Prueba BD GeneOhm Cdiff

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1 Prueba BD GeneOhm Cdiff REF REF pruebas 200 pruebas P0047(02)_ES Fecha:

2 ÍNDICE USO PREVISTO... 3 RESUMEN Y EXPLICACIÓN DE LA PRUEBA... 3 PRINCIPIOS DEL PROCEDIMIENTO... 3 REACTIVOS... 4 PRECAUCIONES... 5 MATERIALES SUMISTRADOS... 5 CONSERVACIÓN, MANEJO Y ESTABILIDAD... 6 MUESTRAS RECOGIDAS... 6 REACTIVOS... 6 MATERIALES NECESARIOS PERO NO SUMISTRADOS... 6 INSTRUCCIONES DE USO... 7 OBTENCIÓN DE LAS MUESTRAS... 7 PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS... 7 PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA BD GENEOHM CDIFF... 8 CONTROL DE CALIDAD... 9 CONTROLES POSITIVOS Y NEGATIVOS... 9 CONTROLES DE PROCESAMIENTO DE MUESTRAS... 9 CULTIVO DE MUESTRAS CLÍCAS... 9 INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS... 9 SERIE ANALÍTICA INVÁLIDA MUESTRA NO RESUELTA MUESTRA NO DETERMINADA POR FALLO DEL MÓDULO I-CORE LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO SUSTANCIAS INTERFERENTES CARACTERÍSTICAS DE RENDIMIENTO ESPECIFICIDAD ANALÍTICA SENSIBILIDAD ANALÍTICA REPRODUCIBILIDAD PRECISIÓN REFERENCIAS ÍNDICE DE SÍMBOLOS P0047(02)_ES -2-

3 Español Uso previsto La prueba BD GeneOhm Cdiff es una prueba diagnóstica rápida in vitro para la detección cualitativa directa del gen de la toxina B del C. difficile (tcdb), en muestras de heces humanas líquidas o blandas de pacientes con sospecha de enfermedad asociada al Clostridium difficile (EACD). La prueba, basada en PCR en tiempo real, está indicada para facilitar el diagnóstico de la EACD. La prueba se realiza directamente sobre la muestra, utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la amplificación de dianas específicas y de sondas fluorogénicas de hibridación con diana específica para la detección en tiempo real del ADN amplificado. Resumen y explicación de la prueba Se recoge una muestra de heces líquidas o blandas y se transporta al laboratorio. Se sumerge una torunda seca estéril en la materia fecal líquida o blanda y se procesa. Para la prueba, la torunda se eluye en tampón de muestras y se lisa la muestra. Se añade una alícuota del lisado a los reactivos de PCR que contienen los cebadores específicos de tcdb utilizados para amplificar la diana genética del Clostridium difficile, si estuviera presente. La prueba también contiene un control interno (CI) para detectar la presencia de inhibidores de la PCR y para confirmar la integridad de los reactivos analíticos. Las dianas amplificadas se detectan mediante sondas de hibridación marcadas con fluoróforos extinguidos del tipo baliza molecular (molecular beacon). El software del instrumento Cepheid SmartCycler lleva a cabo automáticamente la amplificación, detección e interpretación de las señales. Todo el proceso se realiza entre 75 y 90 minutos, en función del número de muestras procesadas. El C. difficile es el agente etiológico de varias enfermedades. Ciertos estudios epidemiológicos demuestran que se ha registrado un número creciente de brotes asociados con el C. difficile a nivel mundial 1, algunos de ellos con creciente mortalidad y morbilidad 2. Los síntomas de la enfermedad varían desde una diarrea molesta hasta una colitis grave, e incluso una perforación intestinal y la muerte por deshidratación. Este patógeno es la principal causa de la diarrea relacionada con antibióticos (DRA) y de la colitis seudomembranosa 3. Los factores de riesgo predisponentes son numerosos, y comprenden la edad, la duración y el número de hospitalizaciones, las intervenciones invasivas, los tratamientos inmunosupresores y las patologías crónicas (diabetes, síndromes cardiovasculares o SIDA) 4. Estos factores explican las causas de que algunos servicios (cuidados intensivos, cirugía, asistencia a largo plazo) en hospitales o instituciones se vean más afectados que otros. La bacteria C. difficile, así como las demás bacterias de la flora intestinal, mueren con un tratamiento antimicrobiano, pero no así las esporas de C. difficile, que son insensibles a la mayoría de los agentes antimicrobianos. Cuando la concentración de antimicrobianos es inferior a la concentración mínima inhibidora, las esporas germinan para formar bacterias viables, que producen toxinas 5. El diagnóstico del C. difficile toxinógeno suele realizarse por análisis de citotoxicidad en cultivo celular o por identificación de cultivos de C. difficile, o bien por inmunoanálisis enzimático (EIA). El análisis de citotoxicidad en cultivo celular y la identificación de cultivos de C. difficile son laboriosos y dilatorios, y los resultados se obtienen al cabo de 24 a 96 horas. Los análisis de toxinas por EIA tienen baja sensibilidad y los enzimoinmunoensayos de antígenos de glutamato deshidrogenasa (GDH EIA) tienen baja especificidad. La puesta a punto de técnicas sensibles y específicas de amplificación molecular permite ahora la detección de muy pocas copias de ADN bacteriano en las muestras clínicas, y la discriminación de especies concretas 6. Además, la tecnología de PCR rápida puede lograrlo en el plazo aproximado de 1 hora. La combinación de estas características puede permitir el rápido tratamiento dirigido de los pacientes con EACD y, por tanto, una posible mejora de los resultados de los pacientes y una reducción del tiempo de recuperación. Principios del procedimiento Tras la lisis de la muestra, se produce la amplificación de la diana tcdb, si estuviera presente. Se producirá también la amplificación del control interno (CI), un fragmento de ADN de 333 pares de bases (pb) que comprende una secuencia de 277 pb que no se encuentra en el C. difficile, a menos que existan sustancias inhibidoras de la PCR. La diana de ADN amplificada es detectada con una baliza molecular, un oligonucleótido monocatenario en forma de horquilla marcado en un extremo con un extintor de fluorescencia y en el otro con un colorante fluorescente indicador (fluoróforo). En ausencia de la diana, la fluorescencia queda extinguida. En presencia de la diana, la estructura en forma de horquilla se abre tras la hibridación de la baliza con la diana, ocasionando la emisión de fluorescencia. Para la detección de los amplicones tcdb, la sonda molecular contiene el fluoróforo FAM en el extremo 5 y el extintor no fluorescente DABCYL en el extremo opuesto 3 del oligonucleótido. Para la detección de los amplicones del CI, la baliza molecular contiene el fluoróforo TET en el extremo 5 y la porción extintora DABCYL en el extremo 3. Cada híbrido baliza-diana emite fluorescencia a una longitud de onda característica del fluoróforo utilizado en esa baliza molecular concreta. La cantidad de fluorescencia en un ciclo determinado, o en subsiguientes ciclos, depende de la cantidad de amplicones específicos presentes en ese momento. El software SmartCycler controla simultáneamente la fluorescencia emitida por cada baliza molecular, interpreta todos los datos y ofrece un resultado final cuando termina el programa de ciclos (véase la sección Interpretación de los resultados ). P0047(02)_ES -3-

4 Reactivos Prueba BD GeneOhm Cdiff 48 pruebas 200 pruebas Tampón de muestras (Sample Buffer) 60 X 1 ml 240 X 1 ml Tampón Tris-EDTA Tubo de lisis (Lysis tube) 50 tubos 200 tubos Microesferas de vidrio Mezcla maestra (Master Mix) 8 tubos 34 tubos < 0,0005% de complejo de ADN polimerasa < 0,001% de control interno (ADN no infeccioso que contiene secuencias de unión de los cebadores de tcdb con una secuencia única para la hibridación de la sonda) < 0,002% de cebadores < 0,002% de sondas moleculares < 0,05% de mezcla de nucleótidos (datp, dctp, dgtp, dttp) Albúmina de suero bovino Carbohidrato MgCl 2 < 0,001% de ADN genómico no infeccioso de Escherichia coli (ATCC 25922) ADN de control (Control DNA) 8 tubos 34 tubos Tampón Tris-EDTA Carbohidrato < 0,001% de ADN genómico no infeccioso de C. difficile portador del gen tcdb (ATCC 43255) Diluyente (Diluent) 8 X 700 µl 34 X 700 µl Tampón Tris-HCl MgCl 2 (NH 4) 2SO 4 KCl P0047(02)_ES -4-

5 Precauciones Esta prueba es solamente para uso diagnóstico in vitro. No utilizar el kit si el precinto de seguridad de la caja exterior está roto. No utilizar los reactivos si las bolsas protectoras están abiertas o desgarradas a su llegada. Cerrar rápidamente las bolsas protectoras de la mezcla maestra y del ADN de control con el cierre rápido después de cada uso. No retirar el desecante de las bolsas de mezcla maestra y de ADN de control. No utilizar los reactivos si no hay desecante dentro de las bolsas de mezcla maestra y de ADN de control. Los reactivos no son intercambiables entre lotes. Nunca se deben reunir reactivos de diferentes tubos, aunque sean del mismo lote. No utilizar los reactivos después de su fecha de caducidad. No intercambiar las tapas entre los reactivos, ya que se puede producir contaminación, comprometiendo los resultados de la prueba. Evitar la contaminación de los reactivos con microorganismos y con desoxirribonucleasa (ADNasa) cuando se extraigan alícuotas de los tubos. Se recomienda el uso de puntas para pipetas estériles y desechables, libres de ADNasa y bloqueadas con filtro, o puntas para pipetas de desplazamiento positivo. Para evitar la contaminación ambiental con amplicones del gen tcdb, no abrir los tubos de reacción después de la amplificación. Utilizar una punta de pipeta nueva para cada muestra o reactivo. La realización de la prueba fuera de los márgenes de tiempo recomendados puede producir resultados inválidos. Las pruebas no terminadas dentro de los márgenes especificados deben repetirse. Se pueden analizar controles adicionales de acuerdo con las directrices o requisitos de la normativa local, estatal o federal, o de las organizaciones de acreditación. En los casos en que el laboratorio lleve a cabo pruebas de PCR en tubo abierto en la misma zona general, hay que utilizar zonas de trabajo separadas y segregadas para la preparación de muestras y para las actividades de amplificación/detección. Los suministros y el equipo deben ser específicos para cada zona y no deben trasladarse de una zona a otra. Hay que llevar siempre guantes y cambiarlos antes de pasar de una zona a otra. Hay que cambiar de guantes antes de manipular reactivos liofilizados. Manejar siempre las muestras como si fueran infecciosas y de conformidad con procedimientos de laboratorio seguros tales como los descritos en Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 7 y en el Documento M29 del CLSI 8. Llevar indumentaria protectora y guantes desechables cuando se manejen reactivos del kit. Lavar bien las manos después de realizar la prueba. No pipetear con la boca. No fumar, beber ni comer en áreas donde se manipulen muestras o reactivos del kit. Desechar los reactivos no utilizados y los desechos de conformidad con la normativa local, estatal o federal. Los usuarios deben completar pruebas y formación de competencia antes de llevar a cabo la prueba BD GeneOhm Cdiff de conformidad con la normativa local, estatal o federal o con las organizaciones de acreditación. Materiales suministrados Tampón de muestras (Sample Buffer) Tubo de lisis (Lysis tube) Mezcla maestra (Master Mix) ADN de control (Control DNA) Diluyente (Diluent) Tubos SmartCycler, capacidad de 25 µl Etiquetas de identificación de muestras P0047(02)_ES -5-

6 Conservación, manejo y estabilidad Muestras recogidas Las muestras deben mantenerse entre 2 y 25 C durante el transporte. Proteger las muestras frente a la congelación o la exposición a un calor excesivo. Las muestras pueden conservarse hasta 5 días a 2 8 C antes de su análisis. Las muestras pueden conservarse a temperatura Reactivos Nota: Bolsa cerrada ambiente (15 25 C) hasta 48 horas antes de su análisis. Las muestras pueden analizarse después de un ciclo de congelación y descongelación. Las condiciones de conservación deben seguir las especificaciones escritas en cada bolsa. Master MIx, Diluent y Control DNA Lysis tube Componente del kit (etiquetas con banda blanca, (tapón amarillo) negra y roja, respectivamente) Sample Buffer (tapón azul) Temperatura 2 8 C 2 25 C 2 25 C Estabilidad Fecha de caducidad Fecha de caducidad Fecha de caducidad A Temperatura 2 8 C 2 25 C 2 25 C B Estabilidad 1 mes C Fecha de caducidad 2 meses C A Una vez abierto el cierre original de la bolsa, cerrar cuidadosamente la bolsa con el cierre rápido después de cada uso y conservar a temperatura adecuada. B Aunque estos reactivos se pueden conservar a temperatura ambiente, deben mantenerse con sus reactivos acompañantes del mismo lote a 2 8 C. C Siempre que las bolsas se cierren debidamente con el cierre rápido después de cada uso. Componentes del kit fuera de su bolsa protectora Master Mix y Control DNA (etiquetas con banda blanca y roja) Tubos que contienen reactivos no reconstituidos Tubos que contienen reactivos reconstituidos A Recipiente original Temperatura C Estabilidad 2 horas Temperatura 2 8 C Estabilidad 3 horas Tubo de Temperatura 2 8 C SmartCycler Estabilidad 1 hora A Desechar los tubos no utilizados una vez transcurrido el tiempo de estabilidad indicado. Materiales necesarios pero no suministrados Torunda estéril seca Recipiente estéril seco para la recogida de muestras fecales líquidas o blandas Vórtex Genie 2 (Scientific Industries Inc.) con soporte para microtubos de 1,5 ml o equivalente; para procesar múltiples muestras se puede usar un adaptador con múltiples soportes Micropipetas (intervalo de precisión entre 1 10 µl, µl y µl) Puntas de micropipeta estériles libres de ADNasa y bloqueadas con filtro, o de desplazamiento positivo Tubos de microcentrífuga libres de ADNasa Tijeras (opcionales) Gasa Guantes desechables, sin talco Microcentrífuga para centrifugación a baja velocidad Bloque térmico seco para tubos de 1,5 ml o baño María Hielo o bloque refrigerador para tubos de 1,5 ml. Cronómetro o temporizador P0047(02)_ES -6-

7 Sistema de iniciación SmartCycler con software Dx (bloque de procesamiento, manual del usuario 9, kit de accesorios y ordenador de sobremesa) (Cepheid, Sunnyvale, CA, EE.UU.) Instrucciones de uso Obtención de las muestras Para obtener una muestra adecuada, debe seguirse estrictamente el procedimiento para la recogida de muestras. Muestra fecales líquidas o blandas Utilizando un recipiente estéril seco, se recogen muestras fecales líquidas o blandas conforme al siguiente procedimiento: 1. Transferir heces líquidas o blandas (pero no orina) al recipiente. Evitar la mezcla de papel higiénico, agua o jabón con la muestra. 2. Rotular el recipiente. 3. Enviar el recipiente al laboratorio siguiendo los procedimientos operativos habituales del laboratorio. 4. Véanse instrucciones de conservación y manejo en la sección titulada Conservación, manejo y estabilidad: Muestras recogidas. Preparación de las muestras NOTA: Se necesita un (1) tubo de tampón de muestras (tapón azul) y un (1) tubo de lisis (tapón amarillo) para cada muestra a analizar. Se necesita también un tubo adicional de tampón de muestras (tapón azul) para diluir las muestras. Este tubo de tampón de muestras se utilizará también para el procedimiento de la prueba BD GeneOhm Cdiff. Retirar el número necesario de tubos de sus bolsas protectoras, extraer el exceso de aire y cerrar inmediatamente las bolsas con el cierre rápido. 1. Antes de iniciar la preparación de las muestras para la prueba BD GeneOhm Cdiff, agitar la muestra en vórtex a alta velocidad durante 15 segundos y sumergir una torunda seca estéril en la materia fecal para analizar. Retirar el exceso de heces. 2. Colocar la torunda en un tubo de tampón de muestras (tapón azul). Identificar el tubo de tampón de muestras en el tapón o en la etiqueta del tubo. 3. Romper el vástago de la torunda y cerrar bien el tubo de tampón de muestras. Sostener la torunda por el vástago cerca del borde del tubo (utilizar una gasa para reducir al mínimo el riesgo de contaminación). Levantar la torunda unos milímetros del fondo y doblar el vástago contra el borde del tubo para romperlo. Método alternativo: usar unas tijeras limpias para cortar el vástago. Comprobar que el tapón cierre bien. 4. Agitar el tubo de tampón de muestras (que contiene la torunda) en vórtex a alta velocidad durante un (1) minuto. Para procesar múltiples muestras se pueden utilizar adaptadores con múltiples soportes. 5. Añadir 40 µl del tubo adicional de tampón de muestras (tapón azul) al tubo de lisis (tapón amarillo) con el fin de diluir la muestra. 6. Transferir 10 µl de suspensión celular (del paso 4) al tubo de lisis (tapón amarillo) que ya contiene 40 µl de tampón de muestras (tapón azul) (del paso 5). 7. Agitar el tubo de lisis durante cinco (5) minutos a alta velocidad. Para procesar múltiples muestras se pueden utilizar adaptadores con múltiples soportes. 8. Centrifugar brevemente el tubo de lisis (pulso rápido). Centrigugar a baja velocidad durante dos (2) a cinco (5) segundos para llevar el contenido sólido al fondo del tubo. 9. Calentar el tubo de lisis a 95 ± 2 C entre cinco (5) y siete (7) minutos. Utilizar un bloque térmico seco para tubos de 1,5 ml o un baño María. 10. Colocar el tubo de lisis sobre hielo o sobre un bloque refrigerador. Los lisados son estables hasta cuatro (4) horas a 2 8 C. P0047(02)_ES -7-

8 Procedimiento de la prueba BD GeneOhm Cdiff NOTA: Un (1) tubo de mezcla maestra reconstituida (etiqueta blanca) contiene suficientes reactivos para efectuar ocho (8) reacciones. Utilizar un tubo de reacción SmartCycler para cada muestra a analizar y dos (2) tubos de reacción SmartCycler adicionales para los controles positivo y negativo. Hay que incluir un (1) control positivo y uno (1) negativo en cada serie de la prueba BD GeneOhm Cdiff. Hace falta un (1) ADN de control (etiqueta con banda roja) para cada serie analítica. Se necesita un (1) tubo de diluyente (etiqueta con banda negra) para la reconstitución de hasta tres (3) tubos de mezcla maestra. Retirar el número necesario de tubos de sus bolsas protectoras, extraer el exceso de aire y cerrar inmediatamente las bolsas con el cierre rápido. Preparar sólo un número de tubos SmartCycler suficiente para llenar los módulos I-CORE disponibles en el instrumento SmartCycler. 1. Colocar el número necesario de tubos de mezcla maestra sobre hielo o sobre un bloque refrigerador para tubos de 1,5 ml. 2. Añadir 225 µl de diluyente (etiqueta con banda negra) a cada tubo de mezcla maestra. Insertar la punta de la micropipeta a través de la membrana del tapón del tubo de mezcla maestra. No insertar la punta a demasiada profundidad en el tapón. Administrar el diluyente. Desechar después el diluyente no utilizado. 3. Agitar el (los) tubo(s) en vórtex durante 5 10 segundos. 4. Colocar el tubo sobre hielo o sobre un bloque refrigerador para tubos de 1,5 ml hasta el momento de usarlo. Colocar un tubo de ADN de control (etiqueta con banda roja) sobre hielo o sobre un bloque refrigerador para tubos de 1,5 ml. 5. Añadir 225 µl de tampón de muestras (tapón azul) al tubo de ADN de control. Utilizar el tubo adicional de tampón de muestras (tapón azul) de la preparación de muestras (paso 5). Insertar la punta de la micropipeta a través de la membrana del tapón del tubo de ADN de control. No insertar la punta a demasiada profundidad en el tapón. Administrar el tampón de muestras. 6. Agitar el tubo en vórtex durante 5 10 segundos. Colocar el tubo sobre hielo o sobre un bloque refrigerador para tubos de 1,5 ml hasta el momento de usarlo. 7. Colocar el número necesario de tubos de SmartCycler sobre el bloque refrigerador SmartCycler. Calcular un (1) tubo de SmartCycler por muestra y dos (2) tubos de SmartCycler más para los controles. Evitar tocar las ventanas de detección óptica que hay en los bordes inferiores del tubo y la zona inferior en forma de rombo. LOS SIGUIENTES PASOS DEBEN REALIZARSE EN EL PLAZO DE UNA (1) HORA: 8. Añadir 25 µl de mezcla maestra reconstituida a los tubos del SmartCycler (hay que utilizar la técnica de pipeteado adecuada para garantizar la correcta transferencia de la solución). Retirar el tapón antes de pipetear el reactivo. Administrar el líquido en el depósito (parte superior) de los tubos de SmartCycler. Identificar los tubos de SmartCycler en el tapón. Se pueden utilizar etiquetas de identificación de muestras (suministradas con el kit). Desechar la mezcla maestra no utilizada. 9. Añadir 3,0 µl de cada muestra lisada a un tubo de SmartCycler diferente (previamente llenado de mezcla maestra reconstituida); cerrar los tubos. Tener cuidado de no aspirar microesferas al pipetear al tubo de lisis. Tras la adición de la muestra, pipetear arriba y abajo 2 3 veces en el depósito para garantizar la transferencia del volumen completo. Utilizar una punta nueva para cada muestra. 10. Añadir 3,0 µl del ADN de control reconstituido al penúltimo tubo de SmartCycler (control positivo); cerrar el tubo. Tras la adición del ADN, pipetear arriba y abajo 2 3 veces en el depósito para garantizar la transferencia del volumen completo. Identificarlo como el control positivo. Desechar el ADN de control no utilizado. 11. Añadir 3,0 µl de tampón de muestras (tapón azul) al último tubo de SmartCycler (control negativo); cerrar el tubo. Utilizar el tubo de tampón de muestras del paso 5. Éste controlará la contaminación de la PCR que pudiera producirse durante la manipulación de las muestras. Identificarlo como control negativo. Desechar el tampón de muestras no utilizado. 12. Centrifugar todos los tubos de reacción durante 5 10 segundos. Utilizar la microcentrífuga especialmente adaptada suministrada con el instrumento SmartCycler. 13. Conservar los tubos a 2 8 C en el bloque refrigerador SmartCycler antes de cargarlos en el instrumento. Si es necesario, los restantes lisados pueden congelarse a -20 ± 5 C para uso posterior. 14. Crear una serie con el protocolo de la prueba BD GeneOhm Cdiff. Si es necesario, consultar el manual del operador 9 del software SmartCycler Dx. Se recomienda introducir parámetros de identificación de las muestras antes de iniciar la serie. 15. Insertar cada tubo de reacción en un módulo I-CORE en el SmartCycler y cerrar la tapa del I-CORE. Colocar los controles positivo y negativo en su posición adecuada (véase la sección titulada Control de calidad ). Empujar firmemente todos los tubos hacia abajo en su sitio. 16. Iniciar la serie. P0047(02)_ES -8-

9 Control de calidad Controles positivos y negativos Los procedimientos de control de calidad están diseñados para controlar el rendimiento de la prueba. El control positivo está destinado a controlar un fallo sustancial de los reactivos. El control negativo se utiliza para detectar la contaminación (o la transferencia) de los reactivos o del ambiente por ADN portador de genes tcdb o por amplicones de tcdb. Los controles positivo y negativo son controles del análisis (controles de la serie). Un control inválido invalida la serie. Por último, un control interno incorporado en cada mezcla reactiva está destinado a controlar la integridad del reactivo y la inhibición de la PCR en cada muestra. Hay que incluir un control positivo y uno negativo en cada serie analítica en el SmartCycler. El software asigna automáticamente la posición de los controles en el instrumento (véase el manual del operador del software SmartCycler Dx 9 ). Controles de procesamiento de muestras Se pueden analizar cepas de control adicionales de conformidad con las directrices o requisitos de la normativa local, estatal o federal, o de las organizaciones de acreditación. Se puede utilizar como control positivo de procesamiento de muestras una cepa toxinógena de C. difficile portadora del gen tcdb (p.ej. American Type Culture Collection, ATCC 43255, o un aislado clínico de C. difficile bien caracterizado, identificado como portador del gen tcdb) mientras que se puede utilizar como control negativo de procesamiento de muestras un cultivo de una cepa no toxinógena de C. difficile (p.ej., ATCC ). Las colonias se aíslan tras 18 a 24 horas de incubación anaerobia en agar sangre de carnero al 5%. Resuspender las colonias en solución salina hasta una turbidez de 0,5 McFarland (~1,5 X 10 7 UFC/mL). Diluir con solución salina hasta obtener una suspensión de ~10 6 UFC/mL. Sumergir una torunda seca en la suspensión bacteriana, y exprimir el exceso de líquido. Procesar y analizar como una muestra clínica (véanse las secciones tituladas Preparación de las muestras y Procedimiento de la prueba BD GeneOhm Cdiff ), incluyendo los controles. Todas las muestras y controles deben producir resultados válidos (ningún control positivo o negativo inválido; ningún control interno fallido; y ningún resultado incorrecto de los controles de procesamiento de muestras, cuando se llevan a cabo controles de procesamiento de muestras). En el caso de que se produzca un resultado incorrecto de los controles de procesamiento de muestras, se recomienda obtener una nueva alícuota de la muestra fecal original, y analizar de nuevo esta muestra junto con nuevos controles antes de registrar los resultados. Para orientación general acerca del control de calidad, el usuario puede consultar los documentos CLSI MM3 10 y C Cultivo de muestras clínicas Para realizar la identificación a nivel de especie directamente desde las heces, las muestras clínicas se pueden cultivar siguiendo los procedimientos del hospital. Interpretación de los resultados El algoritmo de decisión para la prueba BD GeneOhm Cdiff está integrado en el software SmartCycler DX. La interpretación de los resultados de la prueba se lleva a cabo según los siguientes criterios: Tipo de muestra Resultado de la prueba registrado por el instrumento 9 Resultado del CI registrado por el instrumento 9 Interpretación de resultados por parte del usuario NEG (NEG) PASS (PASA) No se ha detectado ADN del gen tcdb. Muestra clínica POS (POS) NA (NA) Detectado ADN del gen tcdb. Unresolved (No resuelto) FAIL (FALLO) Muestra no resuelta o inhibidora, o fallo de los reactivos ND (ND) ND (ND) No determinado debido a un fallo del módulo I-CORE (con códigos de advertencia o error 9 ) Valid (Válido) NA (NA) Control positivo válido; serie válida si el control negativo también es válido. Control positivo Control positivo inválido; serie inválida A. Invalid (Inválido) NA (NA) Los resultados de la prueba son inválidos y no se deben registrar. Valid (Válido) PASS (PASA) Control negativo válido; serie válida si el control positivo también es válido. Control negativo Control negativo inválido; serie inválida A. Invalid (Inválido) FAIL (FALLO) Los resultados de la prueba son inválidos y no se deben registrar. CI: control interno; NA: no aplicable; ND: no determinado. A En la pantalla y en los informes se registran las series analíticas inválidas o los códigos de error o advertencia del instrumento. Antes de registrar resultados de C. difficile, verificar siempre que la serie analítica es válida. P0047(02)_ES -9-

10 Serie analítica inválida Utilizando el (los) lisado(s) congelado(s), preparar nuevos tubos de reacción para todas las muestras clínicas de esa serie analítica junto con nuevos tubos de control. Muestra no resuelta Repetir la prueba con el lisado congelado de la muestra correspondiente. El efecto del ciclo de congelación-descongelación ha demostrado reducir el efecto de las sustancias inhibidoras de la PCR. Muestra no determinada por fallo del módulo I-CORE Repetir la prueba con el lisado congelado de la muestra correspondiente. Para la interpretación de los mensajes de códigos de advertencia o error, consultar el manual del operador del software SmartCycler Dx 9. Limitaciones del procedimiento No se han establecido las características de rendimiento de esta prueba con instrumentos de PCR automatizados en tiempo real diferentes del SmartCycler. Esta prueba se realiza solo con heces líquidas o blandas; no se han establecido las características de rendimiento de otros tipos de muestras clínicas. Se pueden producir también resultados analíticos negativos por una incorrecta recogida, manipulación o conservación de las muestras, presencia de inhibidores, error técnico, confusión de muestras, o porque el número de organismos de la muestra es inferior a la sensibilidad analítica de la prueba. Es necesario el cumplimiento estricto de las instrucciones dadas en el presente prospecto y en el manual del operador del software SmartCycler Dx 9 para evitar resultados erróneos. El uso de esta prueba debe estar limitado a personal con formación acerca del procedimiento y del uso del SmartCycler. La prueba BD GeneOhm Cdiff puede generar resultados no resueltos o inválidos debido a un control inválido; en ese caso, es necesario repetir el análisis del lisado conservado a -20 ± 5 C, lo cual provocará un retraso en la obtención de los resultados. Un resultado positivo de la prueba no indica necesariamente la presencia de organismos viables. Indica, no obstante, la presencia del gen tcdb y permite la presunta detección del organismo toxinógeno C. difficile. La prueba BD GeneOhm Cdiff no se puede utilizar para la identificación a nivel de especie, ya que no contiene cebadores ni sondas específicas para el C. difficile. Las mutaciones o los polimorfismos en las regiones de fijación de los cebadores o las sondas pueden afectar a la detección de variantes del gen tcdb de C. difficile, provocando un resultado falso negativo con la prueba BD GeneOhm Cdiff. Aunque no hay necesidad de preparar los reactivos y la principal operación técnica es el pipeteado, las buenas técnicas de laboratorio son esenciales para la ejecución correcta de esta prueba. Debido a la elevada sensibilidad analítica de esta prueba, hay que tener sumo cuidado para conservar la pureza de todos los reactivos, especialmente en los casos en que se extraen múltiples alícuotas de un tubo. Las variantes toxinógenas de C. difficile carentes del gen tcdb o con la proteína de la toxina B no funcional son muy raras El análisis BD GeneOhm Cdiff actúa sobre el gen tcdb y no se sabe si detectaría cepas variantes toxina A+/toxina B-. El análisis BD GeneOhm Cdiff no ha sido evaluado con los siguientes virus que pueden estar presentes en muestras fecales: virus con ARN enterovirus, astrovirus, norovirus, rotavirus y virus de la hepatitis A; virus con ADN adenovirus. No obstante, la homología de secuencias entre los cebadores de la prueba BD GeneOhm Cdiff y la sonda diana con respecto a estos virus en muy baja. Los cebadores y la sonda diana del análisis BD GeneOhm Cdiff fueron diseñados para discriminar el gen de la toxina B de C. difficile del gen de la toxina mortal de C. sordellii. No obstante, se puede producir reactividad cruzada debido a la elevada homología de secuencias entre la toxina B de C. difficile y la toxina mortal de C. sordellii. Debido a la escasa incidencia y limitada disponibilidad de C. sordellii, sólo se dispuso de una cepa para realizar las pruebas de reactividad cruzada con el análisis. No se observó reactividad cruzada alguna. P0047(02)_ES -10-

11 Sustancias interferentes Se evaluaron veintiséis (26) sustancias químicas y biológicas que se utilizan o se encuentran ocasionalmente en muestras perianales, rectales o fecales para determinar su posible interferencia con el análisis Entre ellas se cuentan, sin limitación, la sangre y la mucosidad. La excesiva presencia de sangre puede inhibir la PCR y puede arrojar resultados no resueltos. Las veinticuatro (24) sustancias restantes ilustradas en la tabla de abajo no mostraron ninguna interferencia detectable con el análisis. Sustancias endógenas y exógenas comerciales analizadas con el BD GeneOhm Cdiff Sustancia Resultado Sustancia Resultado Anusol MC Plus* ** Monistat Derm Crema de nitrato de miconazol CSP al 2% (McNeil) Ihle s Paste de Atlas* Pasta de óxido de cinc al 25% p/p (Laboratoire Atlas Inc.) Sulfato de bario Solución fresca de forma en polvo (LabMat) Ácido palmítico* Solución fresca de polvo (LabMat) Preparación H con Bio-Dyne * Crema (Wyeth) Crema de acetato de hidrocortisona Exact * USP 0,5 % (Taro Pharmaceuticals Inc.) Preparación H con Bio-Dyne * Pomada (Wyeth) Alivio estomacal Exact Subsalicilato de bismuto líquido (Perrigo ) Grasa fecal Toallitas húmedas de ph 5,5 Fresh control (Blue Skin) Gel hidratante vaginal Gyne Moistrin (Schering) Imodium AD * Solución oral de clorhidrato de loperamida (McNeil) Kaopectate Suspensión oral de atapulguita (Pharmacia & Upjohn) Gelatina K-Y (Johnson & Johnson Inc.) Metronidazol Solución fresca de forma en polvo (Acros Organics) * Sustancia ensayada con dos cepas de C. difficile (Tox 0 y Tox VIII). ** : Ninguna interferencia detectable con la prueba BD GeneOhm Cdiff. Características de rendimiento Supositorios Neo-Laryngobis* de Rougier (Rougier Pharma) Supositorios SAB-Dimenhydrinate * (SABEX ) Ácido esteárico* Solución fresca de polvo (LabMat) Condones de látex Trojan (con nonoxinol-9) lubricante espermicida (Church & Dwight Co., Inc.) Apósitos de limpieza personal Tucks MC Apósitos húmedos de tela suave (Pfizer) Crema antiprurítica Vagisil (Combe Incorporated) Vancomicina Líquido (MP Biomedicals, LLC) Vaseline TM* Vaselina blanca U.S.P. (Lever Pond s) Las características de rendimiento de la prueba BD GeneOhm Cdiff se determinaron en un estudio prospectivo multicéntrico de investigación. Participaron en el estudio cuatro (4) centros médicos, dos (2) en Canadá y dos (2) en los Estados Unidos. Para participar en el estudio, las muestras tenían que proceder de personas para quienes el análisis de Clostridium difficile estaba indicado o había sido solicitado, según las normas institucionales. La prueba de citotoxicidad de referencia se llevaba a cabo utilizando un análisis de citotoxicidad en cultivo celular de muestras fecales líquidas o blandas, en el plazo de 48 horas desde su recogida. El procedimiento se realizaba siguiendo las instrucciones de uso del fabricante. Se analizó un total de 1108 muestras con la prueba de referencia descrita más arriba y con la prueba BD GeneOhm Cdiff, que produjeron 1090 resultados registrables. El primer conjunto de datos comprende 835 muestras frescas analizadas en (3) de los cuatro (4) centros clínicos (Tabla 1). En comparación con la prueba de referencia, la prueba BD GeneOhm Cdiff identificó el 93,8% de las muestras positivas para C. difficile y el 95,5% de las muestras negativas (Tabla 2). Para la población analizada, esto dio lugar a un valor pronóstico negativo (VPN) del 99,1% y a un valor pronóstico positivo (VPP) del 67,3%. Los análisis realizados en el cuarto centro clínico revelaron que la prueba de citotoxicidad de referencia no estaba registrando resultados exactos. Debido al elevado número de resultados inexactos de la prueba de referencia, se volvieron a analizar muestras a partir de alícuotas de las muestras fecales originales que habían sido congeladas después del análisis inicial. Estas alícuotas congeladas fueron analizadas con la prueba de referencia y con la prueba BD GeneOhm Cdiff. El segundo conjunto de datos procede de 255 muestras fecales congeladas disponibles para su análisis (Tabla 3). En comparación con la prueba de referencia, la prueba BD GeneOhm Cdiff identificó el 100% de las muestras positivas para C. difficile y el 97,7% de las muestras negativas del conjunto de datos de muestras congeladas, dando lugar a un VPN del 99,2% y a un VPP del 81,5% (Tabla 4). De 852 muestras frescas analizadas con el BD GeneOhm Cdiff, 39 se registraron inicialmente como no resueltas (4,6%). Tras repetir el análisis de los lisados congelados, 22 se resolvieron y 17 permanecieron sin resolver (2,0%) (Tabla 5). De 256 muestras congeladas analizadas con el BD GeneOhm Cdiff, solo una (1) muestra (0,4%) se registró inicialmente como no resuelta. La muestra siguió sin resolver tras repetir el análisis del lisado congelado (0,4%) (Tabla 6). Una (1) serie se registró como inválida debido a un fallo del control de la serie (0,6%). La serie se registró como válida tras repetir el análisis de los lisados de las muestras (Tabla 7). P0047(02)_ES -11-

12 Tabla 1: Resultados obtenidos en heces frescas con la prueba BD GeneOhm Cdiff en comparación con la prueba de referencia Prueba de citotoxicidad de referencia + - Prueba BD GeneOhm Cdiff La prueba de citotoxicidad en cepas aisladas fue positiva para 21 de las 34 muestras, verificando la presencia de C. difficile toxinógeno. Para las 13 muestras restantes, una PCR estándar con cebadores alternativos seguida de secuenciación direccional reveló que 11 de las 13 muestras contenían el gen tcdb esperado. Para dos (2) de las cinco (5) muestras falsas negativas se recuperó C. difficile por cultivo, y solo una (1) de estas dos (2) se registró como toxinógena. De las tres (3) muestras falsas negativas en la PCR restantes no se recuperó C. difficile por cultivo. Tabla 2: Rendimiento obtenido en heces frescas con la prueba BD GeneOhm Cdiff en comparación con el método de referencia Centros clínicos Prevalencia Sensibilidad con un IC* del 95% Especificidad con un IC* del 95% Centro 1 11,0% (40/365) 90,5% (38/42) (77,4% 97,3%) 95,7% (309/323) (92,8% 97,6%) Centro 2 6,7% (16/240) 94,4% (17/18) (72,7% 99,9%) 96,4% (240/249) (93,2% 98,3%) Centro 3 11,1% (18/162) 100% (21/21) (83,9% 100%) 94,0% (171/182) (89,4% 96,9%) General 9,6% (74/767) 93,8% (76/81) (86,2% 98,0%) 95,5% (720/754) (93,8% 96,9%) * IC: Intervalos de confianza Tabla 3: Resultados obtenidos en heces congeladas con la prueba BD GeneOhm Cdiff en comparación con la prueba de referencia. Prueba de citotoxicidad de referencia + - Prueba BD GeneOhm Cdiff Tabla 4: Rendimiento obtenido en heces congeladas con la prueba BD GeneOhm Cdiff en comparación con el método de referencia Centro clínico Prevalencia Sensibilidad con un IC* del 95% Especificidad con un IC* del 95% Centro 4 12,7% (34/267) 100,0% (34/34) (89,7% 100%) 97,7% (216/221) (94,8% 99,3%) * IC: Intervalos de confianza P0047(02)_ES -12-

13 Tabla 5: Tasas de resultados no resueltos en heces frescas Tasa inicial de no resueltos Tasa de no resueltos tras la repetición Centros clínicos con un IC* del 95% con un IC* del 95% Centro 1 0,8% (3/367) (0,2% 2,4%) 0,5% (2/367) (0,1% 2,0%) Centro 2 6,6% (18/273) (4,0% 10,2%) 2,2% (6/273) (0,8% 4,7%) Centro 3 8,5% (18/212) (5,1% 13,1%) 4,2% (9/212) (2,0% 7,9%) General 4,6% (39/852) (3,3% 6,2%) 2,0% (17/852) (1,2% 3,2%) * IC: Intervalos de confianza Tabla 6: Tasas de resultados no resueltos en heces congeladas Tasa inicial de no resueltos Tasa de no resueltos tras la repetición Centro clínico con un IC* del 95% con un IC* del 95% Centro 4 0,4% (1/256) (0,0% 2,2%) 0,4% (1/256) (0,0% 2,2%) * IC: Intervalos de confianza Tabla 7: Tasas generales de series inválidas Centro Tasas de series inválidas con un IC* del 95% Centro 1 2,6% (1/38) (0,1% 13,8%) Centro 2 0,0% (0/41) (0,0% 8,6%) Centro 3 0,0% (0/58) (0,0% 6,2%) Centro 4 0,0% (0/23) (0,0% 14,8%) General 0,6% (1/160) (0,0% 3,4%) * IC: Intervalos de confianza Especificidad analítica Se analizó el ADN genómico de una cepa no toxinógena de C. difficile, de dos cepas del toxinótipo XI que carece del gen tcdb 17 y de 29 cepas de otros Clostridium (entre ellos una cepa de C. sordellii), junto con 99 organismos estrechamente relacionados y otros microorganismos patógenos y comensales de la flora presente en el intestino y en las heces (que representaban a 96 especies). Todas las cepas fueron analizadas a una concentración aproximada de 1 X 10 8 UFC/mL o 1 X 10 8 copias diana/ml. Ninguna de estas especies dio positivo con la prueba BD GeneOhm Cdiff. Sensibilidad analítica Se analizaron cultivos cuantificados y ADN genómico purificado diluido en tampón de muestras de la prueba BD GeneOhm Cdiff en cinco (5) duplicados. El límite de detección se definió como la concentración más baja, en número de copias de ADN por reacción y en UFC por reacción, en la que cinco duplicados de cinco resultaban positivos. La sensibilidad analítica (límite de detección o LDD) de la prueba BD GeneOhm Cdiff se determinó con una cepa de Clostridium difficile toxinótipo 0 portadora del gen tcdb (ATCC 43255). El LDD de la prueba BD GeneOhm Cdiff es de 10 copias de ADN por reacción. El LDD en unidades formadoras de colonias (UFC) se establece en 4 UFC por reacción. La sensibilidad analítica en UFC por reacción fue confirmada con una segunda cepa toxinógena de Clostridium difficile del toxinótipo 0 (ATCC 9689) y con los toxinótipos IIIa (SE ), V (SE ), VII ( ) y VIII ( ). Además de las cepas utilizadas para la determinación del LDD, se evaluaron otras cien (100) cepas toxinógenas de C. difficile (entre ellas otros 17 toxinótipos) que representaban a 21 países, procedentes de aislados clínicos bien caracterizados o de colecciones públicas, mediante la prueba BD GeneOhm Cdiff. Las cepas de C. difficile fueron analizadas a una concentración aproximada de 6,7 copias de ADN/µL o 1 UFC/µL. La prueba identificó correctamente las 100 cepas de C. difficile portadoras del gen tcdb. Reproducibilidad El panel de reproducibilidad consistió en tres (3) categorías de muestras simuladas en las que cada tubo contenía 100 µl de flora intestinal simulada; los dos miembros positivos del panel estaban también inoculados con C. difficile (ATCC 43255). Adicionalmente, se incluyeron dos (2) controles de procesamiento de muestras (ATCC 9689 y ATCC 25922) y dos (2) controles de serie (positivo y negativo). Se analizaron las muestras, por triplicado por cada serie del panel, en cinco (5) días diferentes (consecutivos o no), analizando dos (2) paneles cada día, uno para cada uno de dos (2) tecnólogos, en tres (3) centros clínicos con un (1) lote de reactivos. Uno (1) de estos centros clínicos participó en el estudio ampliado en el que se analizaron dos (2) lotes adicionales de reactivos. La concordancia porcentual general para la categoría de muestras positivas débiles para C. difficile es del 96,7%; en la categoría de muestras positivas moderadas para C. difficile es del 100% y la categoría de muestras negativas dio un 100% de reproducibilidad entre centros (Tabla 8). P0047(02)_ES -13-

14 La concordancia porcentual general para la categoría de muestras positivas débiles para C. difficile es del 100%; en la categoría de muestras positivas moderadas para C. difficile es del 97,8% y la categoría de muestras negativas dio un 100% de reproducibilidad entre lotes (Tabla 9). El umbral de ciclo (Ct), un criterio interno utilizado para determinar un resultado final de la prueba, se seleccionó como medio adicional de evaluar la reproducibilidad de la prueba. En la Tablas 8 y 9 se presentan los valores medios generales del Ct con sus componentes de varianza (DE y % CV). Se llevó a cabo un estudio adicional de reproducibilidad, de conformidad con el protocolo del estudio original de reproducibilidad, para evaluar las muestras altamente negativas por debajo del límite de detección (LDD) de la prueba BD GeneOhm Cdiff. Se inoculó una muestra que contenía flora intestinal simulada con C. difficile (ATCC 43255) a una concentración equivalente al LDD de la prueba. Se prepararon diluciones de 100 veces y 10 veces de esta muestra, respectivamente, para obtener los dos (2) miembros del panel altamente negativos. En la Tabla 10 se muestra la concordancia porcentual general para los resultados negativos de la prueba y los valores medios generales del Ct con componentes de varianza (DE y %CV). Como era de esperar, el miembro más diluido del panel (100 veces por debajo del LDD) que contiene niveles más bajos de la diana, demuestra una concordancia porcentual más elevada para los resultados negativos de la prueba que el miembro menos diluido del panel (10 veces por debajo del LDD) que contiene niveles más elevados de la diana. Aunque los miembros del panel altamente negativos están por debajo del LDD analítico de la prueba, todavía se pueden observar resultados analíticos positivos debido a la presencia de la diana en estas muestras. Tabla 8: Resultados del estudio de reproducibilidad entre centros utilizando un lote Categoría CENTRO Centro 1 Centro 2 Centro 3 porcentual porcentual porcentual porcentual general Media general Valores del Ct NEG 30/30 100,0% 30/30 100,0% 30/30 100,0% 90/90 100,0% 36,2 0,3 0,8% POS BAJO 28/30 93,3% 29/30 96,7% 30/30 100,0% 87/90 96,7% 38,8 0,9 2,3% POS MOD 30/30 100,0% 30/30 100,0% 30/30 100,0% 90/90 100,0% 38,3 1,0 2,7% Los datos representan valores del control interno. DE % CV Tabla 9: Resultados del estudio de reproducibilidad entre lotes utilizando tres lotes Categoría LOTE Lote 1 Lote 2 Lote 3 porcentual porcentual porcentual porcentual general Media general Valores del Ct NEG 30/30 100,0% 30/30 100,0% 30/30 100,0% 90/90 100,0% 36,1 0,3 0,8% POS BAJO 30/30 100,0% 30/30 100,0% 30/30 100,0% 90/90 100,0% 38,6 1,0 2,5% POS MOD 29/30 96,7% 29/30 96,7% 30/30 100,0% 88/90 97,8% 37,8 1,1 2,8% Los datos representan valores del control interno. DE % CV Tabla 10: Estudio adicional de reproducibilidad utilizando un panel de muestras altamente negativas Miembro del panel altamente negativo Centro 1 Centro 2 Centro 3 porcentual* porcentual* porcentual* porcentual general* Media general Valores del Ct DE % CV Dilución 1:100 25/30 83,3% 21/30 70,0% 26/30 86,7% 72/90 80,0% 41,3 0,9 2,1% Dilución 1:10 11/30 36,7% 5/30 16,7% 5/30 16,7% 21/90 23,3% 40,2 1,4 3,4% * porcentual para un resultado negativo. Precisión La precisión dentro del laboratorio se evaluó para la prueba BD GeneOhm Cdiff en un (1) centro. El estudio se llevó a cabo a lo largo de 12 días, con dos (2) análisis por día y dos (2) duplicados de muestras por análisis. Entre las muestras figuraban muestras simuladas con la categoría de positivas débiles y moderadas para C. difficile así como negativas para C. difficile. Uno (1) de los 24 análisis fue excluido por fallo del control positivo (CP). Una (1) muestra positiva moderada arrojó un resultado no resuelto. Todas las demás muestras y controles dieron resultados registrables para un total de 46 duplicados. Los resultados del estudio de precisión para muestras positivas débiles y moderadas demostraron concordancia para (46/46) y (45/46) duplicados, respectivamente; los resultados de las muestras negativas demostraron concordancia para (46/46) duplicados. P0047(02)_ES -14-

15 Referencias 1. Cloud J y Kelly CP., Update on Clostridium difficile associated disease. Curr Opin Gastroenterol 2007 Jan; 23 (1): Warny M, et al. Toxin production by an emerging strain de Clostridium difficile associated con outbreaks de severe disease en North America y Europe. Lancet Sep 24-30; 366(9491): Bartlett, John G. MD, Clostridium difficile: Old y New Observations. J de Clin Gastroent 41 Supplement 1:S24-S29, May/June Hurley BW y Nguyen CC. The spectrum de pseudomembranous enterocolitis y antibiotic-associated diarrhea. Arch Intern Med Oct 28; 162 (19): Polgreen PM, et al. An outbreak de severe Clostridium difficile-associated disease possibly related a inappropriate antimicrobial therapy for community-acquired pneumonia. Infect Control Hosp Epidemiol Feb; 28 (2): Nagy E, et al. The place de molecular genetic methods en the diagnostics de human pathogenic anaerobic bacteria. A minireview. Acta Microbiol Immunol Hung Jun; 53 (2): Centers for Disease Control y Prevention. Biosafety en microbiological y biomedical laboratories. Richmond JY y McKinney RW (eds) (1993). HHS Publication number (CDC) Clinical y Laboratory Standards Institute. Protection de laboratory workers from occupationally acquired infections; Approved Guideline. Document M29 (Refer a the latest edition). Clinical Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania USA, SmartCycler Dx Software Operator Manual D4198 Rev. C, Cepheid, Sunnyvale, CA, USA. 10. Clinical y Laboratory Standards Institute. Molecular Diagnostic Methods for Infectious Diseases; Approved Guideline, document MM3- A2 (Refer a the latest edition). Clinical Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania USA, Clinical y Laboratory Standards Institute Statistical Quality Control for Quantitative Measurements: Principles y Definitions; Approved Guideline. Document C24 (Refer a the latest edition). Clinical Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania USA, Cohen SH et al. (1998) Isolation de a Toxin B-deficient mutant strain de Clostridium difficile en a case de recurrent C. difficile Associated Diarrhea, Clin. Infect. Dis. 26: Cohen SH et al. (2000) Analysis de the pathogenicity locus en Clostridium difficile strains, J. Infect. Dis. 181: Maccannell D. et al. (2006) Characterization de a novel, TcdB-deficient, NPA1 variant strain de Clostridium difficile, 46th Annual ICAAC, San Francisco, Sept McFarland, L.V., et al., Implications de the changing face de Clostridium difficile disease for health care practitioners. Am J Infect Control, (4): p Rupnik M. et al. A novel toxinotyping scheme y correlation de toxinotypes con serogroups de Clostridium difficile isolates, J Clin Microbiol, 1998, vol 36 no 8 : Rupnik M. et al. Comparison de toxinotyping y PCR ribotyping de Clostridium difficile strains y description de novel toxinotypes, Microbiology 2001, 147, Este kit se vende bajo licencia del Public Health Research Institute of the City of New York, Inc. (Instituto de Investigación de Salud Pública de la Ciudad de Nueva York) y puede utilizarse bajo los derechos de patente del PHRI solamente para diagnóstico clínico humano in vitro. La adquisición de este producto permite al comprador utilizarlo para la amplificación y detección de secuencias de ácidos nucleicos para ofrecer diagnósticos humanos in vitro. Por la presente no se concede ninguna patente general ni ninguna otra licencia de ninguna clase más que este derecho específico de uso por la adquisición. Este producto está sujeto a un acuerdo entre Molecular Probes, Inc. y Geneohm Sciences, Inc., y la fabricación, uso, venta o importación de este producto puede estar sujeto a una o más patentes de los EE.UU., solicitudes pendientes y sus correspondientes equivalentes extranjeros, propiedad de Molecular Probes, Inc. (una empresa subsidiaria propiedad en su totalidad de Invitrogen Corporation). La adquisición de este producto concede al comprador el derecho no transferible de utilizar la cantidad adquirida del producto y los componentes del producto para uso en análisis para la detección de ácidos nucleicos con el fin de identificar microorganismos en diagnóstico humano. El comprador no podrá utilizar este producto ni sus componentes para la fabricación ni para uso terapéutico o profiláctico, ni vender ni transferir en modo alguno este producto ni sus componentes a ningún tercero, ni utilizarlo para ningún otro fin que para su uso en diagnóstico humano. Para obtener información sobre cómo comprar una licencia de este producto con fines distintos al diagnóstico humano, póngase en contacto con Molecular Probes, Inc., Business Development, Willow Creek Road, Eugene, OR 97402, EE.UU., Tel: (541) Fax: (541) P0047(02)_ES -15-

16 Índice de símbolos SÍMBOLO SIGFICADO SÍMBOLO SIGFICADO Fabricante Código del lote Número de catálogo Limites de temperatura Uso diagnóstico in vitro Protéjase de la luz y de la humedad Representante europeo autorizado Volver a cerrar las bolsas después de su uso Fecha de caducidad Consultar las instrucciones de uso Contiene cantidad suficiente para n pruebas R36/38 Irrita los ojos y la piel Caja 1 de 3 Servicio de atención al cliente: Benex Limited Pottery Road Dun Laoghaire, Co. Dublin, Ireland GeneOhm Sciences Canada, Inc boul. du Parc-Technologique Québec, QC, Canada, G1P 4S5 BD, el logotipo de BD y todas las demás marcas comerciales son propiedad de Becton, Dickinson and Company BD. P0047(02)_ES -16-