos sanos en medio de cultivo completo. Se ejecuta a hrs. luego de iniciar la siembra. Durante el subcultivo se realizan diluciones las cuales, dependen del PEP previamente alcanzado. El nivel de dilución se hace de acuerdo al valor determinado con base en el crecimiento del cultivo. Si el cultivo tiene un PEP muy bajo, en ocasiones solo considerado como positivo, entonces el subcultivo se realiza máximo a las 96 hrs. En este caso la dilución recomendada es de 1:2 con una suspensión de eritrocitos al 10%. Cuando existen parasitemias mayores al 3% es posible hacer diluciones mayores, tratando de mantener un 0.5-1% de eritrocitos parasitados. Expansión. Esta parte del proceso del cultivo in vitro es útil para la obtención de volúmenes mayores particularmente cuando se requiere la preparación de antígeno para la instrumentación de alguna prueba diagnóstica, o bien la obtención de material biológico suficiente para ensayos de inmunogenicidad. Al hacer la expansión se deben tener algunas consideraciones para tener éxito: utilizar los recipientes en orden creciente de capacidad. Es posible evitar tamaños intermedios cuando el nivel de proliferación es alto v. gr. 15

19 PEP mayor a 5%. Es recomendable mantener un PEP de 1 al cambiar de recipiente. Cuando se utilizan botellas con volúmenes mayores, es importante el manejo cuidadoso para reducir el riesgo latente de contaminación. Al mismo tiempo debe tenerse muy presente la necesidad del uso de mayores volúmenes de reactivos, así como de eritrocitos y suero de los animales donadores. Figura 11: Proceso de amplificación del cultivo. Amplificación del cultivo in vitro de B. bovis o de B. bigemina: a partir 2 2 de placas de 24 pozos, a botella de 75 cm y a botella 225 cm. Criopreservación. Para hacer un adecuado almacenamiento de material derivado del cultivo in vitro de Babesia bovis y Babesia bigemina, es aconsejable hacerlo en el menor tiempo posible. Una vez realizada la cosecha de los parásitos, con la previa eliminación del medio y la adición del crioprotector. Los productos más comúnmente utilizados como crioprotectores son: polyvinylpirrolidona-40% (PVP-40) y el dimetil-sulfóxido (DMSO). Figura 12: Proceso de expansión del cultivo. A. Recipientes para la expansión del cultivo in vitro de Babesia bovis o Babesia 2 bigemina. B, C. Cosecha de un lote en botellas de 225 cm. 16

20 Se debe colocar en un ultracongelador a -70ºC utilizando un contenedor de enfriamiento con alcohol isopropilico. La congelación rápida es para evitar la formación de cristales de agua, que puedan perforar las membranas, lo cual ocurre normalmente a -20ºC. Se considera que en el contenedor disminuya a la tasa de 1ºC / min aproximadamente. Cuando las muestras alcanzan los -70ºC se pueden sumergir directamente en Nitrógeno líquido (-196ºC). Una vez congelado el material podrá conservarse hasta por varios años, manteniendo sus características de infectividad. Cultivo in vitro de Babesia. Antecedentes. Los primeros estudios del cultivo de Plasmodium fueron la base para el cultivo in vitro para Babesia spp., con Plasmodium vivax y Plasmodium falciparum se logró crecimiento con el uso de sangre de humano; asimismo se sabía que Plasmodium falciparum era capaz de infectar monos Aotus. Por lo que ante la disponibilidad de ambos sistemas y la necesidad de desarrollar inmunogenos, el cultivo fue categorizado como lo más apropiado para el desarrollo de vacunas contra el paludismo. Así a mediados de los años 70 con temperatura y atmosfera controladas se logró mantener el cultivo continuo de Plasmodium falciparum en eritrocitos de humano, demostrando además que la infectividad se mantenía. En el caso de Babesia se conocía de la fase eritrocítica como distintivo. Por lo que los eritrocitos se sabe que son las células blanco de Babesia spp, que proporcionan los requerimientos metabólicos adecuados para su crecimiento y reproducción. Con algunas modificaciones se pudo establecer el cultivo de Babesia bovis en una suspensión de eritrocitos en un medio suplementado con un amortiguador de ph y suero bovino al 50% en atmosferas y temperaturas definidas. Similarmente se estableció el cultivo de Babesia divergens, posteriormente Babesia bigemina y Babesia rodhaini. El mejoramiento de la metodología permitió crecimiento continuo por mayores periodos e incrementó el porcentaje de eritrocitos parasitados. Además se desarrolló el proceso de crecimiento en fase estacionaria microaerofílico que evitó el mantenimiento del cultivo en suspensión. La profundidad del fluido en el recipiente de cultivo se reconoció como factor determinante, mejorándose el grado de invasión de parásitos a eritrocitos y un mayor periodo de mantenimiento. Una modificación importante fue la sustitución del amortiguador HEPES por TES (N-Tris (Hidroximetil)- 17

21 methyl-2-aminoethanesulfonic acid). Con los avances descritos se pudo hacer la adaptación y conservación de diferentes cepas y se desarrolló un procedimiento de criopreservación para la recuperación de Babesia bovis para el cultivo in vitro. Más adelante, se efectuó la clonación de Babesia bovis y de Babesia bigemina. En México se establece el cultivo in vitro de Babesia bovis a finales de los años 70 y B. bigemina a principio de los años 80. La vacuna viva atenuada. Con las cepas adaptadas, clonadas y mantenidas en criopreservación, se han realizado estudios detallados usándolas como un inmunógeno bivalente, en ganado bovino susceptible tanto en condiciones controladas como en ambientes naturales de alta 7 endemicidad. La dosis determinada fue de 1x10 eritrocitos infectados de cada especie ( B. bovis y B. bigemina) como vacuna 8 fresca y 1x10 como vacuna congelada en nitrógeno líquido. En experimentos controlados la protección alcanzada fue de 100%, y en animales expuestos a vectores en una zona de alta endemicidad de Babesia la protección fue de 80%. No obstante los logros obtenidos en la metodología de proceso para la producción de la vacuna, existía el riesgo de la presencia de microorganismos adventicios que podían contaminarla con la consecuente diseminación de éstos, a través de la aplicación de una vacuna contaminada. Por lo que se estudió el uso de radiación gamma sobre el sustrato de la vacuna, y se logró eliminar bacterias y reducir la viabilidad de partículas virales, antes de incorporar el sustrato al proceso de producción del material inmunogénico. Sin embargo, actualmente existe la necesidad de realizar el escalamiento del cultivo in vitro para permitir su comercialización y aplicación masiva. Literatura recomendada Álvarez M,JA., Cantó A,G. (1985) Epidemiología de la Babesiosis. In: Parasitología. Vol. Conmemorativo de la Sociedad Mexicana de Parasitología. S.C. México, D.F Álvarez M, JA., (1991) Métodos más comunes para la prevención de la babesiosis. Segundo Seminario Internacional de Parasitología Veterinaria: Garrapatas y enfermedades que transmiten. Oaxtepec, Mor. México. Octubre 9-11, Pp

22 Álvarez M, JA., Ramos A,J., Rojas E., Mosqueda JJ., Vega M,CA., Olvera., Figueroa M,JV., Cantó A,G. (2004) Field challenge of cattle vaccined with a combined Babesia bovis and Babesia bigemina frozen inmunogen. In: Ann. NY Acad. Sci., 1026: Álvarez M,JA. y Figueroa J,V.(2007) Reseña del desarrollo de una vacuna contra la Babesiosis bovina en México. XXX Congreso Nacional de Buiatría. Bishop, J.P., Adams, L.G., Thompson, K.C. and Corrier, D.E. (1973). The isolation, separation and preservation of Babesia bigemina Trop. Anim.Health.Prod., 5: Bass, C.C. and Johns, F.M. (1912) The cultivation of malarial Plasmodia ( Plasmodium vivax and Plasmodium falciparum) in vitro. J. Exp. Med., 16: Callow, L.L. and Hoyte, H.M.D. (1961) Transmission experiments using Babesia bigemina, Theileria mutans, Borrelia sp and the cattle tick, Boophilus microplus. Aust. Vet. J., 37: Callow, L.L. and Mellors, L. T. (1967) A new vaccine against Babesia argentina infection prepared in splenectomized calves. Austr. Vet. J., 42: Callow, L.L.Vaccination against bovine babesiosis. (1977) In: Miller H, Pino J.A, McKelvey J.J (eds) Immunity to blood parasites of animals and man. Advances in experimental medicine and biology. Vol. 93. Plenum Press, New York, Callow, L.L., Mellors, L.T. and MC Gregor, W. (1979) Reduction in virulence of Babesia bovis due to rapid passage in splenectomized cattle. Int. J. Parasitol., 9: Cantó AG., Figueroa M, JV., Álvarez M,JA., Ramos A,JA., Vega M,CA. (1996) Capacidad inmunoprotectora de una clona irradiada de Babesia bovis derivada del cultivo in vitro. Tec. Pec. Mex., 34(3) :

23 Cantó GJ., Figueroa M,JV., Ramos JA, et al. (1999)Evaluación de la patogenicidad y capacidad protectora de un inmunógeno fresco combinado de Babesia bigemina y Babesia bovis. Vet. Mex., 30(3): Cantó GJ., Álvarez M,JA., Rojas R, EE., Ramos A, JA., Mosqueda G,JJ., Vega M,CA y Figueroa M,JV. (2003a) Protección contra babesiosis bovina con una vacuna mixta de Babesia bovis y Babesia bigemina derivada de cultivo in vitro bajo una confrontación de campo. Inmunización en una área libre de la enfermedad. Vet. Mex., 34: Cantó GJ., Álvarez M,JA., Rojas R, EE., Ramos A, JA., Mosqueda G,JJ., Vega M,CA y Figueroa M,JV. (2003b) Protección contra babesiosis bovina con una vacuna mixta de Babesia bovis y Babesia bigemina derivada de cultivo in vitro bajo una confrontación de campo. Inmunización en un área endémica. Téc. Pecu. Mex., 41: Erp, E.E., Gravely, S. M., Smith, R.D., Ristic, M., Osorno, B.M. and Carson, C.A. (1978) Growth of Babesia bovis in bovine erythrocyte cultures. Am. J. Trop. Med. Hyg., 27: Erp, E.E., Smith, R.D., Ristic, M. and Osorno, B.M. (1980). Continuous cultivation in vitro of Babesia bovis. Am. J. Vet. Res., 41: B Figueroa, M. J.: (1984) Cultivo in vitro de Babesia bovis: Establecimiento del sistema fase estacionaria microaerofílica y condiciones óptimas de multiplicación. Tesis de Licenciatura Esc. de Med. Vet. y Zoot. Universidad Autónoma del Estado de México. Toluca, Mex. Figueroa, M.S., Cantó, A.G., Juárez, F.J. y Ruiz, L. F.(1984) Babesia bovis: Establecimiento y condiciones óptimas de multiplicación. Téc. Pec. Mex., 46:

24 Figueroa M,JV., Cantó GJ., Álvarez M,JA. (1998) Capacidad protectora en bovinos de una cepa de Babesia bigemina derivada del cultivo in vitro. Tec. Pec. Mex., 36(2) Levy, M. and Ristic, M. (1980) Babesia bovis: Continuous cultivation in a microaerophilus stationary phase culture., Science 207: Molinar, E, James MA, Kakoma I, Holland C. and Ristic M. (1982) Antigenic and immunogenic studies on cell culture-derived Babesia canis. Vet. Parasitol.,10(1): McCosker, P.G. (1981) The global importance of babesiosis. In Ristic, M. And Kreier, J.P. (eds.) Babesiosis.Academic Press, M.Y., Pp Palmer, D.A., Buening, G.M. and Carson, C.A. (1981) Cultivation of Babesia bovis in vitro. In: Hidalgo, F.J. and Jones, E.W. (ed): Proc th 7 Natl Anaplasmosis Conf. Mississippi State University, MS., Pp Palmer, D.A., Buening, G.M. and Carson, C.A. (1982) Cryopreservation of Babesia bovis for in vitro cultivation. Parasitology, 62: Purnell, R. E. and Lewis, D. (1981) Babesia divergens. Combination of dead and live parasites in an irradiated vaccine. Res. Vet. Sci., 30: Rodríguez SD., Bueneing GM., Carson CA.(1993) Caracterización bioquímica preliminar e clonas de Babesia bovis irradiadas con 60 Co. Téc. Pec. Mex., 31: Rodriguez, S.D., Buening, G.M., Green, T.J. and Carson, C.A. (1983) Cloning of Babesia bovis by in vitro cultivation. Infect. Immun., 42:

25 Rojas MC, Figueroa MJ, Alvarado A, Mejía P, Mosqueda JJ, Falcón NA, Vega MCA, Álvarez MJA. (2006) Bovine babesiosis live vaccine production: Use or irradiation gamma on the substrate. Ann. N. Y. Acad. Sci., 1081: Smith, R.D., Osorno, B.M., Brener,J., De La Rosa, R. and Ristic, M. (1978) Bovine babesiosis: Severity and reproducibility of Babesia bovis infections induced by Boophilus microplus Under laboratory conditions. Res.Vet. Sci., 24: Timms, P. (1980). Short term cultivation of Babesia species. Res. Vet. Sci., 29: Trager, W. and Jensen, J. (1976) Human malaria parasites in continuous culture. Science, 193: Vayrynen R., Tuomi J. (1982) Continuous in vitro cultivation of Babesia divergens. Acta Vet. Scand., 23(2): Vega, C.A., Buening, G.M., Green, T.J., Carson, S.A. (1985) In vitro cultivation of Babesia bigemina. Am. J. Vet. Res., 46: Vega, C.A., Buening, G.M., Rodriguez, S.D., Carson, C.A., McLaughlin, K. (1985) Cryopreservation of Babesia bigemina for in vitro cultivation Am. J. Vet. Res., 46: Vega, C.A., Buening, G.M., Rodriguez, S.D., and Carson, C.A. (1986) Cloning of in vitro Propagated Babesia bigemina. Vet. Parasitol., 22:

26 I. Antibióticos y antifungales. Apéndice. Reactivos y Soluciones Reactivo Penicilina G sódica Estreptomicina Anfotericina-B Concentración/ml 100UI 100UI 0.025ug II. Solución de VYM 1X Reactivo CaCl 2H2O Kcl KH2PO4 MgSO4-7H2O NaCl Na2HPO4-H2O Glucosa Adenina Guanosina Agua ultra pura cbp Concentración (g) ml Esterilizar por ultrafiltración con membrana de 0.22 µm. III. Medio Base. Reactivo Medio199 TES (NaHCO3) Agua ultra pura cbp (>= 8ohm) Cantidad (g) ml Esterilizar por filtración con membrana de 0.22 micras. 23

27 IV. Medio de cultivo completo Reactivo Cantidad (%) Medio de cultivo incompleto Suero de bovino Esterilizar por filtración con membrana de 0.22 µm 24

28 Grupo Garlong Impresores, S.A. de C.V. Plaza del Árbol #7 Col Doctor Ortiz Tirado Deleg. Iztapalapa C.P 09020, México DF. Esta publicación se imprimió en Diciembre de 2009 Numero de ejemplares, 500 Jiutepec, Morelos