Agilent Solutions. Aplicaciones Prácticas de la Cromatografía Líquida y la Espectrometría de Masas en Investigación y Control de Calidad

Transcripción

1 Agilent Solutions Aplicaciones Prácticas de la Cromatografía Líquida y la Espectrometría de Masas en Investigación y Control de Calidad Jaume C. Morales LC-MS Product Specialist 1

2 Innovación Tecnológica para Cromatografía Liquida Amplio Portfolio UHPLC 1220, 1260, 1290 UHPLC Infinity Cuaternario. UHPLC Bio-Inerte Portfolio de Nuevas Válvulas FlexCube Online Enrichment Nuevas Soluciones Multidimensionales LC x LC Soluciones MaxLight DAD x10 Sensibilidad UV: Max-Light High Sensitivity. x30 Rango Dinámico: HDR-DADTechnology. Emulación ISET

3 Innovación Tecnológica para Cromatografía Liquida Amplio Portfolio UHPLC 1220, 1260, 1290 UHPLC Infinity Cuaternario. UHPLC Bio-Inerte Portfolio de Nuevas Válvulas FlexCube Online Enrichment Nuevas Soluciones Multidimensionales LC x LC Soluciones MaxLight DAD x10 Sensibilidad UV: Max-Light High Sensitivity. x30 Rango Dinámico: HDR-DADTechnology. Emulación ISET

4 Pero Que es UHPLC? UHPLC es : Ultra High Pressure Liquid Chromatography. ( 600 bar) Cromatografía de alto rendimiento en columnas con relleno de partículas sub-2-micron (STM) o de superfície porosa. UHPLC NO es : La alta presión NO es ninguna ventaja, sino un efecto colateral indeseado. La Alta Presión no separa nada!! Cromatografía con columnas de 2.1mm. Cualquier diámetro de columna puede empaquetarse con partículas de STM. (4.6, 4.3, 3.0 ) Page 4

5 Que es UHPLC? Características de UHPLC Resolución y Flujo 1. Las partículas más pequeñas permiten una menor altura de plato teórico mostrando pues una mayor resolución cromatográfica. 2. La resolución cromatográfica sufre menos al incrementar el flujo cuanto más pequeña es la partícula Page 5

6 Toluene Toluene Que es UHPLC? 3. Las partículas más pequeñas consiguen 3. Small particles lead to narrower, picos más estrechos y más altos. higher peaks. A max cv i V R i L C h d P l 40 mau 150 mm, 5 µm 120 mau 50 mm, 1.8 µm 6 October 20, 2014

7 Beneficios de la UHPLC Las partículas más pequeñas permiten una menor altura de plato teórico mostrando pues una mayor resolución cromatográfica. La resolución cromatográfica sufre menos al incrementar el flujo cuanto más pequeña es la partícula Mayor resolución! Sin incremento de tiempo de analisis! Menor tiempo de analisis! Menor consumo de disolventes sin perdida de resolución! Las partículas más pequeñas consiguen picos más estrechos y más altos. Mayor sensibilidad! Si no se aumenta el flujo 7 20 de octubre de 2014

8 Nueva Serie Agilent 1200 Infinity Elevando el Estandard en UHPLC para el Laboratorio 1220 Infinity LC Integrado 600 bar 80 Hz El más económico HPLC y UHPLC Tecnologia 1260/ Infinity LC Modular 600 bar 80 Hz 2x ó 10x Sensivilidad UV 100% HPLC Compatible Precio HPLC Capacidades UHPLC 1290 Infinity LC Modular 1200 bar 160 Hz Máximo rendimiento UHPLC Máxima Flexibilidad Coste Servicio HPLC Page 8

9 Herramienta transformación métodos HPLC => UHPLC Method Translator and Cost Saving Calculator Esta avanzada calculadora le permite calcular el ahorro en coste del análisis basado no solo en los costes de disolventes sino también de los gastos regulares de un laboratorio. Utilícela on-line aquí ó descárguela para instalarla en su PC de octubre de 2014

10 Aportaciones de la UHPLC y MS en el Análisis Alimentario 10 October 20, 2014

11 Aplicaciones UHPLC Análisis Agro-Alimentario Pesticidas, Micotoxinas y Otros Contaminantes Fármacos Veterinarios Análisis de Suelos Suplementos Dietéticos, Compuestos Naturales y Aditivos Autentificación de Alimentos 11 October 20, 2014

12 Contenido Análisis de Suelos PAHs in Soil Suplementos Dietéticos, Compuestos Naturales y Aditivos Antioxidants in Orange Juice Total Sugar Content in Maple Sirup Plant Stanyl Fatty Acid Esters in Margarine by LC-GC coupling Water-soluble vitamins from multivitamin tablets Fat-soluble Vitamins from food matrix Flavonoids in Citrus Fruit Artificial sweeteners in diet colas Color additives in sweets 12 October 20, 2014

13 Contenido Fármacos vetrinarios Growth Promoters in Animal Feedstuff Pesticidas, Micotoxinas y otros Contaminantes Acaricides in Honey Sudan Red Compounds in Paprika Powder by online sample clean-up Bisphenol A leaching from baby bottles PAHs in Fish Hormones in Shrimp Autentificación de Alimentos Natural and Artificial Vanilla Preparations Melamine in Milk 13 October 20, 2014

14 PAHs en suelos (Hidrocarburos Poli-Aromáticos) Análisis de suelos Agilent Application Solution Analysis of PAHs in soil according to EPA 8310 method with UV and fluorescence detection Agilent Application Note EN 14 October 20, 2014

15 Background Son compuestos de alta toxicidad tanto mutagénica como carcinogénica que ha llevado a una legislación específica y rigurosa. Los PAHs suelen generarse en combustiones incompletas de material orgánico como los combustibles fósiles. A través de la atmosfera alcanzan el suelo y sedimentos en áreas apartadas de las industrias, aeropuertos y carreteras. Otros factores como fugas de aceites o la falta de cuidado en su manejo contribuyen también a la contaminación. 15 October 20, 2014

16 Análisis de la mezcla de Patrones Column ZORBAX Eclipse PAH 4.6 x 150 mm, 5 μm Mobile phase A Water Mobile phase B Acetonitrile Gradient at 0 min 40%B, at 20 min 95%B Flow rate 1.5 ml/min Col.temp.: 25 C Inj. volume 3 µl Data acq. 230 nm (ref. 400 nm) (DAD), 260 nm (Ex.) 350 nm, 420 nm, 440 nm, 500 nm (Em.) (FLD) No: Name: 1 Napthalene 2 Acenaphtylene 3 Acenaphtene 4 Fluorene 5 Phenantrene 6 Anthracene 7 Fluoranthene 8 Pyrene 9 Benzo(a)anthracene 10 Chrysene 11 Benzo(b)fl uoranthene 12 Benzo(k)fl uoranthene 13 Benzo(a)pyrene 14 Dibenzo(a,h)anthracene 15 Benzo(g,h,i)perylene 16 Indeno(1,2,3-cd)pyrene 16 October 20, 2014

17 Cambio a método UHPLC Ahorro de Tiempo y Disolvente Column Mobile phase A Mobile phase B ZORBAX Eclipse PAH RRHT 2.1 x 50 mm, 1.8 μm Water Acetonitrile Gradient at 0 min 40%B, at 4 min 95%B Flow rate Col.temp.: 25 C 0.85 ml/min Inj. volume 0.3 µl Data acq. From : 230 nm (ref. 400 nm) (DAD), 260 nm (Ex.) 350 nm, 420 nm, 440 nm, 500 nm (Em.) (FLD) Ahorro de tiempo: 80 % Ahorro en disolventes: 88 % ZORBAX Eclipse PAH 4.6 x 150 mm, 5 μm No: Name: 1 Napthalene 2 Acenaphtylene 3 Acenaphtene 4 Fluorene 5 Phenantrene 6 Anthracene 7 Fluoranthene 8 Pyrene 9 Benzo(a)anthracene 10 Chrysene 11 Benzo(b)fl uoranthene 12 Benzo(k)fl uoranthene 13 Benzo(a)pyrene 14 Dibenzo(a,h)anthracene 15 Benzo(g,h,i)perylene 16 Indeno(1,2,3-cd)pyrene 17 October 20, 2014

18 Rendimiento del método UHPLC Metodo HPLC 18 October 20, 2014

19 Antioxidantes en Zumo de Naranja Suplementos Dietéticos, Compuestos Naturales y Aditivos Agilent Application Solution Analysis of ascorbic acid, citric acid and benzoic acid in orange juice Agilent Application Note EN 19 October 20, 2014

20 Background Los antioxidantes como el ácido ascórbico previenen la oxidación de la matriz disminuyendo la cantidad de oxígeno disponible. El ácido ascórbico lo lleva a cabo mediante su propia oxidación a ácido deshidroascórbico (DHA). Los conservantes, como el ácido cítrico y benzoico previenen o inhiben el crecimiento de microorganismos en alimentos. Aunque éstos compuestos se encuentran de modo natural en algunas frutas también se añaden para una mejor conservación de los zumos. Existe un cierto temor sobre la liberación del carcinógeno benceno debido a la posible reacción del ácido benzoico con ácido ascórbico en ciertas condiciones. El método oficial para determinar vitamina C es oxidándola primero a DHA y derivatizando para detectar pro FLD. El benzoico y cítrico se detectan por UV. HO HO O O O O OH O O OH Acido ascórbico HO OH HO Acido cítrico OH OH Acido Benzoico de octubre de 2014

21 Análisis de Patrones Column Poroshell 120 EC-C x 100 mm, 2.7 μm Mobile phase A 20 mm HK 2 PO 4 in water, ph 2.5 Mobile phase B Acetonitrile/methanol 40 : 60 Gradient at 0 min 5%B, at 2 min 5%B, at 2.1 min 25%B, at 13 min 25%B, at 13.1 min 90%B, at 18 min 90%B, at 18.1 min 5 % B Stop time: 25 min Flow rate 1 ml/min Col.temp.: 20 C Inj. volume 5 µl Sample therm.: 4 C Data acq. 210 nm, 230 nm, nm, 10 Hz (DAD) mau No: Name: 1 Ascorbic acid 2 Citric acid 3 Benzoic acid min 21 October 20, 2014

22 Método UHPLC Ahorro de Tiempo y Disolvente Column Poroshell 120 EC-C x 100 mm, 2.7 μm Mobile phase A 20 mm HK 2 PO 4 in water, ph 2.5 Mobile phase B Acetonitrile/methanol 40 : 60 Gradient Stop time: Flow rate at 0 min 5%B, at 0.5 min 5%B, at 0.6 min 25%B, at 3 min 25%B, at 3.1 min 70%B, at 3.9 min 70%B, at 4 min 5 % B 5 min 1.5 ml/min Col.temp.: 20 C Inj. volume 4 µl Sample therm.: 4 C Data acq. 210 nm, 230 nm, nm, 40 Hz (DAD) Ahorro de tiempo: 80 % Ahorro en disolventes: 68 % mau No: Name: 1 Ascorbic acid 2 Citric acid 3 Benzoic acid min 22 October 20, 2014

23 Vitaminas Hidrosolubles Suplementos Dietéticos, Compuestos Naturales y Aditivos Agilent Application Solution Analysis of watersoluble vitamins from multivitamin tablets for nutrition labeling Agilent Application Note EN 23 October 20, 2014

24 Compounds & Structure HO O O HO HO OH Ascorbic acid OH OH N OH CH 3 Pyridoxine NH 2 N N + S H 3 C N H 3 C OH Thiamine chloride O N NH 2 N O OH OH H NH HO H C CH 3 3 O O OH Nicotinamide Nicotinic acid Pantothenic acid O HO OH O O NH OH N N NH H 3 C H 3 C N N HO O NH N O OH OH H HN O S NH H COOH H 2 N N N Folic acid Riboflavin OH Biotin Cyanocobalamine not shown 24 October 20, 2014

25 Analysis of Standard Mixture Column Poroshell 120 EC-C18 3 x 150 mm, 2.7 μm Mobile phase A 25 mm HK 2 PO 4 in water Mobile phase B Acetonitrile Gradient at 0 min 1%B, at 5 min 1%B, at 15 min 30%B, at 20 min 30%B, at 20.1 min 1%B Stop time: 20.1 min Post time: 5 min Flow rate 0.45 ml/min Col.temp.: 35 C Inj. volume 5 µl Sample therm.: 5 C Data acq. 205 nm, 214 nm, 220 nm, 232 nm, 266 nm, 280 nm, 20 Hz (DAD) No: Name: 1 Ascorbic acid 2 Nicotinic acid 3 Calcium pantothenate 4 Pyridoxine 5 Niacinamide 6 Thiamin 7 Folic acid 8 Biotin 9 Cyanocobalamine 10 Riboflavin 25 October 20, 2014

26 Fast UHPLC Method Ahorro de Tiempo y Disolvente Column Mobile phase A Mobile phase B Poroshell 120 EC-C x 75 mm, 2.7 μm 25 mm HK 2 PO 4 in water Acetonitrile Gradient at 0 min 1%B, at 0.56 min 1%B, at 1.66 min 30%B, at 2.2 min 30%B, at 2.22 min 1%B Stop time: Post time: Flow rate 2.22 min 1 min 1 ml/min Col.temp.: 35 C Inj. volume 1 µl Sample therm.: 5 C Data acq. 205 nm, 214 nm, 220 nm, 232 nm, 266 nm, 280 nm, 80 Hz (DAD) Ahorro de tiempo: 90 % Ahorro en disolventes: 70 % From : Poroshell 120 EC-C18 3 x 150 mm, 2.7 μm 0.45 ml/min No: Name: 1 Ascorbic acid 2 Nicotinic acid 3 Calcium pantothenate 4 Pyridoxine 5 Niacinamide 6 Thiamin 7 Folic acid 8 Biotin 9 Cyanocobalamine 10 Riboflavin 26 October 20, 2014

27 LOD/LOQ Comparable sensitivity Time savings: 90 % Solvent savings: 70 % 27 October 20, 2014

28 Acaricidas en Miel Pesticidas, Micotoxinas y otros Contaminantes Agilent Application Solution Analysis of acaricides in honey Agilent Application Note EN 28 October 20, 2014

29 Analysis of Standard Mixture Column ZORBAX Eclipse Plus C x 150 mm, 5 μm Mobile phase A Water Mobile phase B Acetonitrile Gradient at 0 min 40%B, at 15 min 90%B, at 20 min 90%B, at 20.1 min 40%B, at 25 min 40%B Stop time: 25 min Flow rate 1 ml/min Col.temp.: 30 C Inj. volume 20 µl Data acq. 230 nm, 290 nm, 10 Hz (DAD) mau No: Name: 1 Rotenone 2 Coumaphos Bromopropylate 4 Amitraz min 29 October 20, 2014

30 Coumaphos Rotenone Bromopropylate Amitraz Identification of Acaricides Honey by UV Spectra mau min Rotenone Amitraz Match factor = 990 Match factor = October 20, 2014

31 Rotenone Coumaphos Rotenone Coumaphos Amitraz Amitraz Bromopropylate Bromopropylate Fast UHPLC Method Ahorro de Tiempo y Disolvente Ahorro de tiempo: 92 % Ahorro en disolventes: 92 % mau 120 Column ZORBAX RRHD Eclipse Plus C x 50 mm, 1.8 μm Mobile phase A Water Mobile phase B Acetonitrile Gradient at 0 min 40%B, at 1.16 min 90%B, at min 90%B, at 1.56 min 40%B, at 1.93 min 40%B Stop time: 1.93 min Flow rate 0.9 ml/min From : Col.temp.: 30 C ZORBAX Eclipse Plus C x 150 mm, 5 μm Inj. volume 1.5 µl Data acq. 230 nm, 290 nm, 40 Hz (DAD) min 31 October 20, 2014

32 Acople LC/MS 6100 Single Quadrupoles 6200 TOF ifunnel 6400 Triple Quadrupoles DMRM, tmrm 6500 QTOF RapidFire Qual/Quan MassHunter Software

33 Dos enfoques de Screening La determinación de compuestos residuales puede abordarse con dos enfoques : Dirigido. Número acotado de compuestos a confirmar. Más sensible (*) El nº de compuestos depende principalmente del sistema cromatográfico y de la velocidad del MS. Sin capacidad de determinar NO esperados. Sin capacidad de análisis retrospectivo. NO Dirigido. Adquisición indiscriminada de Full Scan y/o MS/MS. El nº de compuestos a detectar es mucho mayor (casi ilimitado). La detección del compuesto se realiza a través algoritmos de deconvolución. La acotación de compuestos detectados viene limitada por la base de datos o librerías de los posibles compuestos a identificar Menos sensible (*) (*) Depende del modelo de QQQ y TOF/QTOF 33 Innovation Tour October 20, 2014

34 Dos enfoques de Screening Dirigido No dirigido 34 Innovation Tour October 20, 2014

35 Características del diseño Triple Cuadrupolo 1º Cuadrupolo Capilar dielectrico frio Cuadrupolos hiperbolicos Guía de iones octopolar Celda de colision hexapolar Detección Off-axis Una bomba turbo 3 º Cuadrupolo Guía de iones octopolar Celda de colisión (hexapolo) Detector Espectro con iones del fondo (API: ESI, APCI, ) 210 Q1 sólo deja pasar el ión precursor 210 pass 210 Celda Colisión rompe el ión 210 (y sus productos) Q3 monitoriza sólo los fragmentos 158 y 191 característicos del ión 210 para cuantificar y cualificar con máx. sensibilidad TRANSICIONES (MRM) : 210 -> 158 (Quant) y 210 -> 191 (Qual)

36 MRM dinámico (DMRM) Mejora de la sensibilidad basado en la especificidad de la transición a su tiempo Optimizer Si no se dispone de Kits de Agilent permite buscar los valores de adquisición óptimos para la cuantificación tmrm Confirmación espectral de los target sin barrido ni perdida de sensibilidad Page 36

37 Análisis por segmentos vs. MRM dinámico x Segmento 1 Segmento 2 Segmento 3 Segmento MRM Dinámico: No hay segmentos de tiempo Counts vs. Acquisition Time (min) La lista de MRM se confecciona de modo dinámico basándose en el RT de los compuestos de interés Menor tiempo de ciclo/mejor definición de pico

38 Abundance >>> MRM dinámico - Simulación Concurrent Compounds Time >>>

39 Typical results: 10 pg Atrazine on-column using Dynamic MRM 6460A QQQ with Jet Stream Technology Avg. Signal Height: 15,650 Avg. Signal Area: 50,966 RSD: 3.2 % Estimated LOQ: 100 fg or less 6-7 data points above FWHM 3 sec FWHM, 6 valley 20 data points baseline-to-baseline 3 sec FWHM 10% valley

40 Dynamic MRM of 300 Pesticides two Transitions Each Run with 1200-SL LC 2.1 x 100 C18 Eclipse PLUS 1.8 u Page 40

41 Fundamentos del tmrm y aplicaciones Screening Dirigido Mayor confianza en la confirmación 41 Innovation Tour 20 de octubre de 2014

42 Triple Cuadrupolo 1º Cuadrupolo Capilar dielectrico frio Cuadrupolos hiperbolicos Guía de iones octopolar Celda de colision hexapolar Detección Off-axis Una bomba turbo 3 º Cuadrupolo Guía de iones octopolar Celda de colisión (hexapolo) Detector Espectro con iones del fondo (API: ESI, APCI, ) 210 Q1 sólo deja pasar el ión precursor 210 pass 210 Celda Colisión rompe el ión 210 (y sus productos) Q3 monitoriza sólo los fragmentos 158 y 191 característicos del ión 210 para cuantificar y cualificar con máx. sensibilidad TRANSICIONES (MRM) : 210 -> 158 (Quant) y 210 -> 191 (Qual)

43 Para qué sirve el triggered MRM? Cuantificación y Confirmación : Fingerprinting Enfoque de barrido: Barrido de la huella del compuesto Estrategia tmrm: Foco en las características (fragmentos) del compuesto Dos posibles escenarios: - Confirmación de positivos con información adicional (confirmación espectral) Mayor confianza en la confirmación - Eliminación de negativos debido a interferencias de la matriz 43 Innovation Tour 20 de octubre de 2014

44 Triggered MRM (tmrm) Data Dependent : ~ Scan Especifico con la Sensibilidad y Rapidez de un MRM 1 MRM de monitorización por compuesto dispara hasta 8 MRM de confirmación de cada uno de los compuestos detectados Cuantificar e Identificar con la sensibilidad y rapidez de un MRM Secondary MRM Transitions are Triggered Triggered cycle (above threshold) Primary cycle (below threshold) Threshold Muy útil para cuantificación y confirmación masiva de analitos con Triple Cuadrupolo: análisis multiresiduos, metabolitos Página 44

45 tmrm Product Ion Spectrum x x > > > > > x x x x > 132 x > x > 147 x > x tmrm Product Ion Spectrum

46 tmrm Library Searching Tebufenpyrad Standard 50 ppb Library match score: 96.75

47 tmrm LC/MS Application Kits Targeted Screening with QQQ Pesticides -Test Mix: 253 compounds Method -DB: ~700 compounds -Library: ~250 compounds Veterinary Drugs -Test Mix: 146 compounds -DB: ~1,000 compounds -Library: ~140 compounds tmrm Database LC/MS Application Kits Standards Forensic Toxicology -Test Mix: 139 compounds -DB: ~2,500 compounds LC Column On Site Training -Library: ~130 compounds Mayor confianza en la confirmación 47 Innovation Tour 20 de octubre de 2014

48 C o u n t s C o u n t s Muestras Reales Tebufenpyrad en extracto de gengibre > 117.0, > x10 5 Ratio = 46.9 (209.9 %) Acquisition Time (min) + MRM ( min, 13 scans) ( > * x Lib Match Score= Reference spectrum Mass-to-Charge (m/z) 48 Innovation Tour 20 de octubre de 2014

49 Muestras Reales Tebufenpyrad en extracto de gengibre Reference spectrum 49 Innovation Tour 20 de octubre de 2014

50 Counts Muestras reales Tebuthiuron en extracto de camamilla > 172.1, > x10 4 Ratio = 19.8 (100.6 %) Acquisition Time (min) Reference spectrum 50 Innovation Tour 20 de octubre de 2014

51 Compounds at a glance Eficaz herramienta gráfica y rápida de revisión de resultados 51 Innovation Tour 20 de octubre de 2014

52 Análisis toxicológico por LC/MS 65 compuestos farmacéuticos y drogas de abuso en orina en una sola inyección Jaume C. Morales MS Product Specialist Agilent Technologies Spain Octubre 2011 MAD/BCN

53 Tiempo de Retención Listado de Compuestos Target y Metabolitos estudiados (en orden de elución cromatográfica) tes/opiods Opitates/Opiods ISTDs Stimulants Sedatives/Hypnotics ISTDs Sedatives/Hypnotics ISTDs Stimulants ISTDs ISTDs Abused/Other ISTDs AbusedI or-codeine nor-codeine 7-aminoflunitrazepam d-amphetamine Morphine morphine-d6 Morphine morphine-d6 MDA zolpidem mda-d5 MDA zolpidem zolpidem-d6 mda-d5 zolpidem-d6 Verapamil Verap xymorphone Oxymorphone methamphetamine Flurazepam methamphetamine Flurazepam carisoprodol carisop dromorphone hydromorphone-d6 Hydromorphone hydromorphone-d6 MDMA Clonazepam mdma-d5 Clonazepam MDMAclonazepam-d4 mdma-d5 11-nor-9-carboxy-delta9-thc clonazepam-d4 11-nor-9-carbo ydrocodeine dihydrocodeine MDEA Nitrazepam Nitrazepam MDEA nitrazepam-d5 nitrazepam-d5 naloxone naloxone phentermine alpha-hydroxytriazolam phentermine-d5 alpha-hydroxytriazolam phentermine phentermine-d5 Codeine codeine-d6 Codeine Benzoylecgonine codeine-d6 Flunitrazepam benzoylecgonine-d8 Benzoylecgonine Flunitrazepam benzoylecgonine-d8 Oxycodone Oxycodone ritalininc alpha-hydroxyalprazolam acid alpha-hydroxyalprazolam ritalininc acid naltrexone naltrexone zopiclone lorazepam zopiclone-d4 zopiclone lorazepam zopiclone-d4 ydrocodone hydrocodone-d6 Hydrocodone hydrocodone-d6 Cocaine oxazepam cocaine-d3 Cocaine oxazepam cocaine-d3 oacetyl morphine 6-monoacetyl 6-acetylmorphine-d6 6-acetylmorphine-d6 Methylphenidate 2-OH-ethylflurazepam methylphenidate-d9 2-OH-ethylflurazepam Methylphenidate methylphenidate-d9 xybenzoylecgonine m-hydroxybenzoylecgonine Cocaethylene alpha-hydroxyethylflurazepam cocaethylene-d8 alpha-hydroxyethylflurazepam Cocaethylene cocaethylene-d8 smethyltramadol o-desmethyltramadol meprobamate Triazolam meprobamate Triazolam or-fentanyl norfentanyl-d5 nor-fentanyl fenfluramine norfentanyl-d5 NorFludiazepam fenfluramine-d10 fenfluramine NorFludiazepam fenfluramine-d10 tramadol tramadol-13c-d3 tramadol-13c-d3 desalkylflurazepam desalkylflurazepam alpha-hydroxymidazolam alpha-hydroxymidazolam Heroin heroin-d9 Heroin heroin-d9 tapentadol tapentadol-d3 Alprazolam tapentadol-d3 Alprazolam alprazolam-d5 alprazolam-d5 smethyltramadol N-desmethyltramadol Temazepam Temazepam Chlordiazepoxide Chlordiazepoxide chlordiazepoxide-d5 chlordiazepoxide-d5 Meperidine meperidine-d4 Meperidine meperidine-d4 Midazolam Midazolam midazolam-d4 midazolam-d4 ormeperidine Normeperidine Desmethyl diazepam Desmethyl diazepam buprenorphine norbuprenorphine Nordiazepam Nordiazepam Fentanyl fentanyl-d5 Fentanyl fentanyl-d5 diazepam diazepam diazepam-d5 diazepam-d5 Trazodone Trazodone EDDP ropoxyphene propoxyphene Methadone uprenorphine eddp-d3 EDDP propoxyphene-d5 Propoxyphene norpropoxyphene methadone-d9 Methadone buprenorphine-d4 Buprenorphine d-amphetamine 7-aminoflunitrazepam eddp-d3 propoxyphene-d5 methadone-d9 buprenorphine-d4 PCP >65x Iones positivos PC

54 Isobáricos La separación cromatográfica es de gran ayuda. Iones de masa Isobárica Definidos como iones diferentes que tienen masa idéntica Morphine (C 17 H 20 NO 3 ) [M+H] + = 286 m/z Codeine (C 18 H 22 NO 3 ) [M+H] + = 300 m/z Methamhetamine (C 10 H 16 N) [M+H] + = 150 m/z Hydromorphone (C 17 H 20 NO 3 ) [M+H] + = 286 m/z Hydrocodone (C 18 H 22 NO 3 ) [M+H] + = 300 m/z Phentermine (C 10 H 16 N) [M+H] + = 150 m/z

55 morphine hydromorphone codeine hydrocodone phentermine Cromatografía Es la Base del Método Analítico methamphetamine

56 Método HPLC Toxicológico Screen/Quant Exhaustivo en 6 min. Agilent 1260 HPLC series Binary Pump, Well Plate Sampler, Thermostatic Column Compartment Column: Zorbax Poroshell 120 SB C18 (2.1 x 100 mm 2.7µm) Injection volume: 5 µl Column Temp: 55 C (Analytical column) Needle Wash: MeOH (100%) Mobile Phase: Pump A = H 2 O & 5mM NH 4 Formate & 0.01% Formic acid Pump B = Methanol & 0.01% Formic acid Flow rate : 0.5 ml/min Stop time: 6.0 min Equilibration time: 1.5 min Gradient: Time (min) %B

57 Columnas Poroshell 120 para HPLC y UHPLC: Poroshell 120 es una opción de columna de alta eficacia y resolución para mejorar la productividad en LC y LC/MS Características de las Poroshell 120 : 80-90% eficacia de las sub 2um A ~40-50% menor presión 2X eficacia de 3.5um (totalmente porosa) Sin el doble de presión de las 3.5um Frita de 2um para reducir obturaciones Límite de presión de 600 bar para el uso en HPLC o UHPLC. 0.5um 1.7um La partícula porosa está formada por un núcleo sólido de 1.7um diam. y una capa porosa exterior con un grosor de difusión de 0.5um. 0.5um

58 Análisis Toxicológico Dirigido (Target) por QQQ Observaciones : El potencial de un conjunto tan abundante de compuestos (>65) podría mermar las posibilidades de un instrumento QQQ, con limitaciones de dwell-time : Exhaustivo Barrido y Cuantificación en 6 min. Con Patrones Internos ( 20 ) Curvas de Calibrado con Patrón Externo ( 65 ) Con éstas condiciones, un método normal Multi Reaction Monitoring (MRM) de MS/MS resultaría muy comprometido debido a la cantidad de analitos (2 transiciones x cada uno) además de los respectivos Patrones Internos isotópicos. El número de MRMs en éste exhaustivo método asciende a >170 en éstas condiciones. Es necesario enfocarlo a un análisis por Dynamic MRM Dwell-time : tiempo que el QQQ dedica a cada transición en cada ciclo

59 Listado de algunas Drogas y Metabolitos y sus condiciones de adquisición (Dynamic MRM) Compound Name ISTD? Prec Ion MS1 Res Prod Ion MS2 Res Frag (V) CE (V) Ret Ret Time Window Polarity Oxymorphone Unit 284 Unit Positive Oxymorphone Unit 227 Unit Positive Morphine Unit Unit Positive Morphine Unit 152 Unit Positive Hydromorphone Unit 185 Unit Positive Hydromorphone Unit 157 Unit Positive Codeine Unit Unit Positive Codeine Unit 58.1 Unit Positive Naloxone Unit 310 Unit Positive Naloxone Unit Unit Positive Oxycodone Unit Unit Positive Oxycodone Unit Unit Positive Naltrexone Unit 324 Unit Positive Naltrexone Unit 55 Unit Positive Hydrocodone Unit 199 Unit Positive Hydrocodone Unit 128 Unit Positive 6-monoacetyl morphine Unit Unit Positive 6-monoacetyl morphine Unit 43.1 Unit Positive d-amphetamine Unit Unit Positive d-amphetamine Unit 91 Unit Positive methamphetamine Unit 119 Unit Positive methamphetamine Unit 91 Unit Positive MDMA Unit 163 Unit Positive MDMA Unit 105 Unit Positive Pain Management

60 Fácil Desarrollo y Personalización del Método Base de Datos que contiene más de 200 compuestos. Cada uno con mútiples transiciones MRM para asegurar una rápida creación y desarrollo del método

61 Find By MRM (Cualitativo) 65 Analitos Toxicológicos /37 ISTDs (Ionización Positiva)

62 Revisión de los espectros tmrm Los espectros MRM pueden buscarse utilizando NIST LC/MS/MS o librerías própias

63 Increasing Retention Time List of Analytes and ISTDs (a) (Listed in order of Elution) Opitates/Opiods ISTDs Stimulants ISTDs nor-codeine d-amphetamine Morphine morphine-d6 MDA mda-d5 Oxymorphone methamphetamine Hydromorphone hydromorphone-d6 MDMA mdma-d5 dihydrocodeine MDEA naloxone phentermine phentermine-d5 Codeine codeine-d6 Benzoylecgonine benzoylecgonine-d8 Oxycodone ritalininc acid naltrexone zopiclone zopiclone-d4 Hydrocodone hydrocodone-d6 Cocaine cocaine-d3 6-monoacetyl morphine 6-acetylmorphine-d6 Methylphenidate methylphenidate-d9 m-hydroxybenzoylecgonine Cocaethylene cocaethylene-d8 o-desmethyltramadol meprobamate nor-fentanyl norfentanyl-d5 fenfluramine fenfluramine-d10 tramadol Heroin tapentadol N-desmethyltramadol Meperidine Normeperidine norbuprenorphine Fentanyl Trazodone EDDP Propoxyphene norpropoxyphene Methadone Buprenorphine tramadol-13c-d3 heroin-d9 tapentadol-d3 meperidine-d4 fentanyl-d5 eddp-d3 propoxyphene-d5 methadone-d9 buprenorphine-d4

64 Increasing Retention Time List of Analytes and ISTDs (b) (Listed in order of Elution) Sedatives/Hypnotics ISTDs Abused/Other ISTDs 7-aminoflunitrazepam PCP pcp-d5 zolpidem zolpidem-d6 Verapamil Flurazepam carisoprodol carisoprodol-d7 Clonazepam clonazepam-d4 11-nor-9-carboxy-delta9-thc 11-nor-9-carboxy-delta9-thc-d9 Nitrazepam alpha-hydroxytriazolam Flunitrazepam alpha-hydroxyalprazolam lorazepam oxazepam 2-OH-ethylflurazepam alpha-hydroxyethylflurazepam Triazolam NorFludiazepam desalkylflurazepam alpha-hydroxymidazolam Alprazolam Temazepam Chlordiazepoxide Midazolam Desmethyl diazepam Nordiazepam diazepam nitrazepam-d5 alprazolam-d5 chlordiazepoxide-d5 midazolam-d4 diazepam-d5 *NB Not all ISTDs are shown in these slides

65 Matrices Típicas en el Análisi Toxicológico Matrices Comunes Orine Sangre Sangre directa Plasma Suero Matrices Alternativas Fluido Oral Sudor Pelo Meconio

66 Enfoques en la preparación de muestra (Orine) Diluir e inyectar Otras opciones incorporando: Inorganic acid hydrolysis Glucuronidase hydrolysis La más rápida preparación Puede sufrir de efecto matriz (supresión iónica) en muestras de alta carga. Menor sensibilidad Posibilidad de un alto numero de Falsos Negativos Extracción en Fase Sólida (SPE) Diferentes técnicas y fases dependiendo de la naturaleza ácida/básica del analito Un solo protocolo no es necesariamente bueno para todos los analitos en conjunto. Típicamente mayor tiempo de preparación de muestra Más caro Muestras más Limpias Mayor Sensibilidad

67 Preparación de muestra. SPE (Compuestos Básicos) Paso 1: 1ml orina + 100ul de β-glucuronidasa (requiere 6,200 units/ml de orina; utilizando al menos 10,000 units/ml) 60 C durante 2 horas [β-glucuronidase usada ( 100,000 units/ml)] Paso 2: Sample Plexa DAU (30 mg) 0.2 ml urine Sample Pre-treatment Dilute 0.6 ml 100 mm KH 2 PO 4 SPE-Conditioning 1/ 0.5mL MeOH 2/ 0.5 ml H 2 O SPE-Washes 1/ 0.5mL 50% MeOH in H 2 O 2/ Dry for 5 minutes Elution 0.5 ml 50:50:5 (EtAc:MeOH:NH 3 OH) Las muestras se evaporaron hasta los ~200 μl y se añadieron 100 μl de HCl 0.2% en MeOH. Luego se evaporaron a sequedad y se reconstituyeron en 100 μl de Ácido Fórmico 0.01%

68 Preparación de Muestra Diluir e Inyectar Paso 1: 1ml orina + 100ul de β-glucuronidasa (requiere 6,200 units/ml de orina; utilizando al menos 10,000 units/ml) 60 C durante 2 horas [β-glucuronidase usada ( 100,000 units/ml)] ó 1ml orine + 100ul de HCl 5M, 60 C durante 1 hora Paso 2: Sample Dilution in Water 1/10 Sample Pre-treatment Conditioning 3K 12,000 RPM Centrifuge spin filter Decant Supernatant into sampling well or vial.

69 Opiáceos Sedantes Resultados de Sensibilidad 6420 QQQ Diluir/Inyectar (dil. 1/10) versus SPE Compuesto D/Shoot LLOQ (ng/ml) SPE LLOQ (ng/ml) ULOQ (ng/ml) 6-monoacetyl morphine 10 < buprenorphine codeine 25 < dihydrododeine 25 < EDDP 10 < fentanyl 1 < heroin 10 < hydrocodone 10 < hydromorphone 5 < meperidine 5 < methadone 10 < morphine 5 < naloxone 5 < naltrexone 10 < N-desmethyltramadol norbuprenorphine norfentanyl 1 < normeperidine 5 < norpropoxyphene 5 < o-desmethyltramadol 5 < oxycodone 10 < oxymorphone 5 < propoxyphene 5 < tapentadol 5 < tramadol 1 < trazodone 1 < Compuesto D/Shoot LLOQ (ng/ml) SPE LLOQ (ng/ml) ULOQ (ng/ml) 2-OH-ethylflurazepam aminoclonazepam 10 < aminoflunitrazepam 5 < alpha-oh-midazolam 10 < alprazolam 10 < a-oh-alprazolam 20 < a-oh-triazolam 50 < chlordiazepoxide 10 < clonazepam 25 to 50 < desalkylflurazepam diazepam 10 < flunitrazepam flurazepam lorazepam midazolam 10 < nitrazepam nordiazepam 25 < oxazepam temazepam 25 < triazolam 5 < zolpidem 5 <1 1000

70 Resultados de Sensibilidad 6420 QQQ Diluir/Inyectar (dil. 1/10) versus SPE (continuación) Estimulantes Otros D/Shoot LLOQ (ng/ml) SPE LLOQ (ng/ml) Compound ULOQ amphetamine 5 < benzoylecgonine 5 < cocaethylene 5 < cocaine 5 < fenfluramine 1 < MDA 5 < MDEA 1 < MDMA 5 < meprobamate methamphetamine 1 < methylphenidate 5 < m-hydroxybenzoylecgonine 10 < phentermine 1 < zopiclone 5 < D/Shoot LLOQ (ng/ml) SPE LLOQ (ng/ml) Compound ULOQ 11-nor-9-carboxy-THC carisoprodol PCP 1 < ritalinic acid verapamil 2 <1 1000

71 Rendimiento de la Poroshell 120 después de 3000 inyecciones (Dil e Iny) Analito %RSD (RT) Analito %RSD (RT) Analito %RSD (RT) Morphine 0.7 Meperidine 0.4 Triazolam 0 Codeine 0.4 zolpidem 0.3 Naltrexone 0.1 hydrocodone 0.4 Fentanyl 0.1 chlordiazepoxide 0.1 MDMA 0.3 EDDP 0.1 Desmethyl diazepam norfentanyl 0.2 Nitrazepam 0.1 Buprenorphine 0.3 Heroin 0.2 Propoxephine 0.1 Cocaethylene 0.2 Methyl Phenidate 0.2 Buprenorphine nor-9-carboxydelta9-thc Muestra de algunos de los analitos en el análisis de 6 min.

72 N U E V O 6495 L C / M S T R I P L E C U A D R U P O L O Sensibilidad a niveles de Zeptomol! Prestaciones máximas en un tamaño más reducido ifunnel Technology Un nuevo paradigma en el muestreo de iones a presión atmosférica 30X sensitivity en ESI Mejora de la robustez de los ensayos y simplifica la preparación de muestra Celda de colisión curvada Transmisión muy eficiente; ruido minimizado Diseño compacto Nuevas posibilidades en scan Aislamiento del ion precursor a 0.4 m/z precursor, que reduce interferencias Dynamic MRM (DMRM) Triggered MRM (tmrm)

73 ifunnel Technology Captura x10 veces más Iones Agilent Jet Stream Confinamiento térmico de la pluma de ESI. Muy eficiente desolvatación para crear iones en fase gaseosa. Crea una zona rica en iones. Hexabore Capillary Capilar con 6 entradas. Muestrea x10 más gas rico en iones de la fuente. Captura la mayor parte del gas de la región de la fuente. Dual Ion Funnel Elimina el gas, pero captura los iones Elimina el ruido de neutros Prolonga la vida útil de la bomba turbo 4-26m Página 73

74 Ion Funnel de 2 Etapas Desalineadas 1ª Etapa: 8-12 Torr 2ª Etapa: 1-3 Torr Elimina una elevada carga de gas Reduce neutros Mejora la robustez Transmite iones muy eficientemente hacia óptica de Q1 2 etapas desalineadas -----: favorece la transmisión de sólo iones Página 74

75 Muchas Gracias por su Atención Mass Spectrometry Technology Products Solutions NEW NEW