Análisis toxicológico por LC/MS 65 compuestos farmacéuticos y drogas de abuso en orina en una sola inyección

Transcripción

1 Análisis toxicológico por LC/MS 65 compuestos farmacéuticos y drogas de abuso en orina en una sola inyección Jaume C. Morales MS Product Specialist Agilent Technologies Spain Octubre 2011 MAD/BCN

2 Introducción Enfoque a un método estándar para LC/MS : Exhaustivo conjunto de compuestos farmacéuticos y drogas de abuso Agenda: Optima metodología del análisis utilizando un sistema Agilent LC/MS QQQ Herramientas de control y Software diseñadas para facilitar el desarrollo del método Personalización de conjuntos de compuestos y metabolitos de diferentes clases (opiáceos/ estimulantes/ sedantes/ otros de abuso). Enfoques en la preparación de la muestra Dilución e inyección versus técnicas de extracción SPE. Típicos resultados del rendimiento del método analítico

3 Tiempo de Retención Listado de Compuestos Target y Metabolitos estudiados (en orden de elución cromatográfica) tes/opiods Opitates/Opiods ISTDs Stimulants Sedatives/Hypnotics ISTDs Sedatives/Hypnotics ISTDs Stimulants ISTDs ISTDs Abused/Other ISTDs AbusedI or-codeine nor-codeine 7-aminoflunitrazepam d-amphetamine Morphine morphine-d6 Morphine morphine-d6 MDA zolpidem mda-d5 MDA zolpidem zolpidem-d6 mda-d5 zolpidem-d6 Verapamil Verap xymorphone Oxymorphone methamphetamine Flurazepam methamphetamine Flurazepam carisoprodol carisop dromorphone hydromorphone-d6 Hydromorphone hydromorphone-d6 MDMA Clonazepam mdma-d5 Clonazepam MDMAclonazepam-d4 mdma-d5 11-nor-9-carboxy-delta9-thc clonazepam-d4 11-nor-9-carbo ydrocodeine dihydrocodeine MDEA Nitrazepam Nitrazepam MDEA nitrazepam-d5 nitrazepam-d5 naloxone naloxone phentermine alpha-hydroxytriazolam phentermine-d5 alpha-hydroxytriazolam phentermine phentermine-d5 Codeine codeine-d6 Codeine Benzoylecgonine codeine-d6 Flunitrazepam benzoylecgonine-d8 Benzoylecgonine Flunitrazepam benzoylecgonine-d8 Oxycodone Oxycodone ritalininc alpha-hydroxyalprazolam acid alpha-hydroxyalprazolam ritalininc acid naltrexone naltrexone zopiclone lorazepam zopiclone-d4 zopiclone lorazepam zopiclone-d4 ydrocodone hydrocodone-d6 Hydrocodone hydrocodone-d6 Cocaine oxazepam cocaine-d3 Cocaine oxazepam cocaine-d3 oacetyl morphine 6-monoacetyl 6-acetylmorphine-d6 6-acetylmorphine-d6 Methylphenidate 2-OH-ethylflurazepam methylphenidate-d9 2-OH-ethylflurazepam Methylphenidate methylphenidate-d9 xybenzoylecgonine m-hydroxybenzoylecgonine Cocaethylene alpha-hydroxyethylflurazepam cocaethylene-d8 alpha-hydroxyethylflurazepam Cocaethylene cocaethylene-d8 smethyltramadol o-desmethyltramadol meprobamate Triazolam meprobamate Triazolam or-fentanyl norfentanyl-d5 nor-fentanyl fenfluramine norfentanyl-d5 NorFludiazepam fenfluramine-d10 fenfluramine NorFludiazepam fenfluramine-d10 tramadol tramadol-13c-d3 tramadol-13c-d3 desalkylflurazepam desalkylflurazepam alpha-hydroxymidazolam alpha-hydroxymidazolam Heroin heroin-d9 Heroin heroin-d9 tapentadol tapentadol-d3 Alprazolam tapentadol-d3 Alprazolam alprazolam-d5 alprazolam-d5 smethyltramadol N-desmethyltramadol Temazepam Temazepam Chlordiazepoxide Chlordiazepoxide chlordiazepoxide-d5 chlordiazepoxide-d5 Meperidine meperidine-d4 Meperidine meperidine-d4 Midazolam Midazolam midazolam-d4 midazolam-d4 ormeperidine Normeperidine Desmethyl diazepam Desmethyl diazepam buprenorphine norbuprenorphine Nordiazepam Nordiazepam Fentanyl fentanyl-d5 Fentanyl fentanyl-d5 diazepam diazepam diazepam-d5 diazepam-d5 Trazodone Trazodone EDDP ropoxyphene propoxyphene Methadone uprenorphine eddp-d3 EDDP propoxyphene-d5 Propoxyphene norpropoxyphene methadone-d9 Methadone buprenorphine-d4 Buprenorphine d-amphetamine 7-aminoflunitrazepam eddp-d3 propoxyphene-d5 methadone-d9 buprenorphine-d4 PCP >65x Iones positivos PC

4 Isobáricos La separación cromatográfica es de gran ayuda. Iones de masa Isobárica Definidos como iones diferentes que tienen masa idéntica Morphine (C 17 H 20 NO 3 ) [M+H] + = 286 m/z Codeine (C 18 H 22 NO 3 ) [M+H] + = 300 m/z Methamhetamine (C 10 H 16 N) [M+H] + = 150 m/z Hydromorphone (C 17 H 20 NO 3 ) [M+H] + = 286 m/z Hydrocodone (C 18 H 22 NO 3 ) [M+H] + = 300 m/z Phentermine (C 10 H 16 N) [M+H] + = 150 m/z

5 morphine hydromorphone codeine hydrocodone phentermine Cromatografía Es la Base del Método Analítico methamphetamine

6 Método HPLC Toxicológico Screen/Quant Exhaustivo en 6 min. Agilent 1260 HPLC series Binary Pump, Well Plate Sampler, Thermostatic Column Compartment Column: Zorbax Poroshell 120 SB C18 (2.1 x 100 mm 2.7µm) Injection volume: 5 µl Column Temp: 55 C (Analytical column) Needle Wash: MeOH (100%) Mobile Phase: Pump A = H 2 O & 5mM NH 4 Formate & 0.01% Formic acid Pump B = Methanol & 0.01% Formic acid Flow rate : 0.5 ml/min Stop time: 6.0 min Equilibration time: 1.5 min Gradient: Time (min) %B

7 Columnas Poroshell 120 para HPLC y UHPLC: Poroshell 120 es una opción de columna de alta eficacia y resolución para mejorar la productividad en LC y LC/MS Características de las Poroshell 120 : 80-90% eficacia de las sub 2um A ~40-50% menor presión 2X eficacia de 3.5um (totalmente porosa) Sin el doble de presión de las 3.5um Frita de 2um para reducir obturaciones Límite de presión de 600 bar para el uso en HPLC o UHPLC. 0.5um 1.7um La partícula porosa está formada por un núcleo sólido de 1.7um diam. y una capa porosa exterior con un grosor de difusión de 0.5um. 0.5um

8 Poroshell 120 Resiste Obturaciones. Frita de 2 um Vália para Plasma o Matrices similares Test de ESFUERZO!!! 2500 Inyecciones consecutivas de Diflusinal en Plasma precipitado Columna: Poroshell 120 EC-C18, 3.0 x 50mm, 2.7um LC: Agilent 1200 RRLC (SL) Muestra: Plasma Precipitado 2 partes de Plasma 7 partes 20/80 Agua-ACN 0.1 % Ácido Fórmico 1 Parte Diflusinal 10 ug/ml en 50/50 Agua-ACN Concentration final Diflusinal 1 ug/ml Agitar y dejar reposar 10 minutos SIN Centrifugado/ SIN Filtrado Volumen Inyección : 1ul Canal A: Agua w/0.1 % TFA Canal B: ACN 0.08 % TFA Flujo 1 ml/min, Inyección1 ul Tiempo % B Cómo evolucionan la PRESIÓN y la EFICACIA?

9 Pressure Efficiency (N) Poroshell 120 Resiste Obturaciones. Frita de 2 um Vália para Plasma o Matrices similares Columna: Poroshell 120 EC-C18, 3.0 x 50mm, 2.7um LC: Agilent 1200 RRLC (SL) Muestra: Plasma Precipitado: 2 partes de Plasma: 7 partes 20/80 Agua-ACN 0.1 % Ácido Fórmico : 1 Parte Diflusinal 10 ug/ml en 50/50 Agua-ACN (Concentration final Diflusinal 1 ug/ml) Agitar y dejar reposar 10 minutos SIN Centrifugado/ SIN Filtrado Volumen Inyección : 1ul Diflusinal in Plasma Injections End Press Plates Canal A: Agua w/0.1 % TFA Canal B: ACN 0.08 % TFA Flujo 1 ml/min, Inyección1 ul Tiempo % B !Buena resistencia con muestras de Plasma!

10 Especificaciones de Fases Ligadas para Poroshell 120 Poroshell 120 EC-C18 Rango ph 2-9 Ideal para la mayoría de fases móbiles LC/MS Endcapped mejor perfil de pico Carga carbón 8% Superficie específica 3.3 umol/m 2 O O O O O CH Si CH3 CH CH CH Si Si CH3 CH Si CH CH Si CH CH CH 3 3 Endcapped Poroshell 120 SB-C18 Rango ph 1-8 mayor resistencia a muy bajo ph Non-endcapped para selectividad mixta Carga carbón 7.5% Superficie específica 2.1 umol/m 2 O O O OH OH R Si R R Si R R Si R Grupos Voluminosos para mejor resistencia a ph 1-2 Material Base: Tamaño de poro :120Å; Tamaño Particula : 2.7um; Superfície: 130 m 2 /g

11 Análisis Toxicológico Dirigido (Target) por QQQ Observaciones : El potencial de un conjunto tan abundante de compuestos (>65) podría mermar las posibilidades de un instrumento QQQ, con limitaciones de dwell-time : Exhaustivo Barrido y Cuantificación en 6 min. Con Patrones Internos ( 20 ) Curvas de Calibrado con Patrón Externo ( 65 ) Con éstas condiciones, un método normal Multi Reaction Monitoring (MRM) de MS/MS resultaría muy comprometido debido a la cantidad de analitos (2 transiciones x cada uno) además de los respectivos Patrones Internos isotópicos. El número de MRMs en éste exhaustivo método asciende a >170 en éstas condiciones. Es necesario enfocarlo a un análisis por Dynamic MRM Dwell-time : tiempo que el QQQ dedica a cada transición en cada ciclo

12 Qué es MRM? (Multiple Reaction Monitoring) Ions Espectro con iones de matriz (fuente ESI) Q1 deja pasar solamente el ión m/z 210 La Celda de Colisión rompe el ion m/z 210 en fragmentos Q3 sólo deja pasar los fragmentos característicos del ion mz/ 210 : y 191 para cuant y cual no hay ruido químico

13 Tiempo por ciclo Determinado por Anchura de pico (>12 puntos por pico) El conflicto para las condiciones perfectas de adquisición (*) 15 puntos por pico Número de MRMs Concurrentes Máximo Dwell Time

14 MassHunter Dynamic MRM Muchas aplicaciones requieren el barrido de compuestos en un método MRM Forensic analysis, Food and Environmental Subsequent quantitation of positives in dedicated methods SIN Dynamic MRM Necesidad de programar manualmente múltiples segmentos para maximizar el dwell time Tarea tediosa y frágil para cromatogramas con desvíos de tiempos CON Dynamic MRM Programación Automática de segmetos solapados sin intervención del usuario Menor número de MRMs por tiempo permite mayores dwell time/sensibilidad Inmune a desviaciones de Rt

15 Principios de funcionamiento de Dynamic MRM Time Segment 1 Time Segment 2 Time Segment 3 Time Segment 4 Time (min) MRM Compounds (10/block) Cycle Time (sec) Dynamic MRM Max Coincident Cycle Time (sec) Ciclos 2 x menores permiten manejar picos cromatográficos más estrechos, más analitos y dwell times mayores por compuesto

16 Análisis por segmentos vs. MRM dinámico x Segmento 1 Segmento 2 Segmento 3 Segmento MRM 5 Dinámico: 6 No 7 hay segmentos 8 9 de tiempo Counts vs. Acquisition Time (min) La lista de MRM se confecciona de modo dinámico basándose en el RT de los compuestos de interés Menor tiempo de ciclo/mejor definición de pico

17 MRM dinámico Rt Tiempo de Ciclo Nº de Transiciones Concurrentes = x3 x4 x4 x3 x4 x2 x1 Selección de 24 transiciones de analitos Para ilustrar la eficacia de los Tiempos de Ciclo usando dynamic MRMs.

18 MRM dinámico Tiempo de Ciclo Nº de Transiciones Concurrentes = x3 x4 x4 x3 x4 x2 x1 Selección de 24 transiciones de analitos Para ilustrar la eficacia de los Tiempos de Ciclo usando dynamic MRMs.

19 Abundance >>> MRM dinámico - Simulación Concurrent Compounds Time >>>

20 Condiciones del Método LC-MS/MS QQQ Agilent 6420 QQQ MS Fuente : Electrospray, ionización positiva Condiciones de la fuente Gas Temperature : 350 C Gas Flow : 12 L/min Nebulizer Pressure : 50 psi Capillary : 2000 V EMV : 0 V Dwell time : variable (en Dynamic MRM)

21 Listado de algunas Drogas y Metabolitos y sus condiciones de adquisición (Dynamic MRM) Compound Name ISTD? Prec Ion MS1 Res Prod Ion MS2 Res Frag (V) CE (V) Ret Time Ret Window Polarity Oxymorphone Unit 284 Unit Positive Oxymorphone Unit 227 Unit Positive Morphine Unit Unit Positive Morphine Unit 152 Unit Positive Hydromorphone Unit 185 Unit Positive Hydromorphone Unit 157 Unit Positive Codeine Unit Unit Positive Codeine Unit 58.1 Unit Positive Naloxone Unit 310 Unit Positive Naloxone Unit Unit Positive Oxycodone Unit Unit Positive Oxycodone Unit Unit Positive Naltrexone Unit 324 Unit Positive Naltrexone Unit 55 Unit Positive Hydrocodone Unit 199 Unit Positive Hydrocodone Unit 128 Unit Positive 6-monoacetyl morphine Unit Unit Positive 6-monoacetyl morphine Unit 43.1 Unit Positive d-amphetamine Unit Unit Positive d-amphetamine Unit 91 Unit Positive methamphetamine Unit 119 Unit Positive methamphetamine Unit 91 Unit Positive MDMA Unit 163 Unit Positive MDMA Unit 105 Unit Positive Pain Management

22 Herramientas de control y Software diseñadas para facilitar el desarrollo del método MRM dinámico (DMRM) Optimizer Mejora de la sensibilidad basado en la especificidad de la transición a su tiempo Si no se dispone de Kits de Agilent permite buscar los valores de adquisición óptimos para la cuantificación tmrm Confirmación espectral de los target sin barrido ni perdida de sensibilidad

23 QQQ Analyte Optimizer Máxima Sensibilidad Optimización Automática de 2 Settings clave Fragmentor Voltage Collision Energy

24 Naloxone Optimización de Volatge de Fragmentor Máximo a 130 V 200 V 220 V 40 V 60 V 80 V 100 V 120 V 140 V 160 V 180 V Optimización de la Energía de Colisión Collision Energy = 20 ev Product Ion Spectra Overlaid; (All Collision Energies) 5 ev 10 ev 15 ev 20 ev 25 ev 30 ev 35 ev 40 ev FIA TIC AFL B1 20 ev 15 ev 25 ev 10 ev 5 ev

25 Utilización del Optimizer

26 Resultado de la Optimización y Traslado al Método

27 Fácil Desarrollo y Personalización del Método Base de Datos que contiene más de 200 compuestos. Cada uno con mútiples transiciones MRM para asegurar una rápida creación y desarrollo del método

28 Find By MRM (Cualitativo) 65 Analitos Toxicológicos /37 ISTDs (Ionización Positiva)

29 Que es Triggered MRM? Ciclo Principal Comp 3 dispara las Transiciones Adicionales Threshold Triggered cycle Comp 3 supera el Umbral

30 Revisión de los espectros tmrm Los espectros MRM pueden buscarse utilizando NIST LC/MS/MS o librerías própias

31 Increasing Retention Time List of Analytes and ISTDs (a) (Listed in order of Elution) Opitates/Opiods ISTDs Stimulants ISTDs nor-codeine d-amphetamine Morphine morphine-d6 MDA mda-d5 Oxymorphone methamphetamine Hydromorphone hydromorphone-d6 MDMA mdma-d5 dihydrocodeine MDEA naloxone phentermine phentermine-d5 Codeine codeine-d6 Benzoylecgonine benzoylecgonine-d8 Oxycodone ritalininc acid naltrexone zopiclone zopiclone-d4 Hydrocodone hydrocodone-d6 Cocaine cocaine-d3 6-monoacetyl morphine 6-acetylmorphine-d6 Methylphenidate methylphenidate-d9 m-hydroxybenzoylecgonine Cocaethylene cocaethylene-d8 o-desmethyltramadol meprobamate nor-fentanyl norfentanyl-d5 fenfluramine fenfluramine-d10 tramadol Heroin tapentadol N-desmethyltramadol Meperidine Normeperidine norbuprenorphine Fentanyl Trazodone EDDP Propoxyphene norpropoxyphene Methadone Buprenorphine tramadol-13c-d3 heroin-d9 tapentadol-d3 meperidine-d4 fentanyl-d5 eddp-d3 propoxyphene-d5 methadone-d9 buprenorphine-d4

32 Increasing Retention Time List of Analytes and ISTDs (b) (Listed in order of Elution) Sedatives/Hypnotics ISTDs Abused/Other ISTDs 7-aminoflunitrazepam PCP pcp-d5 zolpidem zolpidem-d6 Verapamil Flurazepam carisoprodol carisoprodol-d7 Clonazepam clonazepam-d4 11-nor-9-carboxy-delta9-thc 11-nor-9-carboxy-delta9-thc-d9 Nitrazepam alpha-hydroxytriazolam Flunitrazepam alpha-hydroxyalprazolam lorazepam oxazepam 2-OH-ethylflurazepam alpha-hydroxyethylflurazepam Triazolam NorFludiazepam desalkylflurazepam alpha-hydroxymidazolam Alprazolam Temazepam Chlordiazepoxide Midazolam Desmethyl diazepam Nordiazepam diazepam nitrazepam-d5 alprazolam-d5 chlordiazepoxide-d5 midazolam-d4 diazepam-d5 *NB Not all ISTDs are shown in these slides

33 Matrices Típicas en el Análisi Toxicológico Matrices Comunes Orine Sangre Sangre directa Plasma Suero Matrices Alternativas Fluido Oral Sudor Pelo Meconio

34 Enfoques en la preparación de muestra (Orine) Diluir e inyectar Otras opciones incorporando: Inorganic acid hydrolysis Glucuronidase hydrolysis La más rápida preparación Puede sufrir de efecto matriz (supresión iónica) en muestras de alta carga. Menor sensibilidad Posibilidad de un alto numero de Falsos Negativos Extracción en Fase Sólida (SPE) Diferentes técnicas y fases dependiendo de la naturaleza ácida/básica del analito Un solo protocolo no es necesariamente bueno para todos los analitos en conjunto. Típicamente mayor tiempo de preparación de muestra Más caro Muestras más Limpias Mayor Sensibilidad

35 Preparación de muestra. SPE (Compuestos Básicos) Paso 1: 1ml orina + 100ul de β-glucuronidasa (requiere 6,200 units/ml de orina; utilizando al menos 10,000 units/ml) 60 C durante 2 horas [β-glucuronidase usada ( 100,000 units/ml)] Paso 2: Sample Plexa DAU (30 mg) 0.2 ml urine Sample Pre-treatment Dilute 0.6 ml 100 mm KH 2 PO 4 SPE-Conditioning 1/ 0.5mL MeOH 2/ 0.5 ml H 2 O SPE-Washes 1/ 0.5mL 50% MeOH in H 2 O 2/ Dry for 5 minutes Elution 0.5 ml 50:50:5 (EtAc:MeOH:NH 3 OH) Las muestras se evaporaron hasta los ~200 μl y se añadieron 100 μl de HCl 0.2% en MeOH. Luego se evaporaron a sequedad y se reconstituyeron en 100 μl de Ácido Fórmico 0.01%

36 Estudio de recuperación. SPE de Sedantes en Orina (n=3) (Concentración 100 ng/ml) Group Compound RT Conc (ng/ml) Ave Conc (ng/ml) SD CV SPE % Recovery pre-spe urine 7-aminoclonazepam post-spe urine 7-aminoclonazepam pre-spe urine 7-aminoflunitrazepam post-spe urine 7-aminoflunitrazepam pre-spe urine zolpidem post-spe urine zolpidem pre-spe urine Flurazepam post-spe urine Flurazepam pre-spe urine Nitrazepam post-spe urine Nitrazepam pre-spe urine Clonazepam post-spe urine Clonazepam pre-spe urine Flunitrazepam post-spe urine Flunitrazepam pre-spe urine alpha-hydroxytriazolam post-spe urine alpha-hydroxytriazolam pre-spe urine alpha-hydroxyalprazolam post-spe urine alpha-hydroxyalprazolam pre-spe urine oxazepam post-spe urine oxazepam pre-spe urine lorazepam post-spe urine lorazepam pre-spe urine 2-OH-ethylflurazepam post-spe urine 2-OH-ethylflurazepam pre-spe urine Triazolam post-spe urine Triazolam pre-spe urine desalkylflurazepam post-spe urine desalkylflurazepam

37 Estudio de recuperación. SPE de Sedantes en Orina (n=3) (Concentración 100 ng/ml) (Continuación) Group Compound RT Conc (ng/ml) Ave Conc (ng/ml) SD CV SPE % Recovery pre-spe urine alpha-hydroxymidazolam post-spe urine alpha-hydroxymidazolam pre-spe urine Alprazolam post-spe urine Alprazolam pre-spe urine Temazepam post-spe urine Temazepam pre-spe urine Chlordiazepoxide post-spe urine Chlordiazepoxide pre-spe urine Midazolam post-spe urine Midazolam pre-spe urine Nordiazepam post-spe urine Nordiazepam pre-spe urine diazepam post-spe urine diazepam Sólo Oxazepam, Lorazepam y nordiazepam > 20% desviación respecto al 100%

38 Estudio de recuperación. SPE de Estimulantes en Orina (n=3) (Concentración 100 ng/ml) Group Compound RT Conc (ng/ml) Ave Conc (ng/ml) SD CV SPE % Recovery pre-spe urine d-amphetamine post-spe urine d-amphetamine pre-spe urine MDA post-spe urine MDA pre-spe urine methamphetamine post-spe urine methamphetamine pre-spe urine MDMA post-spe urine MDMA pre-spe urine m-hydroxybenzoylecgonine post-spe urine m-hydroxybenzoylecgonine pre-spe urine MDEA post-spe urine MDEA pre-spe urine phentermine post-spe urine phentermine pre-spe urine Benzoylecgonine post-spe urine Benzoylecgonine pre-spe urine zopiclone post-spe urine zopiclone pre-spe urine Cocaine post-spe urine Cocaine pre-spe urine Methylphenidate post-spe urine Methylphenidate pre-spe urine Cocaethylene post-spe urine Cocaethylene pre-spe urine meprobamate post-spe urine meprobamate pre-spe urine fenfluramine post-spe urine fenfluramine MDA, m-hydroxyl y benzoylecgonine, fenfluramine & meprobamate > 20% desviación respecto al 100%

39 Estudio de recuperación. SPE de Opiáceos en Orina (n=3) (Concentración 100 ng/ml) Group Compound RT Conc (ng/ml) Ave Conc (ng/ml) SD CV SPE % Recovery pre-spe urine Morphine post-spe urine Morphine pre-spe urine Oxymorphone post-spe urine Oxymorphone pre-spe urine Hydromorphone post-spe urine Hydromorphone pre-spe urine dihydrocodeine post-spe urine dihydrocodeine pre-spe urine naloxone post-spe urine naloxone pre-spe urine Oxycodone post-spe urine Oxycodone pre-spe urine naltrexone post-spe urine naltrexone pre-spe urine Codeine post-spe urine Codeine pre-spe urine Hydrocodone post-spe urine Hydrocodone pre-spe urine 6-monoacetyl morphine post-spe urine 6-monoacetyl morphine pre-spe urine o-desmethyltramadol post-spe urine o-desmethyltramadol pre-spe urine nor-fentanyl post-spe urine nor-fentanyl pre-spe urine Heroin post-spe urine Heroin pre-spe urine tapentadol post-spe urine tapentadol pre-spe urine N-desmethyltramadol post-spe urine N-desmethyltramadol

40 Estudio de recuperación. SPE de Opiáceos en Orina (n=3) (Concentración 100 ng/ml) (Continuación) Group Compound RT Conc (ng/ml) Ave Conc (ng/ml) SD CV SPE % Recovery pre-spe urine Meperidine post-spe urine Meperidine pre-spe urine Normeperidine post-spe urine Normeperidine pre-spe urine norbuprenorphine post-spe urine norbuprenorphine pre-spe urine Trazodone post-spe urine Trazodone pre-spe urine Fentanyl post-spe urine Fentanyl pre-spe urine EDDP post-spe urine EDDP pre-spe urine Propoxyphene post-spe urine Propoxyphene pre-spe urine norpropoxyphene post-spe urine norpropoxyphene pre-spe urine Methadone post-spe urine Methadone pre-spe urine Buprenorphine post-spe urine Buprenorphine Norpropoxyphene > 50% desviación respecto al 100%

41 Estudio de recuperación. SPE de Otros en Orina (n=3) (Concentración 100 ng/ml) Group Compound RT Conc Ave Conc Analyte SPE % (ng/ml) (ng/ml) Area Average SD CV Recovery pre-spe urine ritalininc acid post-spe urine ritalininc acid pre-spe urine PCP post-spe urine PCP pre-spe urine Verapamil post-spe urine Verapamil pre-spe urine carisoprodol post-spe urine carisoprodol Ritalinic acid, PCP & carisoprodol > 20% desviación respecto al 100%

42 Preparación de Muestra Diluir e Inyectar Paso 1: 1ml orina + 100ul de β-glucuronidasa (requiere 6,200 units/ml de orina; utilizando al menos 10,000 units/ml) 60 C durante 2 horas [β-glucuronidase usada ( 100,000 units/ml)] ó 1ml orine + 100ul de HCl 5M, 60 C durante 1 hora Paso 2: Sample Dilution in Water 1/10 Sample Pre-treatment Conditioning 3K 12,000 RPM Centrifuge spin filter Decant Supernatant into sampling well or vial.

43 Opiáceos Sedantes Resultados de Sensibilidad 6420 QQQ Diluir/Inyectar (dil. 1/10) versus SPE Compuesto D/Shoot LLOQ (ng/ml) SPE LLOQ (ng/ml) ULOQ (ng/ml) 6-monoacetyl morphine 10 < buprenorphine codeine 25 < dihydrododeine 25 < EDDP 10 < fentanyl 1 < heroin 10 < hydrocodone 10 < hydromorphone 5 < meperidine 5 < methadone 10 < morphine 5 < naloxone 5 < naltrexone 10 < N-desmethyltramadol norbuprenorphine norfentanyl 1 < normeperidine 5 < norpropoxyphene 5 < o-desmethyltramadol 5 < oxycodone 10 < oxymorphone 5 < propoxyphene 5 < tapentadol 5 < tramadol 1 < trazodone 1 < Compuesto D/Shoot LLOQ (ng/ml) SPE LLOQ (ng/ml) ULOQ (ng/ml) 2-OH-ethylflurazepam aminoclonazepam 10 < aminoflunitrazepam 5 < alpha-oh-midazolam 10 < alprazolam 10 < a-oh-alprazolam 20 < a-oh-triazolam 50 < chlordiazepoxide 10 < clonazepam 25 to 50 < desalkylflurazepam diazepam 10 < flunitrazepam flurazepam lorazepam midazolam 10 < nitrazepam nordiazepam 25 < oxazepam temazepam 25 < triazolam 5 < zolpidem 5 <1 1000

44 Resultados de Sensibilidad 6420 QQQ Diluir/Inyectar (dil. 1/10) versus SPE (continuación) Estimulantes Otros D/Shoot LLOQ (ng/ml) SPE LLOQ (ng/ml) Compound ULOQ amphetamine 5 < benzoylecgonine 5 < cocaethylene 5 < cocaine 5 < fenfluramine 1 < MDA 5 < MDEA 1 < MDMA 5 < meprobamate methamphetamine 1 < methylphenidate 5 < m-hydroxybenzoylecgonine 10 < phentermine 1 < zopiclone 5 < D/Shoot LLOQ (ng/ml) SPE LLOQ (ng/ml) Compound ULOQ 11-nor-9-carboxy-THC carisoprodol PCP 1 < ritalinic acid verapamil 2 <1 1000

45 Rendimiento de la Poroshell 120 después de 3000 inyecciones (Dil e Iny) Analito %RSD (RT) Analito %RSD (RT) Analito %RSD (RT) Morphine 0.7 Meperidine 0.4 Triazolam 0 Codeine 0.4 zolpidem 0.3 Naltrexone 0.1 hydrocodone 0.4 Fentanyl 0.1 chlordiazepoxide 0.1 MDMA 0.3 EDDP 0.1 Desmethyl diazepam norfentanyl 0.2 Nitrazepam 0.1 Buprenorphine 0.3 Heroin 0.2 Propoxephine 0.1 Cocaethylene 0.2 Methyl Phenidate 0.2 Buprenorphine nor-9-carboxydelta9-thc Muestra de algunos de los analitos en el análisis de 6 min.

46 Estado de la fuente Ortogonal ESI después de 3000 inyecciones (Dil e Iny) (3.5 semanas consecutivas) Nebulizador Spray Shield/Entrada MS/Capilar

47 Compounds at a Glance Panel de revisión mostrando 8ng/ml de cada analito en Orina.

48 Ejemplos de Calibración en Orina 0.5ng/ml 1000ng/ml Carisoprodol EDDP R 2 = R 2 = Propoxyphene Fenfluramine R 2 = R 2 =

49 Análisis Exhaustivo o Personalizado? Exhaustivo Opiáceos Estimulantes Otros Sedantes

50 Rendimiento La última tecnología en LC Triple Quads Agilent ha desarrollado un nuevo LC Triple Quad cada año desde Triple Triple Quad Quad 6490 Triple Quad Tecnología ifunnel Triple Quad Triple Quad 6430 Cuantificación Rutinaria Análisis de Ultratrazas y alta 6460 velocidad Análisis de trazas en rutina Easy Choice Rango medio

51 N U E V O 6490 L C / M S T R I P L E C U A D R U P O L O Sensibilidad a niveles de Zeptomol! Prestaciones máximas en un tamaño más reducido ifunnel Technology Un nuevo paradigma en el muestreo de iones a presión atmosférica 10X sensitivity en ESI Mejora de la robustez de los ensayos y simplifica la preparación de muestra Celda de colisión curvada Transmisión muy eficiente; ruido minimizado Diseño compacto Nuevas posibilidades en scan Aislamiento del ion precursor a 0.4 m/z precursor, que reduce interferencias Dynamic MRM (DMRM) Triggered MRM (tmrm)

52 Qué es un Zeptomol? Page 55 FACTOR POR EL QUE HAY QUE MULTIPLICAR LA UNIDAD Zepto MULTIPLO??? PREFIJO ABREVIATU RA 0,1 mol 10-1 mol decimol dm 0,01 mol 10-2 mol centimol cm 0,0001 mol 10-3 mol milimol mm 0, mol 10-6 mol micromol μm 0, mol 10-9 mol nanomol nm 0, mol mol picomol pm 0, mol mol femtomol fm 0, mol mol atomol am 0, mol mol zeptomol zm 0, mol mol yoctomol ym 602 moleculas < 1molécula

53 C U A N T I F I C A C I Ó N - S E N S I B I L I D A D sólamente somos capaces de detectar 1 de cada 10 3 a 10 5 iones generados por electrospray (ESI) a presión atmosférica con los diseños instrumentales actuales. (Page, Smith, et al; JASMS, 2007, 18, )

54 ifunnel Technology Captura x10 veces más Iones Agilent Jet Stream Confinamiento térmico de la pluma de ESI. Muy eficiente desolvatación para crear iones en fase gaseosa. Crea una zona rica en iones. Hexabore Capillary Capilar con 6 entradas. Muestrea x10 más gas rico en iones de la fuente. Captura la mayor parte del gas de la región de la fuente. Dual Ion Funnel Elimina el gas, pero captura los iones Elimina el ruido de neutros Prolonga la vida útil de la bomba turbo 4-26m Página 57

55 Ion Funnel de 2 Etapas Desalineadas 1ª Etapa: 8-12 Torr 2ª Etapa: 1-3 Torr Elimina una elevada carga de gas Reduce neutros Mejora la robustez Transmite iones muy eficientemente hacia óptica de Q1 2 etapas desalineadas -----: favorece la transmisión de sólo iones Página 58

56 Innovaciones Instrumentales Triple Cuadrupolos LC/MS: 6460 vs 6490 AJS 6460 LC/MS (Skimmer Configuration) Skimmer AJS Cap Guía de Q1 Celda Q3 Iones Colisión por RF con Aceleración Lineal Axial 6490 LC/MS (ifunnel Configuration) HB Cap Dual Ion Guía de Q1 Funnel Iones por RF Ion Detector Ion Detector Q3 Curved Collision cell con Aceleración Lineal Axial Página 59

57 Innovaciones Instrumentales Triple Cuadrupolos LC/MS: 6460 vs 6490 AJS 6460 LC/MS (Skimmer Configuration) Skimmer AJS Cap Guía de Q1 Celda Q3 Iones Colisión por RF con Aceleración Lineal Axial 6490 LC/MS (ifunnel Configuration) HB Cap Dual Ion Guía de Q1 Funnel Iones por RF Ion Detector Ion Detector Q3 Curved Collision cell con Aceleración Lineal Axial Página 60

58 Nueva celda de colisión Curvada, Cerrada y Convergente con Aceleración Lineal Axial Efficient Ion Transmission over wide mass range. Reduces transmission of ionized generated noise RF & DC Voltages Set Confinement and Axial Acceleration: SIN efecto Cross Talk Menor Apertura (3.5mm) de Salida Focaliza mejor los Ionss dentro de MS2 Mayor Apertura (5 mm) de Entrada Accepta más Iones Página 61

59 Frecuencia Electrónica Cuadrupolo 6490: 1.4 MHz Una frecuencia más alta produce más ciclos de movimiento de iones en el cuadrupolo Más ciclos de movimiento de iones dan una mayor resolución de masas el 6490 se puede sintonizar automáticamente desde 0,4 m / z Una frecuencia más alta unidad reduce rango de masas hasta 1400 m / z Página 62

60 Análisis Cuantitativo de THC, 6-MAM, Morfina, Fenobarbital, nor- y buprenorfina Agilent 6490 QQQ LC/MS acoplado a un 1290 Infinity UHPLC

61 Objetivo Demostrar el alto rendimiento del QQQ Agilent 6490 para el análisis de varios compuestos de interesante desafío por su baja respuesta. (THC, 6-MAM, Morfina, Fenobarbital, Nor- y Buprenorfina) Específicamente en lo referido a : Sensibilidad MRM Especificidad Reproducibilidad

62 Analitos THC C 21 H 30 O buprenorfina C 29 H 41 NO norbuprenorfina C 25 H 35 NO morfina C 17 H 19 NO acetyl morfina C 19 H 21 NO

63 Información y preparación de muestra Se dispone de patrones nuevos para cada uno de los siguientes analitos así como de sus respectivos patrones internos de marcaje isotópico : delta-9-tetrahidrocanabinol morfina 6-acetilmorfina buprenorfina norbuprenorfina Reconstitución : ISTDs preparados a una concentración fija de 50ng/ml Todos los patrones se diluyeron en saliva sintética e inyectados directamente en columna.

64 Método: 1290 Infinity UHPLC (THC, 6-MAM, Morfina, Fenobarbital, Nor- y Buprenorfina) UHPLC Agilent 1290 Infinity Bomba Binaria, Automuestreador de pocillos, compartimento de columna termostatizado, 1200 binary pump Columna: Zorbax poroshell SB C18, 2.1x100 mm, 2.7 um Temp. Columna: 55 ºC Volumen Inyección : 10 L Temp. Automuestr. : 5 ºC Limpieza de aguja : flushport (MeOH:H2O 75:25), 5 seconds Fae Mobil: A = Formiato Amónico 5mM, 0.1% Ácido Fórmico en Agua B = Metanol Flujo: 0.5 ml/min Gradiente: Tiempo (min) %B Stop time: 6.0 min Post time: 2.0 min

65 MS: Agilent 6490 triple cuadrupolo LC/MS/MS Métod0: 6490 MS QQQ MS Conditions Fuente Jet Stream, positive Source conditions: Gas temperature 250 ºC Drying gas (nitrogen) 14 L/min Nebulizer gas (nitrogen) 45 psi Sheath gas temperature 380 ºC Sheath gas flow (nitrogen) 11 L/min Capillary voltage 3000 V Nozzle voltage 0 V Fragmentor 380 V MRM acquisition: Delta EMV 000V Cpd Name ISTD? Prec Ion MS1 Res Prod Ion MS2 Res Dwell buprenorphine d4 No Widest / Wide 88 Wide / Unit (6490) 25 Buprenorphine No Widest / Wide Wide / Unit (6490) 25 nor-buprenorphine No Widest / Wide Wide / Unit (6490) 25 norbuprenorphine No Widest / Wide Wide / Unit (6490) 25 6-acetyl morphine No Widest / Wide Wide / Unit (6490) 25 6-monoacetyl No Widest / Wide Wide / Unit (6490) 25 delta9-thc d3 No Widest / Wide Wide / Unit (6490) 25 delta9-thc No Widest / Wide Wide / Unit (6490) 25 morphine d3 No Widest / Wide 201 Wide / Unit (6490) 25 Morphine No Widest / Wide Wide / Unit (6490) 25 Frag (V) CE (V) Cell Acc (V) Polarity Positive Positive Positive Positive Positive Positive Positive Positive Positive Positive

66 Cromatografía (5ng/ml en saliva) morphine 6-MAM buprenorphine norbuprenorphine THC

67 LOQ Morfina 50pg/ml (50 ppt)

68 Morfina. Recta de calibrado : ng/ml (n=3) R 2 >0.996

69 LOQ 6-acetilmorfina 50pg/ml (50ppt)

70 6-acetilmorfina. Recta de calibrado : ng/ml (n=3) R 2 >0.998

71 LOQ Norbuprenorfina 500pg/ml (500ppt)

72 For Research Use Norbuprenorfina. Recta de calibrado : ng/ml (n=3) R 2 >0.989

73 LOQ Buprenorfina 500pg/ml (500ppt)

74 Buprenorfina. Recta de calibrado : ng/ml (n=3) R 2 >0.992

75 LOQ Delta9-THC 500pg/ml (500 ppt)

76 Resumen de los LOQ con 6490 QQQ (Inyección directa de saliva sintética) Analito LOQ (S/N>10) Linearidad %RSD Promedio Morfina 50pg/ml R 2 > MAM 50pg/ml R 2 > norbuprenorfina 500pg/ml R 2 > buprenorfina 500pg/ml R 2 > Delta9-THC 500pg/ml R 2 >

77 Resumen y conclusiones El poder del método exhaustivo está basado en una buena separación cromatográfica. El rango lineal típico de los analitos viene a ser de 1 a 1000 ng/ml (0.01 a 1000 para 6490) La funcionalidad Dynamic MRM, la Optimización Automática, y la base de datos de transiciones MRM ayudan a un desarrollo del método más directo y rápido. Se han comparado las técnicas de preparación de muestra SPE y Diluir e inyectar La sensibilidad del método por técnicas de SPE es claramente superior a técnicas de Diluir e inyectar, PERO son más caras y toman más tiempo.

78 Agradecimientos Kevin McCann & Peter Stone LC/MS Application Champions Agilent Technologies Inc, Santa Clara, California.

79 C L E A R LY B E T T E R M S S O L U T I O N S Preguntas? Mass Spectrometry Technology Products Solutions NUEVO NUEVO Jaume C. Morales Especialista de Producto MS Agilent Technologies Spain jaume_morales@agilent.com