DISEÑO, SÍNTESIS Y ESTRUCTURA DE DOMINIOS HELICOIDALES INFLUENCIA DE LA INTRODUCCIÓN DE AMINOÁCIDOS D

Transcripción

1 DISEÑ, SÍNTESIS Y ESTRUCTURA DE DMINIS ELICIDALES. INFLUENCIA DE LA INTRDUCCIÓN DE AMINÁCIDS D Carmen Giovana Granados Ramírez U UNIVERSITAT DE BARCELNA B 2007

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3 Tesis Doctoral DISEÑ, SÍNTESIS Y ESTRUCTURA DE DMINIS ELICIDALES INFLUENCIA DE LA INTRDUCCIÓN DE AMINÁCIDS D Carmen Giovana Granados Ramírez Departamento de Química rgánica Facultad de Química Universidad de Barcelona Barcelona, 2007

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5 Memoria presentada por Carmen Giovana Granados Ramírez Para optar al grado de Doctor por la Universidad de Barcelona Programa de doctorado: Química rgánica Bienio: Dirigida por: Dr. Ernest Giralt Lledó Dr. Francesc Rabanal Anglada

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7 Agradecimientos En esta página me gustaría agradecer a todas las personas que de una u otra forma me inspiraron y ayudaron en la realización de este trabajo, que aun cuando no sean nombradas tendrán por siempre mi reconocimiento y agradecimiento. En primer lugar, les agradezco a los directores de tesis, a Ernest Giralt, por el apoyo que siempre me ha ofrecido desde la madrugada de enero en la que llegué a Barcelona, y a Francesc Rabanal por sus consejos y críticas que me han ayudado a encontrar otros caminos. A Elmostafa Bahraoui por sus disertaciones claras y amenas acerca de la biología del VI. A Fabrice Gaston, por su valiosa colaboración en el proyecto de VI. A Natalia Carulla y Marga Gairí por su ayuda y discusiones alrededor de la RMN. A Sergio Madurga por las interesantes controversias acerca del modelaje molecular de péptidos. A Alberto Adeva, siempre listo a resolver mis dudas con el sintetizador. A Lia y Marta por compartir sin egoísmo su conocimiento sobre los caprichos de la espectrometría de masas. A Jaume y Ricard por su apoyo con la resonancia de plasmon superficial. A Eva Poca con su mirada siempre compresiva, su disposición para ayudar, sin sus gestiones el laboratorio no sería el mismo. A todos los compañeros del laboratorio por su inestimable ayuda en todo momento. A los que están o han estado en el laboratorio de 300, a los del laboratorio de 100, a los de UQC, a los de del laboratorio de pharmamar : Albert, Angela, Birgit, Carles, Delia, Dolors, Edu, Eli, Fayna, Jan, Jesús, Jimena, Laia, Leti, Lorena, Natxo, Nessim, Martas, Marcelo, Miriam, scar, Pili, Rosa, Roger, Silvia, Susana, Tere, Yesica, por su calidez humana y los buenos momentos que hemos compartido dentro y fuera del PCB. En especial, a Martina compañera de piso, de laboratorio y amiga, por sopórtame lo cual no debe ser nada fácil, y a su lado Marc con su constante buen animo. Un agradecimiento eterno a todas las personas que en los primeros años de mi desarrollo profesional me influyeron y despertaron en mí el interés por los péptidos. Debo recordar mis comienzos en síntesis en fase sólida en el Instituto de Inmunología de Colombia, los buenos momentos, las hazañas y las aventuras de aquellos tiempos en que trabajé con el grupo de síntesis de péptidos, el jefe Manuel E. Patarroyo y las jefazas, Zuly Rivera y Fanny Guzmán. Por supuesto, agradezco a mi familia el apoyo brindado en TD momento, que me ha llevado a concebir sueños y a trazar metas. GIVANA

8 Un instante más y Alicia había pasado a través del espejo y saltaba con ligereza dentro del cuarto del espejo. Lo primero que hizo fue ver si había un fuego encendido en su chimenea y con gran satisfacción comprobó que, efectivamente, había allí uno, ardiendo tan brillantemente como el que había dejado tras de sí Entonces empezó a mirar atentamente a su alrededor y se percató de que todo lo que podía verse desde el antiguo salón era bastante corriente y de poco interés, pero que todo lo demás era sumamente distinto Lewis Carroll. En: Al otro lado del espejo Progress in scientific research rarely follows a straight path. Generally, it entails many unexpected meanderings, with a mix of good and bad ideas, good and bad luck. Robert C. Gallo and Luc Montagnier, M.D. En: The Discovery of IV as the Cause of AIDS N. Engl. J. Med. 2003, 349,

9 Abreviaturas

10 ii Abreviaturas

11 Abreviaturas ABREVIATURAS A ACN Acetonitrilo B Boc tert-butoxicarbonilo Bom Benciloximetilo 2-Br-Z 2-Bromobenciloxicarbonilo Bzl Bencilo C C34 Péptido de 34 residuos de la región C- terminal de la gp41 de VI-1 ( ) CCA* Ácido -ciano-4-hidroxicinámico cx Ciclohexilo 2-Cl-Z 2-clorobenciloxicarbonilo D DCM Diclorometano DIEA Diisopropiletilamina DIC N,N -diisopropilcarbodiimida DMAP N,N-dimetil-4-aminopiridina DMF Dimetilformamida DQF-CSY* Espectroscopia de correlación con filtro de doble cuanto DSS Ácido 2,2-dimetil-2-silapentano-5- sulfonico DTT Ditiotreitol E EDC 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)- carbodiimida EDTA* Acido etilendiaminotetraacético eq equivalentes ESI* Ionización por electro-spray Et 2 Éter dietílico EP surfactante P20 F Fc Fragmento cristalizable de inmunoglobulina G BSA Albúmina sérica bovina FMC 9-fluorenilmetoxicarbonilo FITC Isotiocianato de fluoresceína For Formilo G gp41 Glicoproteína 41 de VI-1 gp120 Glicoproteína 120 de VI-1 1 élice 1 2 élice Péptido que incluye la región de las hélices 1 y 2 del dominio B 3a Péptido con la secuencia aleatoria de 3n del dominio B (control negativo) 3n élice 3 natural del dominio B 3x élice 3 y análogos BS Solución tampón de EPES EPES* Ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1- etanosulfonico Bt 1-hidroxibenzotriazol MFS Ácido N-[(9-hidroximetil)-2- fluorenil]succinámico PLC* Cromatografía líquida de alta resolución PLC-MS Cromatografía líquida de alta resolución acoplada a un detector de espectrometría de masas iii

12 Abreviaturas I IgG Inmunoglobulina G K k as Constante de asociación / M -1 s -1 K A Constante de afinidad (asociación)/m -1 k dis Constante de disociación / s -1 K D Constante de afinidad (disociación) /M k s Constante global /M -1 s -1 M MALDI-TF* Ionización asistida por una matriz por desorbción con láser y análisis por tiempo de vuelo Me Metanol MS* Espectrometría de masas MS/MS* Espectrometría de masas en modo tándem P20 Surfactante P20 PDEA 2-(2-piridinilditio)etanoamina ppm Partes por millon PEGA* Copolimero de bisacrilamidopolietilenglico, N,Ndimetilacrilamida y monoacrilamino polietilenglicol R Rink Ácido p-[(r,s)-a-[1-(9-fluoren-9-il)- metoxiformamido]-2,4-dimetoxibencill]- fenoxiacético RMN Resonancia magnética nuclear RP* Fase reversa RPS Resonancia de plasmon superficial RU* Unidades de respuesta de resonancia de plasmon superficial iv N N36 Péptido de 36 residuos de la región N- terminal de la gp41 de VI-1 ( ) ND No determinado NESY* Espectroscopia de efecto nuclear verhauser NS N-hidroxisucinimida NMP N-metilpirrolidona MBA p-metilbenzhidrilamina 0 BC* Un compuesto por unidad de resina (ne Bead ne Compound) P Pbf 2,2,4,6,7-pentametildihidrobenzofurano-5- sulfonilo 3FANK Análogo de 3 [Phe 44,Lys 47 ] 3FANV Análogo de 3 [Phe 44,Val 47 ] S SDS Dodecilsulfato de sodio T TBME Tert-butilmetil éter TBTU* Tetrafluoroborato de -(benzotriazol-1- il)-tetrametiluronio tbu tert-butilo TFA* Ácido trifluoroacético TFE 2,2,2-trifluoroetanol TFMSA Ácido trifluorometansulfónico TIS Triisopropilsilano Tos Tosilo TCSY* Espectroscopia de correlación escalar total Trt Tritilo V VI-1 Virus de inmunodeficiencia humana

13 Abreviaturas tipo1 desplazamiento químico Desviación del desplazamiento químico Elipticidad Elipticidad Molar * Iniciales en ingles v

14 vi Abreviaturas

15 Anexos

16 viii Anexos

17 Anexos AMINÁCIDS (AA) L-Alanina Ala A 2 N C 3 2 N L-Leucina Leu L N N 2 N 2 N 2 N L-Arginina Arg R L-Lisina Lys K 2 N S C 3 2 N L-Asparagina Asn N N 2 2 N L-Metionina Met M 2 N L-Ácido aspártico Asp D L-Prolina Pro P N 2 N L-Ácido glutámico Glu E L-Serina Ser S 2 N S 2 N L-Cisteína Cys C 2 N L-Fenilalanina Phe F 2 N N 2 Glicina Gly G 2 N L-Glutamina Gln Q Las abreviaturas de los AA siguen la regla de la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC-IUB: J. Biol. Chem., 1981, 256, y Eur. J. Biochem., 1984, 138, Letras minúsculas serán usadas para diferenciar a los aminoácidos D en el código de una letra. ix

18 Anexos 2 N L-istidina is N N L-Treonina Thr T 3 C 2 N L-Isoleucina Ile I 2 N 2 N L-Tirosina Tyr Y L-Triptófano Trp W 2 N N L-Valina Val V 2 N x

19 Anexos GRUPS PRTECTRES Estructura Nombre Abreviatura Bencilo Bn -benciloximetilo Bom Br 2-bromobenciloxicarbonilo BrZ N tert-butoxicarbonilo Boc tert-butil tbu Ciclohexil cex Cl N 2-clorobenciloxicarbonilo ClZ N 9-fluorenilmetoxicarbonilo Fmoc S 2,2,5,7,8-Pentametildihidrobenzofurano-5-sulfonilo Pbf Tritilo Trt S Tosilo Tos xi

20 Anexos ADITIVS Y AGENTES DE ACPLAMIENT DIC N C N N DMAP N Bt N N N TBTU N N N N + - N + BF 4 - SPRTES SÓLIDS Y ESPACIADRES BIFUNCINALES Poliestireno Resina MBA 2 N Resina Rink amida MBA N Fmoc Nle N Poliestireno N Fmoc Espaciador Rink Espaciador MFS N xii

21 Anexos SECUENCIAS b Gp41 VI-1 c Péptido C34L C34L* C34D C34D* RC34L(Retro-C34) RC34D (Retroentantio-C34) M1 C34L M1 C34D M2 C34 M3 C34 N36 Glioxilil-N36 *Grupo amino terminal libre Secuencia Ac-WMEWDREINNYTSLISLIEESQNQQEKNEQELL-N2 WMEWDREINNYTSLISLIEESQNQQEKNEQELL-N2 Ac-wmewdreinnytslihslieesqnqqekneqell-N2 wmewdreinnytslihslieesqnqqekneqell-n2 Ac-LLEQENKEQQNQSEEILSILSTYNNIERDWEMW-N2 Ac-lleqenkeqqnqseeilshilstynnierdwemw-N2 Ac-WEDMWRNNVTEYLSSILEVEQQSNKQEEQENLL-N2 Ac-wedmwrnnvteylssilehveqqsnkqeeqenll-N2 Ac-WMEWDREINNYTSLISLIEESQNQQeKNEkELL-N2 Ac-WeEWDRKINNYTSLISLIEESQNQQeKNEkELL-N2 Ac-SGIVQQQNNLLRAIEAQQLLQLTVWGIKQLQARIL-N2 CC-GIVQQQNNLLRAIEAQQLLQLTVWGIKQLQARIL-N2 Péptidos derivados del dominio B la proteína A de Staphyloccus aureus d Péptido Secuencia 3n 3a 1D 2D 3D 4D 5D 6D Ac-DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK-N2 Ac-AQKQASPDALEKNLPKADNASL-N2 Ac-dpsqlnawkeawkknkadqapk-N2 Ac-dpsqknawkeaakkwkadqapk-N2 Ac-dpsqknawkeaskknkadqapk-N2 Ac-dpsqknalkeawkknkadqapk-N2 Ac-dpsqknalteawkkwkadqapk-N2 Ac-dpsqknawkeawkknkadqapk-N2 1-2 Ac-APKADNKFNKEQQNAFYEILLPNLNEEQRNGFIQSLKD-N2 b Las letras minúsculas se utilizaron para diferenciar los aminoácidos D de los aminoácidos L c VI-1, Grupo M, subtipo B, aislado Lai (IIIB) d Secuencia común en las cepas J9, CL, Newman, MRSA252, MW2, NCTC 8325, Cowan 1 (NCTC 8530) xiii

22 Anexos Péptidos derivados del dominio B de la proteína A de Staphyloccus aureus Péptido Secuencia 3n 3FANK 3FANV 3a Ac-D 40 PSQS 44 ANL 47 LAEAKKLNDAQAPK 61 -N2 Ac-D 40 PSQF 44 ANK 47 LAEAKKLNDAQAPK 61 -N2 Ac-D 40 PSQF 44 ANV 47 LAEAKKLNDAQAPK 61 -N2 Ac-A 40 QKQA 44 SPD 47 ALEKNLPKADNASL 61 -N2 1-2 Ac-A 1 PKADNKFNKEQQNAFYEILLPNLNEEQRNGFIQSLKD 39 -N2 CAhx1-2 Proteína Dominio B Dominio FANK Dominio FANV Ac-CAhxA 1 PKADNKFNKEQQNAFYEILLPNLNEEQRNGFIQSLKD 39 -N2 Secuencia Ac-A 1 PKADNKFNKEQQNAFYEILLPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQS 44 ANL 47 LAEAKKLNDAQAPK 61 -N2 Ac-A 1 PKADNKFNKEQQNAFYEILLPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQF 44 ANK 47 LAEAKKLNDAQAPK 61 -N2 Ac-A 1 PKADNKFNKEQQNAFYEILLPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQF 44 ANV 47 LAEAKKLNDAQAPK 61 -N2 xiv

23 Índice

24 xvi Índice

25 Índice Índice INTRDUCCIÓN Y BJETIVS Página Introducción 3 bjetivos 6 Bibliografía 7 1. CAPÍTUL 1 11 Diseño, síntesis y caracterización de inhibidores de la fusión de VI-1 análogos del péptido C34 de gp41con aminoácidos D 1.1. Introducción Tipos de medicamentos anti-vi Inhibidores de la transcriptasa inversa Inhibidores de la integrasa Inhibidores de la proteasa viral Inhibidores de la entrada del virus Inhibidores de fusión Combinación de medicamentos Entrada y fusión del virus Inhibición de la entrada y fusión del virus Péptidos que inhiben la fusión bjetivos Diseño de péptidos análogos de C34 con substituciones parciales por 24 aminoácidos D Síntesis y purificación de C34 y análogos Síntesis y purificación de N Ensayos de Inhibición de la fusión Ensayo de Inhibición de la replicación de VI Ensayo de Inhibición de formación de sincitios Determinación de la solubilidad de C34L, C34L*, M 2 C34 y M 3 C Análisis conformacional de los péptidos por dicroísmo circular Dicroísmo circular Curvas de fusión Degradación enzimática con tripsina Unión entre N36 y los péptidos análogos de C34 por resonancia de 50 plasmon superficial Inmovilización de N Interacción entre N36 y los péptidos análogos de C Conclusiones 54 Bibliografía CAPÍTUL 2 63 Identificación de complejos heteroquirales entre péptidos todo-d y el fragmento N-terminal del dominio de B de la proteína A de Staphyloccus aureus 2.1. Introducción Dominio B de la proteína A de Staphylococcus aureus Química combinatoria. Químiotecas BC bjetivos 69 xvii

26 Índice 2.2. Diseño de la químioteca D Síntesis y caracterización de la quimioteca D Síntesis de la químioteca D Caracterización de la químioteca Identificación de subproductos de la síntesis Eliminación de los subproductos de la síntesis Degradación de Edman de unidades de peptidil resina Caracterización en conjunto de la químioteca D Evaluación de la quimioteca Determinación de la secuencia de los péptidos activos por 85 espectrometría de masas en tándem MALDI-TF 2.6. Síntesis de los péptidos Análisis conformacional por dicroísmo circular Estudios de unión entre 1-2 y los péptidos todo-d por resonancia de 91 plasmon superficial 2.9. Conclusiones 97 Bibliografía CAPÍTUL Síntesis, caracterización estructural y evaluación de la interacción con inmunoglobulina G de nuevos análogos del dominio B de la proteína A de Staphylococcus aureus 3.1. Introducción Síntesis de los péptidos 3n, 3a, 3FANK, 3FANV y Síntesis del dominio natural y sus dominios análogos Síntesis por química Boc del dominio B natural Síntesis por química Fmoc del dominio B natural Síntesis del los dominios análogos Dominios no covalentes Análisis conformacional por dicroísmo circular Estudios de interacción por resonancia de plasmon superficial Interacción entre 1-2 y los péptidos Interacción de los complejos 1-2 /péptido con IgG Dominios natural y análogos Análisis conformacional por dicroísmo circular Resonancia de plasmon superficial Unión de IgG al dominio B y análogos Unión de Fc humano al dominio B y análogos Determinación de la estructura secundaria de los dominios por 131 resonancia magnética nuclear Estudio por RMN del dominio B Asignación de los espectros de los dominios B, FANV y FANK Desviación del desplazamiento químico Intercambio hidrógeno/deuterio Conclusiones 146 Bibliografía CNCLUSINES 155 xviii 5. MATERIALES Y EQUIPS Generales Reactivos y disolventes Resinas y amino ácidos protegidos: Derivados de aminoácidos para síntesis Boc 159

27 Índice Derivados de aminoácidos para síntesis Fmoc Disolventes Reactivos Instrumentación general PRCEDIMIENTS EXPERIMENTALES Métodos analíticos Ensayo de ninhidrina cualitativa Ensayo cualitativo para la detección de alcoholes Ensayo cualitativo de cloranilo para la detección de aminas secundarias idrólisis y análisis de aminoácidos idrólisis Análisis por PLC del hidrolizado Síntesis automática de los péptidos por la estrategia Fmoc Reducción de la funcionalización de la resina Incorporación automática de los aminoácidos Acetilación del grupo amino terminal Desprotección de las cadenas laterales y liberación del péptido Síntesis automática de los péptidos por la estrategia Boc/Bzl Incorporación automática de los aminoácidos Desprotección de las cadenas laterales y liberación del péptido Cromatografía Cromatografía líquida de alta resolución analítica PLC-MS analítico PLC semipreparativo Espectrometría de masas MALDI-TF Procedimientos experimentales del capítulo Síntesis de los péptidos Ensayos de Inhibición de la fusión Ensayo de Inhibición de la replicación de VI Ensayo de Inhibición de formación de sincitios Dicroísmo circular de los péptido y los complejos no covalentes Digestión con tripsina de los péptidos C34, M 2 C34, M 3 C Determinación de la solubilidad en agua de los péptidos Resonancia de plasmon superficial Generalidades Interacción entre N36 y los péptidos Procedimientos experimentales del capítulo Síntesis de la quimioteca Cálculos previos a la síntesis de la quimioteca "one-bead-one-compound" 186 (BC) Acondicionamiento de resina y reducción de la funcionalización Incorporación del espaciador bifuncional MFS Acoplamiento del primer aminoácido Desprotección de grupo Boc Incorporación de los aminoácidos Desprotección de las cadenas laterales Liberación del péptido de la resina Secuenciación de péptidos por degradación de Edman Identificación de los péptidos de la quimioteca afines a Espectros de masas MALDI TF/TF de los iones precursores de los 194 péptidos todo-d activos de la quimioteca y asignación de las señales Síntesis de los péptidos: Procedimientos experimentales del capítulo Síntesis de los péptidos 3n, 3a, 3FANV, 3FANK y xix

28 Índice Síntesis de los dominios covalentes Dicroísmo circular de los complejos no covalentes Dicroísmo circular de de el dominio B y análogos Resonancia magnética nuclear de el dominio B y análogos Asignación Intercambio idrogeno/deuterio Resonancia de plasmon superficial Generalidades Interacción de los péptidos con Interacción de los complejos péptido/ 1-2 con IgG Interacción del dominio B y análogos con IgG Interacción del fragmento Fc con el dominio B y análogos 217 Bibliografía 217 xx