El uso de levadura activa seca en cervecería. Aplicaciones más importantes.

Transcripción

2 Agenda Fermentis La fermentación alcohólica Compuestos volátiles Compuestos volátiles que impactan en el perfil sensorial Compuesto volátiles asociados a cervezas verdes Manejo de Levadura Cultivos de levadura Levadura seca Recuperación de levadura Caracetrísticas importantes de las levaduras Perfil de fermentación y cinética Azúcares Resistencia al alcohol Fermentis 2015 All rights reserved 2

4 Fermentis: Foco en la innovación Unidad de negocios del grupo Lesaffre, a cargo del desarrollo, márketing y ventas de productos innovadores y servicios para las industrias cervecera, enológica, destilados y alcohol potable. Our visión: (Ser) La opción obvia para la fermentación de bebidas Nuestra misión: Crear y vender productos innovadores a base de levaduras y sus derivados, que ofrecen soluciones técnicas sustentables, a nuestros clientes y asociados. Fermentis 2015 All rights reserved 4

5 La fermentación alcohólica

6 La fermentación alcohólica C 6 H 12 O 6 2C 2 H 5 OH + 2CO 2 Azúcar Levadura Etanol / alcohol Dióxido de carbono Glucosa o fructosa (180g/gmol) Etanol (46 g/mol) Dióxido de carbono (44 g/gmol) 180 g 92 g 88 g + Energía ATP

7 Asimiliación de azúcares Glucosa Fructosa Transportador Hexosas Glucosa Glucosidasa Maltosa Fructosa Maltosa Maltotriosa Membrana plasmática Maltotriosa Aldehídos Maltosa Etanol Etanol ATP Alcoholes superiores Compuestos de azufre CO 2 CO 2 Ésteres Ácidos orgánicos Fuente: The alcohol textbook

8 Logaritmo en base 10 del número de células/ml Fase de latencia o "lag" Fase de aceleración Fase exponencial Fase de desaceleración Fase estacionaria Fase de muerte celular Curva de crecimiento N= 58 x 10 6 células/ml N o = 5 x 10 6 células/ml Horas de fermentación Fermentis - All rights reserved 8

9 Biomasa Producción de biomasa Pi Glucosa ATP NAD(P)H, FADH 2 Glucosa 6-P Fructosa 6-P Pentosa 5-P Eritrosa 4-P 3 P-Glicerato Priuvato Acetil-CoA α-cetoglutarato Succinil-CoA Oxaloacetato SO 4 NH 4 Ácidos grasos (8) Azúcares (25) Amino ácidos (20) Lípidos Lipopolisacáridos Glicógeno Peptidoglicanos Proteínas Cuerpos de inclusión Envoltura celular y membranas internas Citosol Poliribosomas Nucleótidos (8) ARN Cromosomas ADN

10 Cambios en la fermentación Extracto Veloc. de ferment Azúcar P. osmótica Levaduras O 2 ph Alcohol CO 2

11 Cambios en la fermentación Parámetro Inicio Fin Extracto total 12% / 1,046 1,8 2,5% / g/ml 1,005 1,008 g/ml Concentración de azúcar 8 10% p/p 0 0,5% p/p Valor ph 5,2 5,6 4,1 4,5 Oxígeno disuelto 8 9 mg/l 0 mg/l Presión osmótica 0,8 mpa 2,3 mpa Concentración de levadura mill/ml mill/ml Concentración de etanol 0 4 5% p/p Presión CO 2 a presión constante g/l

12 La fermentación alcohólica C 6 H 12 O 6 2C 2 H 5 OH + 2CO 2 Azúcar Levadura Etanol / alcohol Dióxido de carbono Glucosa o fructosa (180g/gmol) Etanol (46 g/mol) Dióxido de carbono (44 g/gmol) 180 g 92 g 88 g 100% eficiencia = máximo teórico No existe en realidad Eficiencia (<100%) = alcohol real / máximo teórico

13 Maceración Hacia dónde van los azúcares? Almidón Etanol Glicerol Lactato CO 2 Azúcares fermenta-bles + Azúcares no fermenta-bles Fermentación Acetato Succínico Biomasa Azúcar residual Dextrinas Azúcares residuales

14 Maceración Hacia dónde van los azúcares? Almidón Etanol Glicerol Lactato CO 2 Azúcares fermenta-bles + Azúcares no fermenta-bles Fermentación Acetato Succínico Biomasa Azúcar residual Dextrinas Azúcares residuales

15 Compuestos volátiles Compuestos volátiles que impactan en el perfil sensorial Compuesto volátiles asociados a cervezas verdes

16 Desarrollo de compuestos volátiles: aromas Se producen durante la fermentación Presentes en bajas concentraciones, pero con umbrales de detección muy bajos Influencian notoriamente el perfil sensorial de las cervezas VOLÁTILES Ácidos grasos Ácido acético Ácido butírico Ácido 3-methyl butírico Ésteres Acetato de etilo Isoamil acetato Etil-caproato Etil-vapilato Etil-laurato Etil-hexanoato Aldehídos Acetaldehído 2-nonenal 3-Metil-butanal Trans-2-heptanal Isobutiraldehído Alcoholes Etanol 2-Metil-butanol 3-Metil-butanol 2-Fenil-butanol 3-Fenil-etanol 4-Etil-fenol Hexanol Isoamylalcohol Isobutylalcohol Octanol

20 Alcoholes superiores 450 Alcoholes superirores totals (ppm) = Propanol + Isobutanol + Alcohol isoamílico W34/70 S23 S189 K97 US05 S04 WB06 S33 T58 Saflager Safale Safbrew Fermentis 2015 All rights reserved 20

21 Producción de compuestos volátiles Veloc de fermentaicón

22 Expresión aromática de Safbrew WB-06 Puntos clave Expresión de ésteres Baja temperatura e inoculación Tiempo largo de fermentación Elevada expresión de alcoholes superiores Elevada temperatura e inoculación Tiempo corto de fermentaicón Fácil de manejar con levadura activa seca Fermentis 2015 All rights reserved 22

24 Curva de producción y reducción de diacetilo

25 Producción y reducción de VDKs Treonina Azúcares del mosto Piruvato α-acetohidroxibutirato α-acetolactato Isoleucina Valina α-acetolactato α-acetohidroxibutirato diacetilo 2-3-pentanediona 2-3-pentanediol 2-3-butanodiol

26 Curva de producción y desaparición de acetaldehído

27 Producción de acetaldehído Aroma a manzanas verdes Fermentación alcohólica Piruvato H + CO 2 Piruvato decarboxilasa Acetaldehído Alcohol deshidrogenasa NADH + H + NAD + Etanol

28 Metabolismo del azufre La levadura necesita azufre para la síntesis de proteínas, ciertas coenzimas y vitaminas El metabolismo del azufre es de vital importancia para la calidad de la cerveza. Durante la fase de multiplicación, las levaduras utilizan azufre (aa azufrados) orgánico e inorgánico (iones SO 4-2 ) como fuente de S. La fuente preferida por la levadura en el mosto es la metionina, pero otras formas orgánicas pueden ser usadas Las vías involucradas producen compuestos organolépticamente activos, percibidos como aromas de cerveza verde. Durante la maduración son eliminados por la levadura o por efecto lavado del CO 2.

29 Producción de H 2 S

30 H 2 S y mercaptanos El H 2 S juega un rol central y se forma luego de varias etapas de reacción. Se genera debido al metabolismo de la levadura, y durante la fermentación la máxima tasa de producción coincide con la velocidad máxima de crecimiento La cantidad producida depende de la composición del mosto, de la temperatura y de la cepa empleada. Las cepas de fermentación alta tienden a producir menores cantidades que las de baja en las mismas condiciones. El exceso de H 2 S puede llevar a la producción de mercaptanos.

32 Tipos de levaduras utilizadas en cervecería Presentación Puerza Almacenamiento madre Costo madre Transporte madre Trabajo Riesgo Slant puro Asegurada desde laboratorio 2-4 meses en refrigerador Elevado Difícil Alto Elevado Cultivo líquido Suficiente en caso que haya buen control de calidad 1 semana en refrigerador Bajo Muy difícil Alto Elevado Levadura seca activa Suficiente en caso que haya buen control de calidad 2 años a temp ambiente Medio - bajo Fácil Bajo Bajo

33 Fase no estéril Producción de biomasa Propagación Fase de laboratorio Medio sólido Medio líquido 50 ml Fase estéril HB 20 l 48 hs C 24 hs C 24 hs C 10 ml 100 ml 1 l Craf t 10 l

34 La biomasa de levadura es crecida bajo aireación (los agitadores o shakers son la mejor opción) Fase de laboratorio Se requiere un laboratorio microbiológico. La esterilidad es absolutamente necesaria. Se requieren cuatro días de cultivo para inocular un carboy (HB), partiendo desde un slant. Se requieren cinco días para tener un cultivo estéril de 10 litros, para ir a la fase industrial

35 Medio ideal para producción de biomasa El medio ideal es un mosto cervecero estéril, de aproximadamente 10 P (siempre conviene guardar de la gestión anterior) No es bueno suplementar con azúcar, porque se generan deficiencias de N Nunca usar azúcar pura.

36 Producción de biomasa en microcervecerías Cultivo de 10 litros, proveniente de la fase lab 24 h C Prop 1 (50 l) 24 h C Prop 2 (500 l) 24 h C 24 h Temp. normal de fermentació n 24 h C Tanque CC 5000 l Propagación feed batch

37 Fase industrial Dependiendo del tamaño de los fermentadores, se requiere entre 2 y 3 días adicionales para alcanzar la biomasa necesaria en fermentación. La fase industrial no es estéril (riesgo de contaminación) Controles microbiológicos (conteo celular, viabilidad, vitalidad, paqueos) se requieren para asegurar la calidad de la levadura. Cuando en la cervecería se maneja más de una cepa de levadura, se incrementa la dificultad. Mano de obra intensiva (costos ocultos)

38 Producción de biomasa Cuál es el mejor sitio para producir biomasa? Producir biomasa de levadura en una fábrica de cerveza? Producir biomasa de levadura en fábricas especializadas?

39 Qué es una levadura seca Fuente: se parte de levaduras puras, almacenadas en laboratorios específicos, donde es verificado en forma constante el genoma. Propagadas en sitios industriales especializados, bajo condiciones de higiene muy estrictas. Es secada utilizando la tecnología de lecho fluidizado. El producto sólo es liberado al mercado luego de controles muy específicos, que incluyen tests de fermentación, controles microbiológicos y viabilidad. Almacenamiento prolongado (2 años)

41 Cómo es producida la LAS? Los cultivos se crecen en medios balanceados, cuya base es la melaza de caña. Se mantienen condiciones totalmente aeróbicas a través de cultivos feed batch para lograr máximo producción de biomasa Efecto crabtree (concentración de azúcar < 0,5%)

42 Gx26 Gx1600 Producción de LAS Luego del secado Se preserva la forma esférica de las levaduras Espacio libre ente células Rehhdratacón instantánea Qué ocurre con la membranta luego del secado? Microganulados de LAS ~1mm bajo microcopio óptico Fermentis 2015 All rights reserved 42

43 Características de las LAS Antes del secado Materia seca: 20 a 35 %. Agua : 75 a 80 %. Superficie lisa / suave. Optima turgencia. Luego del secado Materia seca: 94,0 % 96,5 %. Agua: 6 % a 3,5 %. Paredes celulares desorganizadas. No hay turgencia.

44 La membrana de las levaduras cerveceras y el secado «Permeablidad selectiva» Fosfolípidos + proteínas + carbohydratos + lípids + = Membrana Sterol Fermentis 2015 All rights reserved 44 Source : Wikipedia

45 La membrana de las levaduras cerveceras y el secado Hydratada Secado Seca Tamaño completo Reducción de tamaño Parcialmente cristalina Plegado Endovesícula Fluidez / forma amorfa Rígida / forma cristalina Fermentis 2015 All rights reserved 45

46 Trehalosa y estabilidad de la membrana La membrana de las levaduras cerveceras y el secado «levadura activa seca» Sin trehalosa Rotura Baja rotura Secado Hidratación Fermentis 2015 All rights reserved 46

47 La membrana de las levaduras cerveceras y el secado Hidratación Plegado Levadura viva Endovesículas Levadura muerta Recuperación de la funcionalidad de la membrana Reducción del tamaño de membrane Riesgo de rotura Rotura durante el secado Levadura muerta Levadura muerta El know how del productor de levaduras hace la diferncia Fermentis 2015 All rights reserved 47

48 Cómo usar la LAS? Hidratación La LAS es porosa, permitiendo el ingreso violento de agua. La membrana de las levaduras contiene lípidos. La fluidez depende de la temperatura. A bajas temperaturas, los lípidos son menos fluidos y pueden tener más estructuras cristalinas. Riesgo de disrupción El proceso de hidratación debe adaptarse a la temperatura

49 Viabilidad (%) Cómo usar la LAS? Típica curva de viabilidad 80 % viabilidad Levaduras robustas Temperatura de rehidratación (ºC) Levaduras frágiles

50 Viabilidad (%) Cómo usar la LAS? Hidratación RECOMENDACIÓN: Levadura sobre la superficie del líquido Agitación suave o nula No agregar liquid sobre la levadura

51 Procedimiento simple de rehidratación Rehidratación de la levadura Ale C 20 min Lager C Esparcir sobre 10 veces su propio peso de agua y esperar 10 min Mezclado suave Dejar descansar 20 min Inocular en el fermentador Fermentis 2015 All rights reserved 51

52 Tiempo antes de la inoculación Temperatura luego de la rehidratación y antes de la incoulación Máximo tiempo de espera 4 C 18 h 20 C 6 h 25 C 4 h Válido para todas las levaduras rehidratadas en agua estéril Fermentis 2015 All rights reserved 52

53 Inoculación Rango Temperatura de rehidratación Temperatura de fermentación Tasa de inoculación recomendada [ C] [ C] [g/hl] Ales g/hl Salager g/hl < g/hl Inoculación en base a biomasa y no en base a número de células La biomasa equivale al peso seco La actividad está relacionada al peso seco 53

54 Inoculación por peso seco A B 54

55 Inoculación directa 2/ Inocular levadura seca dircta sobre el mosto 1/ Llenar el cono del tanque con mosto a 21 C - 29 C (dependiendo la cepa) 3/ Completar el tanque de fermentación con mosto a temperature de fermentación Fermentis 2015 All rights reserved 55

56 Tanque de rehidratación Agitador excéntrico con velocidad variable Boca hombre Entrada de liquido Drenaje Termómetro

57 Inoculación

58 Reutilización de levaduras secas A F MC E MF - I MF - II R0 R1 º º º º º R2

61 % de asimilación de azúcares Perfil e fermentación Perfil de fermentación, gravedad orignia 18 P 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% Time (Days) S23 18 S W34/70 18 S04 18 US05 18 K97 18 T58 18 S33 18 WB06 Lager Ale Brew 90% 100% Varios perfiles diferentes Fermentis 2015 All rights reserved 61

62 % de asimilación de azúcares Perfiles de fermentaición: Saflager Perfil de fermentación, gravedad orignal 18 P 0% Time (Days) % 20% 30% 40% 50% 60% 18 S23 18 S W34/70 70% 80% 90% 100% Las levaduras lagers necesitan más tiempo que las ales. Diferentes cinéticas entre lagers Fermentis 2015 All rights reserved 62

63 % de asimilación de azúcares Perfiles de fermentaición: Safale Perfil de fermentación, gravedad orignia 18 P 0% Time (Days) % 20% 30% 40% 50% 60% 18 S04 18 US05 18 K97 70% 80% 90% 100% Diferentes cinéticas entre las ales Fermentis 2015 All rights reserved 63

64 % de asimilación de azúcares Perfiles de fermentación: Safbrew Perfil de fermentación, gravedad orignia 18 P 0% Time (Days) % 20% 30% 40% 50% 60% 18 T58 18 S33 18 WB06 70% 80% 90% 100% Safbrew WB-06 (para cervezas de trigo) es la más lenta. Fermentis 2015 All rights reserved 64

66 Asimilación de azúcares (%) Perfiles de fermentación dependiendo la gravedad orginal A 0% Safale US-05) Tiempo (días) % 40% 60% 13,5 US05 18 US05 22,5 US05 80% 100% 120% Fermentis 2015 All rights reserved 66

67 6 OH H 2 C 5 H C O H H C 1 OH HO C C 2 3 H OH O 6 OH H 2 C 5 H C O H H OH C 1 C C 2 3 H OH O Almidón Esta formado por dos tipos de cadenas de glucosas Amilosa, cadena lineal con uniones 1-4 Amilopectina, cadena ramificadas con uniones 1-4 y 1-6 C H C H H 4C HO 6 H 2 C 5 C H OH C 3 H OH O H C 2 OH H C 1 O H 4C 6 H 2 C 5 C H OH C 3 H O H H C 1 C 2 OH O H 4C 6 H 2 C 5 C H OH C 3 H OH O H H C 1 C 2 OH O H 4C 6 H 2 C 5 C H OH C 3 H OH O H C 2 OH H COH 1

68 Degradación de Almidón: amilosa

69 Degradación de Almidón: amilopectina Amilosa

70 Actividad enzimática Enzima Producto ph Óptimo Temp. Óptima Temp. de Inactivación - Amilasa Cortes al azar Dextrinas y maltotriosa 5,3-5, ºC 80 ºC - Amilasa Ataque desde le extremo reductor Maltosa 5,0-5, ºC 70 ºC

71 Azúcares derivados del almidón Fermentables No Fermentables Glucosa Maltosa Maltotriosa Dextrinas > 3 unidad es de glucos a DP1 DP2 DP3 >DP3

72 Utilización de azúcares en los mostos cerveceros Orden de utilización de azúcares en un mosto cervecero (Stewart, 2009)

74 Maltotriosa residual * 18 P EBC tubes 14.0 Maltotriosa residual (g/l) (18 P tubos EBC) W34/70 S23 S189 K97 US05 S04 WB06 S33 T58 Abbaye BE-256 Saflager Safale Safbrew *Depende de la calidad del mosto Fermentis 2015 All rights reserved 74

76 Etanol final % v/v Etanol final Etanol final vs gravedad original (T58) Original Gravity P Example of the Safbrew T-58 : Part from a certain level of sugar in the wort, the yeast cannot assimilate the sugar to produce alcohol Fermentis 2015 All rights reserved 76

79 Azúcares resiudlaes Manejo de la drinkability y el cuerpo / redondez con la matotriosa residual Residual Maltotriose (g/l) (18 P EBC tubes) W34/70 S23 S189 K97 US05 S04 WB06 S33 T58 Abbaye BE-256 Saflager Safale Safbrew *Depends on the wort quality Fermentis 2015 All rights reserved 79

81 Final Ethanol (%) Etanol final ,5 P 18 P 22,5 P 27 P 0.00 W34/70 S23 Saflager S189 K97 US05 Safale S04 WB06 S33 T58 27 P 22,5 P 18 P 13,5 P Safbrew Tiempo (días) Fermentis 2015 All rights reserved 81

82 Etanol final Depende de: Gravedad inicial Hidrólisis (calidad de la malta, diagram de maceración, actividad enzimática) Hydrólisis (calidad de la malta, diagram de maceración, actividad enzimática) Levadura (cepa, nutrición ) Otros (Contaminaciones ) Fermentis 2015 All rights reserved 82

83 Floculación Depende de: Cepa (Proteínas FLO y / manosas complementarias complementarity) Composición del medio: Presencia of Ca++, ph (no relevante a el típico ph de las cervezas) Fermentis 2015 All rights reserved 83

84 Floculación Activador Ca 2+ Residuos de manosa de paredes Proteína Flo inactiva Proteína Flo (activa) Proceso reversible, asexual, calcio dependiente, donde miles de células se adhieren formando flóculos, que luego sedimentan (fermentación baja) o emergen a la superficie (fermentación alta tradicional) E.V. Soares: J Appl Microbiol Jan;110(1):1-18. E.V. Soares: J Appl Microbiol Jan;110(1):1-18.

85 Floculación de cepas ales y lagers Normalmente las cepas tipo ale floculan y suben a la superficie del fermentador (fermentación alta), probablemente al adherirse burbujas de CO 2 a los sitios hidrofóbicos de los flóculos (arrastre). Las cepas lager floculan y luego sedimentan (fermentación baja). Floculación y sedimentación son cosas diferentes. Las cepas ale siempre terminan sedimentando.

86 Levaduras en suspensión

87 Floculación

88 Sedimentacion

89 Levaduras ales tradicionales

90 Floculación ales tradicionales CO 2

91 Cepas ales tradicionales: floculación

92 Cepas ales tradicionales: floculación

93 Cepas ales tradicionales: sedimentación

94 Floculación y sedimentación Floculación Comportamiento "top cropping" Sedimentación Safale TM S Rápida Safale TM K Lenta Safale TM US-05 +/- +/- Media Safbrew TM WB Lenta Safbrew TM S Media Safbrew TM T Media Safbrew TM BE Rápida Saflager TM S Rápida Saflager TM S Rápida Saflager TM W 34/ Rápida