Utilización del cultivo in vitro de Babesia bovis para evaluar la efectividad de babesicidas.

Transcripción

1 133 Rev Biomed 1994; 5: Utilización del cultivo in vitro de Babesia bovis para evaluar la efectividad de babesicidas. Roger I. Rodríguez-Vivas 1*, Alexander J. Trees 2. 1 Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Universidad Autónoma de Yucatán. Mérida, Yucatán, México. 2 Liverpool School of Tropical Medicine. University of Liverpool. Liverpool, England. RESUMEN. Objetivo.- Determinar la factivilidad del uso del cultivo in vitro de Babesia bovis como técnica para evaluar la efectividad de babesicidas. Material y Métodos.- Una cepa Africana de Babesia bovis conservada en nitrógeno líquido fue reactivada y cultivada en el sistema estacionario microaerofílico. Se evaluó la actividad in vitro de drogas comúnmente usadas como babesicidas, mediante la determinación del 50% de concentración inhibitoria (CI 50 ) a las 48 h de exposición. Resultados.- El CI 50 de los babesicidas fue alcanzado a las siguientes concentraciones: aceturato de diminacina (5.1 x 10-6 g/ml), dipropionato de imodocarb (3.5 x 10-6 g/ml) y sulfato de quinuronio (1.3 x 10-6 g/ml). Conclusiones.- La evaluación in vitro de B. bovis puede ser una herramienta apropiada para conocer la respuesta de los babesicidas en el laboratorio y posteriormente aplicarlos a nivel de campo. Palabras claves: Babesia bovis, cultivo in vitro, Babesicidas. * Solicitud de Sobretiros: Roger I. Rodríguez-Vivas. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Universidad Autónoma de Yucatán. Km 15.5 Carretera Mérida-Xmatkuil, A.P , Mérida, Yucatán, México.. Recibido el 16 /Mayo/1994. Aceptado para publicación el 15/Julio/1994.

2 134 RI Rodríguez-Vivas, AJ Trees. SUMMARY. UTILIZATION OF IN VITRO CULTURE OF BABESIA BOVIS TO EVALUATE THE EFECTIVITY OF BABESICIDES. Objective.- To determine the feasibility of the use of in vitro cultures to determine the effectiveness of babesicides. Material and Methods.- A south African strain of Babesia bovis frozen in liquid nitrogen was thawed and cultivated in microaerophilous stationary phase. The in vitro susceptibility to commonly used babesicides was evaluated by determination of the 50% inhibitory concentration (IC 50 ). Results.- The IC 50 of babesicides was reached at the following concentrations: diminazene aceturate (5.1 x 10-6 g/ml), imidocarb dipropionate (3.5 x 10-6 g/ml) and quinuronium sulphate (1.3 x 10-6 g/ ml. Conclusions.- The in vitro evaluation of B. bovis could be a suitable tool to evaluate the response to babesicides in the laboratory and subsequently to apply them to field conditions. Key words: Babesia bovis, in vitro culture, babesicides. INTRODUCCION. La babesiosis es una de las enfermedades mas importantes transmitidas por garrapatas, y a nivel mundial al menos 1.3 billones de animales domésticos estan en riesgo de ser infectados (1). La mayoría de la población mundial bovina estimada (1.2 x 10 9 ) está potencialmente expuesta a una o más especies de babesia (2). La babesiosis causada por Babesia bovis y por B. bigemina tiene su principal influencia sobre el desarrollo de la ganadería en las regiones tropicales y subtropicales del mundo (3). Revista Biomédica En el pasado, el método tradicional para evaluar la actividad de babesicidas estuvo basado en la efectividad de drogas en ratas y ratones infectados con B. rodhaini, usando el mismo régimen descrito para evaluar compuestos antimalariales (4). Este método es limitado ya que los resultados obtenidos en roedores no son siempre aplicables a los bovinos. Un ejemplo de ello es que el diminazeno es altamente efectivo contra B. bovis, B. bigemina y B. divergens pero no es igualmente efectivo contra B. rodhaini. Hace unos años la mayoría de las pruebas para evaluar babesicidas fueron realizadas con infecciones experimentales en becerros esplenectomizados, las cuales resultaban costosas y con gran consumo de tiempo. No obstante, los relativamente nuevos babesicidas imidocarb, diminacina y amicarbalida fueron introducidos como resultado de esos estudios (5). El desarrollo del sistema microaerofílico estacionario descrito por Levy y Ristic (6) y refinado por Palmer y col. (7) y Rodríguez y col. (8), ha facilitado el estudio del diagnóstico, inmunidad, detección de epítopes y quimioterapia de la babesiosis. Recientemente una técnica in vitro para evaluar la efectividad de drogas antimalariales (9) ha sido modificada para evaluar la actividad de babesicidas usando el cultivo in vitro de B. bovis (10,11). Este método evalúa la acción inhibitoria de las drogas, mediante el grado de incorporación de 3 H-hypoxantina por el parásito. Este método tiene poca aplicación en países subdesarrollados donde las facilidades para manejar materiales radioactivos están limitadas a centros nacionales de investigación (12). No obstante, Brockelman y Tan-ariya (12) y Tan-ariya y col. (5) han desarrollado una prueba in vitro para evaluar la actividad del sulfato de quinuronio sobre B. bovis y B. bigemina. El objetivo del presente estudio fue determinar la factibilidad del uso del cultivo in vitro de B. bovis como técnica para evaluar la efectividad de tres babesicidas (imidocarb,

3 135 Cultivo de Babesia bovis y babesicidas. aceturato de diminacina y sulfato de quinuronio) mediante la determinación de sus concentraciones inhibitorias. de un 10% y almacenado a 4 C por no más de una semana. Suero del mismo animal donador fue colectado y usado en el medio de cultivo. MATERIAL Y METODOS. Establecimiento y mantenimiento del cultivo in vitro. El sistema estacionario microaerofílico descrito por Levy y Ristic (6) fue utilizado para establecer y mantener una cepa de B. bovis del sur de Africa (Kwanyanga), procedente del Centro de Medicina Veterinaria Tropical de Edimburgo, Escocia. Para el cultivo celular los parásitos fueron mantenidos en placas para cultivo de 24 pozos planos de 2.0 cm² y placas para cultivo de 96 pozos planos de 0.32 cm². Los parásitos fueron diluidos en medio completo conteniendo 40% de suero normal bovino y expuestos a 37 C bajo una condición atmosférica de 3% CO 2, 6% 0 2 y 91% N 2. Cada 24 h se realizó el cambio de medio de cultivo y cada 48 h se efectuaron subcultivos hasta reducir la parasitemia a 1% aproximadamente. La parasitemia fue determinada diariamente, mediante el conteo de 5000 eritrocitos teñidos con Giemsa al 10%. El medio de cultivo utilizado fue el M199 con sales de Hanks, 25 mm N-2 hydroxyetilpiperazina, ácido N-2-etanosulfónico (HEPES), penicilina-estreptomicina (100 UI/ml g/ml) y 40% de suero bovino. Se colectaron eritrocitos y suero de un bovino adulto negativo a B. bovis, B. bigemina y Anaplasma marginale (donador). La sangre se colectó asépticamente dentro de un frasco estéril conteniendo perlas de vidrio y fue desfibrinada mediante agitación leve. La sangre desfibrinada fue centrifugada a 1000 g por 10 min y se descartó el plasma, capa flogística y aproximadamente 20% de eritrocitos sobrenadantes. El paquete sobrante fue resuspendido en medio de cultivo hasta un volumen Preservación de B. bovis en nitrógeno líquido. El proceso de criopreservación fue realizado de acuerdo a Palmer y col. (13). Se usaron cultivos con más de 12% de parasitemia. Los parásitos fueron preservados en 10% de 14M dimetil sulfóxido (diluido en medio M199). Los parásitos fueron transferidos a -70 C por 24 h, y después a -196 C, teniendo una tasa de congelación aproximada de 20 C/min. Retiro de B. bovis del estado de congelación. El rescate del material criopreservado fue realizado según lo descrito por Palmer y col. (13). Los parásitos fueron descongelados rápidamente en agua a 37 C. Los parásitos parcialmente descongelados fueron diluídos en 12 ml de medio Ml99 (37 C) y centrifugados a 3000 g por 10 min. El paquete resultante fue resuspendido en 1.0 ml de medio de cultivo conteniendo 10% de eritrocitos no infectados; y colocados en placas de 24 pozos en una atmósfera de 3% CO 2, 6% O 2 y 91% N 2 a 37 C. El medio de cultivo fue cambiado cada 24 h y se realizaron subcultivos de acuerdo al crecimiento parasitario. Evaluación in vitro de babesicidas. El método descrito por Brockelman y Tanariya (12) fue modificado. Fueron utizados cultivos con más del 10% de parasitemia. La parasitemia fue ajustada a 0.5% mediante la adición de una suspensión de eritrocitos no infectados. Dipropionato de imidocarb al 12% (Imizol: Wellcome Research Laboratories) fue diluido en diferentes concentraciones. Se añadió 100 L de medio de cultivo a cada uno de los pozos de las placas de cultivo de 96 pozos como sigue: las columnas 2-9 de la fila A recibieron medio de

4 136 RI Rodríguez-Vivas, AJ Trees. cultivo sin droga (controles), las columnas 2-9 de la fila B recibieron medio de cultivo conteniendo 2.0 x g/ml de dipropionato de imidocarb, la fila C recibió medio de cultivo con droga a 2.0 x g/ml y así sucesivamente fue aumentando la concentración de droga hasta la fila H, la cual recibió medio de cultivo con droga a 2.0 x 10-5 g/ ml. La suspensión de 0.5% de parasitemia fue después distribuida en 100 l en cada uno de los pozos excepto en las columnas 1, 10, 11 y 12 las cuales recibieron 200 l de agua destilada estéril para prevenir evaporación. De esta forma la concentración final de la droga fue la mitad después de la dilución (1.0 x 10-5 g/ml). Se realizaron 6 réplicas de cada dilución de cada droga. Las placas fueron incubadas durante 48 h en atmósfera controlada, sin recibir cambio del medio de cultivo a las 24 h. La parasitemia de cada uno de los pozos fue evaluada a las 48 h de exposición a la droga, mediante el conteo de 5000 eritrocitos en frotis teñidos con Giemsa al 10%. Se anotaron la apariencia morfológica y el número de parásitos en la células infectadas. Las sales de aceturato de diminacina (Berenil: Hoescht Veterinar GhbH) y sulfato de quinuronio (Bayer, Ireland Ltd) fueron diluidas en medio de cultivo de 1.0 x 10-5 a 1.0 x g/ml (concentración final). Estas drogas fueron sometidas al mismo procedimiento descrito anteriormente. Se consideró como inhibición a la ausencia de crecimiento y/o a los cambios morfológicos de las babesias en el cultivo con droga. La efectividad de las drogas fue medida como el porcentaje de parasitemia después de 48 h de exposición a distintas concentraciones. El porcentaje de inhibición fue calculado según la siguiente ecuación: 100 (a-b)/a, donde a es número de parásitos en el medio de cultivo sin droga, y b es el número de parásitos en el medio con droga. El 50% de concentración inhibitoria (CI 50 ) fue definido como la concentración de droga la cual redujo el crecimiento de la población parasitaria en un 50% en relación a los controles. Revista Biomédica Los CI 50 fueron calculados mediante regresión lineal: Y= A + B (X), donde Y es el porcentaje de inhibición y X es la concentración de droga (g/ ml). RESULTADOS. B. bovis (cepa Kwanyanga) fue reactivada exitosamente de nitrógeno líquido a cultivo in vitro y se mantuvo en constante multiplicación por más de tres meses. Después de la descongelación, los parásitos se multiplicaron lentamente y fue necesario hacer subcultivos al cuarto y quinto día y después cada dos días. La morfología de los trofozoitos que aparecieron dentro de los eritrocitos fue principalmente piriforme, teniendo algunos el aspecto de anillos. La respuesta de B. bovis al dipropionato de imidocarb, aceturato de diminacina y sulfato de quinuronio se indican en la figura 1. La inhibición de la multiplicación parasitaria fue proporcional a la concentración de las drogas. La CI 50 producida por las tres drogas se indican en el cuadro 1. Después de 48 horas de exposición a las tres drogas, los estados de trofozoitos se observaron alargados, vacuolizados, pobremente teñidos y con los citoplasmas reducidos. DISCUSION. Levy y Ristic (6) encontraron en el cultivo in vitro de B. bovis que el aceturato de diminacina a una concentración de 3.5 x 10-6 g/ml inhibe el crecimiento parasitario. Esta concentración es reportada como dosis terapéutica in vivo (6). En el presente estudio se necesitó mayor concentración de aceturato de diminacina (5.1 x 10-6 g/ml) para alcanzar el CI 50 sobre B. bovis. Todorovic y col. (14) reportaron que una dosis supresiva de 2mg/kg (dipropionato de imidocarb

5 137 Cultivo de Babesia bovis y babesicidas. Figura 1.- Susceptibilidad in vitro de Babesia bovis a varias concentraciones de dipropionato de imidocarb, sulfato de quinuronio y aceturato de diminacina durante 48 h de incubación. El porcentaje de inhibición fue calculado de la media de parasitemia de 6 réplicas que tuvieron una desviación estádar menor del 2 %. Cuadro 1 Determinación del 50% de concentración inhibitoria (CI 50 ) de babesicidas en el cultivo in vitro de Babesia bovis. DROGA CI 50 (g/ml) Dipropionato de imidocarb 3.5 x 10-6 Aceturato de diminacina 5.1 x 10-6 Sulfato de quinuronio 1.3 x 10-6 por peso vivo) para controlar babesiosis, mantiene concentraciones plasmáticas de 0.5 a 1.0 x 10-6 g/ ml por varias semanas. Al igual, Aliu (15) encontró que cuando el imidocarb (4.5 mg/kg) es inyectado intramuscularmente a borregos, la máxima concentración plasmática (7.9 x 10-6 ) se alcanza en 4 h y rápidamente declina a 4.6 x 10-6 g/ml en las próximas 2 h, para que posteriormente los valores decaigan lentamente hasta la cuarta semana postratamiento. En el presente estudio el dipropionato de imidocarb alcanzó el CI 50 a una concentración de 3.5 x 10-6 g/ml, lo que indica que las pruebas in vitro podrían ser muy útiles para evaluar drogas en los laboratorios. Es posible que diferentes cepas tengan varios grados de sensibilidad a las drogas. En este estudio, el sulfato de quinuronio a 1.3 x 10-6 g/ml presentó el CI 50 sobre la cepa Kawayanga. Tan-ariya y col. (5) encontraron en cuatro aislamientos de B. bovis que los valores de el CI 50 varían de 1.72 a 2.43 x 10-6 g/ml. Al mismo tiempo, los autores reportaron el CI 50 de una cepa Mexicana a sulfato de quinuronio de 4.0 x 10-7 g/ml y al igual Brockelman y Tan-ariya (12) encontraron un CI 50 de 5.0 x 10-8 g/ml. Es difícil de establecer cual cepa fue más susceptible al sulfato de quinuronio, ya que hay algunos factores los cuales deben de ser considerados cuidadosamente. Por ejemplo, Tanariya y col. (5) trabajaron con aislamientos de campo, mientras que en el presente estudio y el de Brockelman y Tan-ariya (12) las cepas utilizadas han sido cultivadas in vitro por varios años. Las condiciones de cultivo pudieran tener algún efecto sobre las respuestas a drogas (5). Cambios genotípicos y fenotípicos han sido encontrados en Plasmodium falciparum cultivado in vitro por un largo tiempo (16). Los aislamientos de babesia pueden consistir en una mezcla de poblaciones con varios grados de sensibilidad a las drogas, como ha sido reportado en malaria (17). En cultivo es difícil de determinar el efecto real de las drogas, ya que varias reacciones fisiológicas y bioquímicas del animal están ausentes. El examen microscópico mediante el conteo de de

6 138 RI Rodríguez-Vivas, AJ Trees. parásitos en frotis teñidos con Giemsa ofrece la mejor oportunidad para analizar las alteraciones en las poblaciones parasitarias producidas por drogas, así como los cambios estructurales causados por las mismas. Además ofrece un método útil para evaluar futuros babesicidas que pudieran ser primariamente evaluados en cultivos celulares y posteriormente aplicarlos a nivel de campo. AGRADECIMIENTOS. Los autores agradecen al Dr. José L. Domínguez-Alpizar y a la Q.F.B Ligia A. Cob- Galera por su valiosa colaboración en el manuscrito del presente trabajo. REFERENCIAS. 1.- Konigshoefer HO. En: FAO-WHO-OIE ed. Animal Health Yearbook Rome: Food and Agriculture Organization, 1977: Kellermann G, Tsang KR, Kakoma I. Advances in the in vitro cultivation of Babesia species, En: Ristic M ed. Babesiosis of Domestic Animals and Man. New York: Academic Press, 1988: Ristic M, Arellano C. Research and training program in haemotropic diseases of cattle. Synopsis of accomplisments, Proc. Review of Research. Progress in bovine anaplasmosis and babesiosis. Mexico city, Mexico, 1980: Lucas JMS. The Chemotherapy of experimental babesiosis in mice and splenectomized calves. Res Vet Scien 1960; 1: Tan-Ariya P, Chetanond U, Brockelman CR. In vitro observations on drug responsiveness of Babesia bovis and on the emergency of drug Revista Biomédica resistant parasites. Protozool Res 1992; 2: Levy MG, Ristic M. Babesia bovis: continuous cultivation in a micro-aerophilous stationary phase culture. Science 1980; 207: Palmer DA, Buening GM, Carson CA. Cultivation of Babesia bovis in vitro. En: Hidalgo RJ, Jones EW ed. Proc. 7th Natt Anaplasmosis Conference. Jackson: University Press, 1981: Rodríguez SD, Buening GM, Green TJ, Carson CA. Cloning of Babesia bovis by in vitro cultivation. Infec Immunol 1983; 43: Desjardins RE, Canfield CJ, Haynes JD, Chulay JD. Quantitative assessment of anti-malarial activity by a semi-automated microdilution technique. Antimic Agents Chem 1979; 16: Irving AD, Young ER. Possible in vitro test for screening drugs for activity against Babesia and other blood protozoa. Nature 1977; 269: Nott SE, O Sullivan WJ, Gero AM, Bagnara AS. Routine screening for babesicides using cultures of Babesia bovis. J Parasitol 1990; 20: Brockelman CR, Tan-Ariya P. Development of an in vitro microtest to assess drug susceptibility of Babesia bovis and Babesia bigemina. J Parasitol 1991; 77: Palmer DA, Buening GM, Carson CA. Cryopreservation of Babesia bovis for in vitro cultivation. Parasitol 1982; 84: Todorovic RA, Vizcaino OG, González EF, Adams LG. Chemoprophylaxis (imidocarb) against Babesia bigemina and Babesia argentina

7 trombocitopénica. 139 Cultivo de Babesia bovis y babesicidas. infections. Am J Vet Res 1973; 34: Aliu YO, Davis RH, Camp BJ, Kuttler KL. Absorption, distribution and excretion of imidocarb dipropionate in sheep. Am J Vet Res 1977; 38: Brokelman CR, Tan-Ariya P, Laovanich R. Phenotypic and genotypic changes of Plasmodium falciparum cultured in vitro. En: Proceedings of Mahidol University Seminar on Malaria Vaccine Development. Bangkok, 1988: Thaithong S, Beale GH, Fenton B, et al. Clonal diversity in a single isolate of malaria parasite Plasmodium falciparum. Trans Royal Soc Trop Med Hyg 1984; 78: