PRÁCTICAS ABD: Alumnos convocados el día 23 de Febrero de 2009

Transcripción

1 PRÁCTICAS ABD: Alumnos convocados el día 23 de Febrero de 2009 Para realizar las prácticas deben: -Estar matriculados. -Haber presentado ficha al profesor de la asignatura o en su defecto presentarla en el momento de iniciarse la primera práctica. -Traer todos los días, desde el primer día de prácticas, la Guía Práctica de Parasitología de venta en la fotocopiadora. Si usted la tiene por haber realizado las prácticas de Parasitología de segundo curso, puede utilizar la misma. -Traer, todos los días de prácticas, bata de laboratorio blanca. -El día del examen de prácticas (el viernes 27) deben presentarse al mismo con la Guía que deberá ser supervisada por el profesor. En este archivo se encuentra la planificación de las prácticas. Es muy recomendable que lo lean antes del primer día de prácticas. La primera práctica no se encuentra desarrollada en la Guía, pero sí en este archivo, por lo que deberá imprimirse y adjuntarse a la Guía. PRÁCTICA 1.- Análisis coprológico: Artefactos y digestión. No viene en cuaderno de prácticas. Descarga de la presentación en página web: Análisis: coprológico (leer págs de la Guía Práctica de Parasitología) Muestra: heces. Los restos macroscópicos y microscópicos que vamos a encontrar en las heces dependen de lo que se haya ingerido (accidental o voluntariamente) y de la actividad digestiva del paciente (productos generados por el propio organismo). En ocasiones los hallazgos están relacionados con situaciones patológicas. Aunque estos restos pueden ser de forma, tamaño y naturaleza muy variada, vamos a observar los más comunes de tamaño microscópico. a) Residuos de origen vegetal a. Pelos o tricomas. Semejan larvas de nematodos. Se observa su morfología para diferenciarlos de las larvas. En los pelos no se observan estructuras como la boca o el digestivo. Los pelos son refringentes. Si tienen un ensanchamiento en uno de sus extremos a modo de bulbo, son pelos urticantes. b. Vasos o haces vasculares formados por vasos helicoidales, reticulados, laticíferos, i. Laticíferos. Helicoidales. Ver a más aumentos para no confundir, cuando son compactos, con cestodos. ii. Anillo aislado de vaso laticífero. Puede recordar un quiste de protozoo o un huevo de helminto. c. Células i. Pétreas: membrana endurecida, estratificada y con canalículos ramificados. Las células pétreas (o esclereidas) suelen aparecer en las duras capas exteriores de las semillas y frutos, así como en la corteza y regiones del periciclo de tallos leñosos. Se presentan aisladas o en grupos. ii. Lignificadas: cubierta con lignina. 1

2 iii. Amiláceas más o menos digeridas: contiene granos de almidón que con lugol (solución de yodo) toman un color que va del negro al azul, pasando por los violetas. A veces la cubierta celular impide el paso del lugol, por lo que el almidón no se tiñe. Otras veces la cubierta se rompe y se pueden ver los granos de almidón sueltos. iv. Los granos de almidón están formados por amilosa y amilopectina. La primera reacciona con el yodo dando un color azul intenso. Cuando la amilasa pancreática va degradando la amilosa, forma dextrinas de distintos pesos moleculares, siendo la reacción con el yodo menos intensa, dando así colores más suaves (rojos, rosados, amarillos) hasta llegar a los tonos pálidos de la acrodextrina. d. Pólenes i. Ciprés ii. Pino iii. Olivo b) Residuos de origen animal a. Fibras musculares más o menos digeridas i. Si están, en general, poco digeridas (se observan estrías) es signo de tránsito intestinal rápido (patológico o fisiológico- mucha fibra-) o insuficiente producción de jugos digestivos. b. Grasas (posible presencia de grasa vegetal) i. Si hay mucha grasa (esteatorrea) puede ser signo de una giardiasis. La grasa se presenta en gotitas esféricas (salvo que las heces estén frías, entonces en masas amorfas). Se tiñen de naranja a rojo con Sudán III. c) Otros residuos a. Cristales i. Charcot-Leyden: proceden de la destrucción de los eosinófilos, por lo que su presencia está asociada a alergias y/o helmintiasis. ii. Oxalato cálcico: proceden generalmente de la savia o de determinadas células de las plantas. Puede cristalizar en diversas formas, la más frecuente es la bipirámide tetragonal. iii. Ácidos grasos. Proceden de la digestión de las grasas. cuando hay déficit de sales biliares, cristalizan generalmente en largas agujas. d) Burbujas de aire a. Esféricas. Incoloras. Contorno negro a refringente al mover el enfoque con el micrométrico. Tamaño extraordinariamente variable. Artefactos procedentes de la ingestión: Pelos vegetales o tricomas Vasos o haces vasculares de origen vegetal Anillo de vaso vegetal Posible confusión con: Larvas de nematodos Cestodos 2

3 Células vegetales, sobre todo amiláceas Gránulos de almidón Pólenes Fibras de plátano Esporas de hongos Gotas de grasa Cestodos PRÁCTICA 2.- Técnicas en coprología parasitaria. Técnicas de concentración de quistes de protozoos y huevos de helmintos por métodos físicos: flotación, flotación-centrifugación y centrifugación. Observación de huevos y larvas de helmintos en muestras biológicas. a. Técnicas en coprología parasitaria. Fundamento y protocolo de la técnica descrita en la Guía práctica de Parasitología, págs Método de concentración por flotación Previamente hemos homogenizado la muestra de heces en solución salina y el homogenizado lo filtramos para eliminar los elementos groseros. Ahora seguimos la técnica desde el punto Poner 1 ml del filtrado en un tubo de ensayo, añadir 1 ml de solución saturada de ClNa y volver a homogeneizar. 4.- Completar el tubo de ensayo con la solución saturado de ClNa, hasta que se forme un menisco convexo en la superficie. 5.- Colocar un portaobjetos desengrasado en contacto con el menisco. 6.- A los min retirar el portaobjetos rápidamente, taparlo con un cubreobjetos. 7.- Observar al microscopio (ver Figura 1 en la pág. 108 de la Guía). Técnica de concentración por centrifugación de Telemann Previamente hemos homogenizado la muestra de heces en solución salina y el homogenizado lo filtramos para eliminar los elementos groseros. Ahora seguimos la técnica desde el punto En un tubo de centrífuga se coloca 1 ml del filtrado de la muestra fecal y se le añade igual volumen de éter etílico. 4.- Tapar el tubo con un tapón de goma. Agitar varias veces, destapando de vez en cuando para eliminar los gases del éter. Cuidado con el éter y sus gases, son muy inflamables! 5.- Centrifugar durante 10 min a 1500 rpm. 6.- En el tubo se separan dos capas, una acuosa y otra etérea, y entre ellas existe un anillo (ver Figura 2 en la pág. 109 de la Guía). 7.- Mediante una fina varilla, se despega el anillo de las paredes del tubo y se decanta rápidamente el sobrenadante. 3

4 8.- El botón se diluye con el líquido que resbala por las paredes del tubo y se toma con la pipeta para colocar dos muestras del mismo, una con lugol y otra sin lugol, entre portaobjetos y cubreobjetos. 9.- Observar al microscopio (ver Figura 1 en la pág. 108 de la Guía). b) Observación de formas parasitarias de helmintos: b. Larvas i. Strongyloides stercoralis, larva en heces. ii. Dirofilaria inmitis, microfilaria en sangre. c. Huevos: i. Schistosoma mansoni, en heces. ii. Schistosoma japonicum, en heces. iii. Schistosoma haematobium, en muestras de orina. iv. Clonorchis sinensis, en heces. v. Trichuris trichiura, en heces. vi. Enterobius vermicularis: método de Graham (pág. 110 de la Guía). PRÁCTICA 3.- a) Técnicas de diagnóstico inmunológico: inmunofluorescencia indirecta para el diagnóstico de Leishmania. Fundamento y protocolo de la técnica descrita en la Guía práctica de Parasitología, págs INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA 1. Resuspender el antígeno particulado del parásito que se quiere diagnosticar y distribuirlo adecuada y uniformemente en todos los pocillos del portaobjetos. Secarlo al aire. 2. Una vez seco el porta, fijar el antígeno en un baño de acetona durante 10 min. Luego, sacar el porta y secarlo al aire. 3. Para llevar a cabo la prueba, colocar sobre un pocillo del porta una gota del suero problema (anticuerpos anti-parásito, si hay) previamente diluido en tampón de fosfatos salino (PBS) ph 7,2 hasta obtener la primera dilución significativa para la prueba diagnóstica ensayada 1/40. En pocillos consecutivos se colocan diluciones dobles seriadas del suero problema realizadas con PBS (una gota en cada pocillo). Todo ello se incuba 30 min a 37ºC en atmósfera húmeda (no debe secarse el suero). 4. Seguidamente, se procede a realizar dos lavados consecutivos de 5 min cada uno en tampón PBS. Secar al aire tras el segundo lavado. 5. A cada pocillo se añade una gota de conjugado fluorescente (anticuerpos anti-ig humana marcada con un fluorocromo, en este caso la fluoresceína) a la dilución de trabajo, que lleva incluido el colorante de contraste (azul de Evans). Incubar 30 min a 37ºC en atmósfera húmeda (no debe secarse el conjugado). 6. Seguidamente, se procede a realizar dos lavados consecutivos de 5 min cada uno en tampón PBS. Secar al aire tras el segundo lavado. 7. Montar la preparación con glicerina tamponada a ph 7,2 (9 glicerina: 1 PBS). 4

5 8. Observación al microscopio de fluorescencia. Verde: positivo; rojo: negativo. La última dilución en la que se observa fluorescencia corresponde al título del suero. Deben realizarse controles de los reactivos empleados en el ensayo: 1. A) Control del conjugado: en lugar de suero problema se añade una gota de PBS en un pocillo. 2. B) Control negativo: en lugar de suero problema se añade, en un pocillo, una gota de un suero negativo contrastado. 3. C) Control positivo: en lugar de suero problema se añade, en un pocillo, una gota de un suero positivo de título conocido. Control del conjugado Control Control + Suero problema Suero problema IFI 1ª dilución 2ª dilución b) Observación de artrópodos parásitos: d. Insectos: i. Pediculus humanus, adultos. ii. Phthirus pubis, adultos. e. Ácaros: i. Sarcoptes scabiei, adultos. ii. Demodex folliculorum, adultos. PRÁCTICA 4.- Técnicas para el examen de protozoos. a) Intestinales: en fresco y tinción con lugol (ver pág. 107 de la Guía) a. Entamoeba coli, quiste. b. Giardia lamblia, quiste y trofozoíto. b) Sanguíneos y tisulares (ver págs. 128 y 129 de la Guía) a. Frotis y tinción Giemsa. i. Leishmania infantum, promastigotes. b. Observación de preparaciones permanentes previamente teñidas con Giemsa. i. Trypanosoma cruzi, tripomastigotes. ii. Trypanosoma brucei, tripomastigotes. iii. Leishmania, amastigotes. iv. Trichomonas vaginalis. 5

6 PRÁCTICA 5.- Examen Se les dará una muestra biológica (sangre y/o heces) y deberán procesarla (empleando alguna de las técnicas ensayadas en los días anteriores de prácticas) para realizar el diagnóstico. Todas las muestras presentarán algún parásito de entre los observados en estas prácticas. Además, se tendrán que identificar los parásitos en dos preparaciones adicionales. Así mismo, en cualquiera de las tres preparaciones (muestra y preparaciones adicionales) deberá reconocerse un artefacto. En cada caso hay que indicar en el folio que se les dará: -El tipo de muestra y, describiendo el procesamiento seguido, determinar el parásito, indicando su nombre científico, fase del ciclo de vida en que se encuentra y grupo taxonómico al que pertenece (nivel: Phylum-Clase-Subclase). -Igual procedimiento de denominación del parásito se seguirá en el caso de las dos preparaciones adicionales, donde deberá indicarse el número de cada preparación. -Asimismo se mencionará el artefacto observado, indicando el número de su preparación. 6