Análisis calorimétrico como alternativa en el diagnóstico de fibrosis hepática
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- José Manuel Lozano Santos
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1 Análisis calorimétrico como alternativa en el diagnóstico de fibrosis hepática Dr. Galileo Escobedo Investigador en Ciencias Médicas D Unidad de Medicina Experimental Hospital General de México Septiembre de 2011
2 Hígado normal (10X) Hígado 1-3 Plasma 4,5 Sujetos sanos 5-7% de proteínas de matriz extracelular (PME) (colágeno I, III y IV, laminina, fibronectina, elastina, ácido hialurónico, condroitin sulfato, heparán sulfato) Fosfatasa ácida, ALT, AST, GGT, albúmina, α-fetoproteína, apolipoproteína A1, proteínas del complemento, fibrinógeno, haptoglobina, IGF-1, mioglobina, factores de coagulación, insulina, antitrombina III, pancreastatina. 1 Gressner AM, Eur J Clin Chem Clin Biochem. 29: Rojkind M, Fibrogenesis in The Liver: Biology and Pathobiology. Raven Press. NY. pp Burgerson and Olsen, Curr Opinion Cell Biol. 2: Skovgard-Veidal S et al., Dis Markers. 28: Anderson NL, Clin Chem. 56:
3 Hígado normal (10X) Hígado con fibrosis (10X) Hígado 1-3 Plasma 4,5 Sujetos sanos 5-7% de proteínas de matriz extracelular (PME) (colágeno I, III y IV, laminina, fibronectina, elastina, ácido hialurónico, condroitin sulfato, heparán sulfato) Fosfatasa ácida, ALT, AST, GGT, albúmina, α-fetoproteína, apolipoproteína A1, proteínas del complemento, fibrinógeno, haptoglobina, IGF-1, mioglobina, factores de coagulación, insulina, antitrombina III, pancreastatina. Pacientes con fibrosis hepática 20-40% de PME (colágeno I, III, IV y VI, laminina, fibronectina, elastina, ácido hialurónico, condroitin sulfato, heparán sulfato, entactina, undulina, dermatan sulfato) ALT, AST, GGT, albúmina, haptoglobina, apolipoproteína A1, IGF- 1, factores de coagulación, bilirrubina, ácido hialurónico, MMP1, MMP9, TIMP1, laminina, colágeno IV and VI, procolágeno III, propéptido procolágeno C-terminal. 1 Gressner AM, Eur J Clin Chem Clin Biochem. 29: Rojkind M, Fibrogenesis in The Liver: Biology and Pathobiology. Raven Press. NY. pp Burgerson and Olsen, Curr Opinion Cell Biol. 2: Skovgard-Veidal S et al., Dis Markers. 28: Anderson NL, Clin Chem. 56:
4 Hígado normal (10X) Hígado con fibrosis (10X) Hígado 1-3 Plasma 4,5 Sujetos sanos 5-7% de proteínas de matriz extracelular (PME) (colágeno I, III y IV, laminina, fibronectina, elastina, ácido hialurónico, condroitin sulfato, heparán sulfato) Fosfatasa ácida, ALT, AST, GGT, albúmina, α-fetoproteína, apolipoproteína A1, proteínas del complemento, fibrinógeno, haptoglobina, IGF-1, mioglobina, factores de coagulación, insulina, antitrombina III, pancreastatina. Pacientes con fibrosis hepática 20-40% de PME (colágeno I, III, IV y VI, laminina, fibronectina, elastina, ácido hialurónico, condroitin sulfato, heparán sulfato, entactina, undulina, dermatan sulfato) ALT, AST, GGT, albúmina, haptoglobina, apolipoproteína A1, IGF- 1, factores de coagulación, bilirrubina, ácido hialurónico, MMP1, MMP9, TIMP1, laminina, colágeno IV and VI, procolágeno III, propéptido procolágeno C-terminal. 1 Gressner AM, Eur J Clin Chem Clin Biochem. 29: Rojkind M, Fibrogenesis in The Liver: Biology and Pathobiology. Raven Press. NY. pp Burgerson and Olsen, Curr Opinion Cell Biol. 2: Skovgard-Veidal S et al., Dis Markers. 28: Anderson NL, Clin Chem. 56:
5 Hígado normal (10X) Hígado con fibrosis (10X) Hígado 1-3 Plasma 4,5 Sujetos sanos 5-7% de proteínas de matriz extracelular (PME) (colágeno I, III y IV, laminina, fibronectina, elastina, ácido hialurónico, condroitin sulfato, heparán sulfato) Fosfatasa ácida, ALT, AST, GGT, albúmina, α-fetoproteína, apolipoproteína A1, proteínas del complemento, fibrinógeno, haptoglobina, IGF-1, mioglobina, factores de coagulación, insulina, antitrombina III, pancreastatina. Pacientes con fibrosis hepática 20-40% de PME (colágeno I, III, IV y VI, laminina, fibronectina, elastina, ácido hialurónico, condroitin sulfato, heparán sulfato, entactina, undulina, dermatan sulfato) ALT, AST, GGT, albúmina, haptoglobina, apolipoproteína A1, IGF- 1, factores de coagulación, bilirrubina, ácido hialurónico, MMP1, MMP9, TIMP1, laminina, colágeno IV and VI, procolágeno III, propéptido procolágeno C-terminal. 1 Gressner AM, Eur J Clin Chem Clin Biochem. 29: Rojkind M, Fibrogenesis in The Liver: Biology and Pathobiology. Raven Press. NY. pp Burgerson and Olsen, Curr Opinion Cell Biol. 2: Skovgard-Veidal S et al., Dis Markers. 28: Anderson NL, Clin Chem. 56:
6 Conclusión #1: La fibrosis hepática lleva a cambios composicionales tanto a nivel local (hígado) como a nivel sistémico (plasma).
7 La calorimetría es una técnica de análisis fisicoquímico capaz de determinar variaciones composicionales en un compuesto particular, con base en sus valores de capacidad calorífica, flujo de calor y temperaturas de transición 3,4. Capacid ad calorífic a Flujo de calor Temperat ura de transición 1 Jelesarov and Bosshard, Journal of molecular recognition. 12: Dean JA, The analytical chemistry handbook. New York, McGraw Hill, Inc. pp Liang Y et al., European Journal of Biochemistry. 268: Grinberg VY et al., Journal of biotechnology. 79:
8 La capacidad calorífica es la cantidad de calor requerido para modificar la temperatura de un compuesto en una cantidad determinada. El flujo de calor es la cantidad de energía térmica transferida de los alrededores al compuesto. La temperatura de transición o de transición de fase es la temperatura a la que el compuesto cambia de un estado fisicoquímico a otro 1. Estas propiedades térmicas varían dependiendo de la composición molecular del compuesto. 1 Dean JA, The analytical chemistry handbook. New York, McGraw Hill, Inc. pp
9 Conclusión #2: La calorimetría es capaz de determinar cambios en la composición de un material.
10 Tomando en cuenta que: 1. Es necesario diseñar métodos de diagnóstico enfocados en determinar los estadios inicial (F1) e intermedio (F2) de la fibrosis hepática. 2. La fibrosis hepática lleva a cambios composicionales en el hígado y en el plasma. 3. La calorimetría es capaz de determinar variaciones en la composición de cualquier material. Hipótesis A nivel plasmático y hepático, la capacidad calorífica, el flujo de calor y la temperatura de transición son significativamente distintos entre sujetos sanos y sujetos con distintos grados de fibrosis hepática.
11 Metodología F1 1 mes F2 2.5 meses 20 mg/200 µl F3 5 meses Análisis calorimétrico Capacidad Calorífic Flujo de Calor Temp. de transición Vehículo = aceite de olivo, 2 ml/kg de peso CCl 4 = 2:5 v/v en aceite de olivo, 2 ml/kg de peso
12 Resultados preliminares F0 F1 F2 F3 * ** ** *P<0.05; **P<0.001
13 Resultados preliminares Plasma
14 Resultados preliminares Tejido hepático
15 Conclusiones El plasma de ratas sanas es calorimétricamente distinto al proveniente de ratas F2 (capacidad calorífica 3 veces mayor en F2 que en F0). La temperatura de transición en el tejido hepático sano ocurrió a los C, mientras que para el tejido F2 este cambio se observó a los 73, 77, 83 y 90 C. Para el tejido F3 se registraron cinco cambios de fase a los 67, 75, 80, 84 y 90 C. El grado de fibrosis parece ser proporcional al aumento en el número de transiciones de fase del tejido hepático. En términos de capacidad calorífica, el plasma de ratas con daño hepático moderado (F2) por administración de CCl 4 es distinto al proveniente de ratas con un nivel inicial de daño (F1). El tejido hepático F1 muestra dos transiciones de fase (90 y 95 C) mientras que el F0 muestra una (94 C). En términos calorimétricos, las muestras plasmáticas de ratas sanas y F1 son iguales.
16 La proteómica es una herramienta molecular útil en la separación, cuantificación e identificación de una proteína en particular o de un grupo de estas 1,2,3. Gel 1: Sujeto sano Propiedades Fisiopatológicas No. Proteína Regulación Gel 2: Cirrosis (NAFLD) 1 Apolipoproteína A1 Isoforma 1-2 Apolipoproteína A1 Isoforma 2-3 Apolipoproteína A1 Isoforma 3-4 Apolipoproteína A4 + 5 Ag parecido a CD5 + 1 Cheung KJ et al., J Viral Hepatol, 16: Diamond DL et al., Hepatology, 44: Anderson NL, Clin Chem, 56:
17 La proteómica es una herramienta molecular útil en la separación, cuantificación e identificación de una proteína en particular o de un grupo de estas 1,2,3. Gel 1: Sujeto sano Hay un mapa proteómico-calorimétrico asociado con la fibrosis hepática? Propiedades Fisiopatológicas Propiedades Térmicas No. Proteína Regulación Capacidad Calorífica Flujo de Calor Temp. de Transición Gel 2: Cirrosis (NAFLD) 1 Apolipoproteína A1 Isoforma 1-2 Apolipoproteína A1 Isoforma 2-3 Apolipoproteína A1 Isoforma 3 -????????? 4 Apolipoproteína A4 +??? 5 Ag parecido a CD5 +??? 1 Cheung KJ et al., J Viral Hepatol, 16: Diamond DL et al., Hepatology, 44: Anderson NL, Clin Chem, 56:
18 Perspectivas Analizar las propiedades calorimétricas de muestras séricas provenientes de sujetos sanos y pacientes con distintos grados de fibrosis/cirrosis por distintos agentes etiológicos. Analizar las propiedades proteómico-calorimétricas de muestras séricas provenientes de sujetos sanos y pacientes con distintos grados de fibrosis/cirrosis por distintos agentes etiológicos. Qué se ha obtenido? Resultados preliminares (go on!) Financiamiento por parte de la Fundación Mexicana para la Salud (Proyecto F-583 Antonio Ariza Cañadilla para Jóvenes Investigadores) y el CONACYT (Proyecto CB Apoyo a Iniciativas de Jóvenes Investigadores). Qué falta? Sueros de pacientes con distintos grados de fibrosis/cirrosis asociada a HCV, ALD, NAFLD, PBC (n=45). Cámara de Isoelectroenfoque.
19 Agradecimientos Dr. David Kershenobich Dr. Guillermo Robles Dra. Gabriela Gutiérrez Dra. Carolina Guzmán Dr. Joselín Hernández Dr. Jesús Aguirre QFB. Karina Suárez Álvarez pqfb. Giuliana López Navarrete Dr. José Luis Arjona Dra. Adela Rodríguez Dra. Yolanda López Vidal Dr. Gonzalo Castillo Rojas Dr. Antonmaría Minzoni
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