51 Int. CI.: C12Q 1/70 ( ) 73 Titular/es: 72 Inventor/es: 74 Agente/Representante:

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1 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA Número de publicación: Número de solicitud: Int. CI.: C12Q 1/70 ( ) 12 PATENTE DE INVENCIÓN B1 22 Fecha de presentación: Fecha de publicación de la solicitud: Fecha de la concesión: Fecha de publicación de la concesión: Número y fecha presentación solicitud principal: P Titular/es: INSTITUTO VALENCIANO DE INVESTIGACIONES AGRARIAS (IVIA) (50.0%) CRTA. MONCADA-NAQUERA, KM.4, MONCADA (Valencia) ES y FUNDO DE DEFENSA DA CITRICULTURA (FUNDECITRUS) (50.0%) 72 Inventor/es: BERTONI, Edson; CAMBRA ÁLVAREZ, Mariano; SERRA ALFONSO, Pedro; LOPEZ GONZALEZ, María Milagros; LOPES, Silvio; DURAN-VILA, Nuria; AYRES, Juliano y BOVÉ, Joseph 74 Agente/Representante: GONZÁLEZ PALMERO, Fe 54 Título: PROCEDIMIENTO DIRECTO DE DETECCIÓN ESPECÍFICA DE LOS VIROIDES POTATO SPINDLE TUBER VIROID Y CITRUS EXOCORTIS VIROID MEDIANTE DIANAS INMOVILIZADAS Y RT-PCR A TIEMPO REAL Y KIT PARA SU DETECCIÓN. ES B1 57 Resumen: Se detalla un procedimiento de preparación, conservación y análisis de muestras de material vegetal para diagnóstico y detección mediante amplificación molecular basada en RT-PCR a tiempo real. El procedimiento se ha aplicado a detección de los pospiviroides Potato spindle tuber viroid y Citrus exocortis viroid. Las muestras son inmovilizadas en soportes de papel o nylon, mediante impresión de tejidos o de sus secciones o absorbidas en papel o nylon cuando se trata de muestras líquidas. Las muestras inmovilizadas, pueden ser conservadas a temperatura ambiente. El protocolo de análisis comienza por la extracción de dianas del soporte con agua destilada, octoxinol o tampón glicina y posterior análisis por RT-PCR a tiempo real. Se detallan las secuencias de nucleótidos de iniciadores de amplificación molecular y sondas TaqMan en las que se basa el kit de detección. Aviso: Se puede realizar consulta prevista por el art LP.

2 procedimiento DIRECTO DE DETECCIÓN ESPECÍFICA DE LOS VIROIDES Patato spindle t"her viro id Y Citrus exocortis viro id MEDIANTE DIANAS 5 INMOVILIZADAS Y RT-PCR A TIEMPO REAL Y KIT PARA SU DETECCIÓN DESCRIPCIÓN 10 CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona en general con la detección de material genético (secuencias de ácidos nucleicos) mediante el empleo de la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa a tiempo real, y en particular con la preparación previa de las muestras y 15 su conservación, antes de realizar RT-PCR cuantitativa a tiempo real. El procedimiento comprende la inmovilización directa, conservación y extracción de las dianas de interés para su amplificación molecular por RT-PCR a tiempo real. La invención, por tanto, se relaciona con: 1) un procedimiento de preparación directa de muestras mediante inmovilización en membranas de papel o nylon por impresión o escachado de material 20 vegetal 2) un procedimiento para analizar extractos brutos de muestras de material vegetal o RNA purificado, inmovilizado en soportes sólidos, 3) un método de conservación de las membranas conteniendo muestras de cualquier tipo, 4) un sistema de extracción de dianas sin purificación de ácidos nuc1eicos y 5) unas secuencias de nucleótidos de iniciadores y sondas TaqMan específicas, para el diagnóstico y detección universal de Po tato spindle 25 tuber viro id (PSTV d) y Citrus exocortis viroid (CEV d) de cualquier origen o huésped, mediante un kit basado en todo lo anterior. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN 2

3 La patente ES de 25 de mayo de 1996, de la cual fue solicitante el Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias (lvia) e inventores Mariano Cambra Álvarez, Antonio Olmos Castelló y Miguel Ángel Dasi Rodríguez, describe un procedimiento de preparación de dianas para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 5 convencional. Esta patente ha sido mantenida por IVIA hasta la fecha. En la actualidad, se han realizado nuevas aplicaciones y modificado el procedimiento inicialmente descrito en la patente y posteriormente por Olmos el al., 1996 (Nucleic Acids Res. 24, ), para simplificarlo y poderlo aplicar a agentes patógenos no ensayados todavía y muy problemáticos en su detección, como los viroides (agentes patógenos o replicones 10 infecciosos carentes de proteína de cubierta). El procedimiento de inmovilización de dianas en soportes sólidos (membranas), su extracción y análisis mediante RT-PCR a tiempo real, sólo se ha aplicado a la detección de virus en material vegetal y en artrópodos (Olmos el al., J. Virol. Methods 128, ; Cambra el al., In:Virus Diseases and Crop Biosecurity, Ed. 15 NATO-Security trough Science. Series C. Springer pp.; Osman y Rowhani, J. Virol. Methods 133, ; Olmos el al., In: Biotechnology and plant diseases management. CABI Press, British Columbia pp.; Bertolini el al., Eur. J. Plant Pathol. 120, ; López el al., Curro Issues Mol. Biol. 11, 13-46; Capote el al Int. Microbiol. 12, 1-6; Bertolini el al., Eur. J. Plant Pathol. 128, El procedimiento no ha sido descrito para detección de viroides, ya que estos organismos fitopatógenos presentan concentraciones estacionales mínimas en la planta y distribución o repartición irregular en los tejidos del hospedador. La detección fiable de estos organismos, algunos de ellos clasificados como de cuarentena, hace necesario el desarrollo de técnicas y protocolos extremadamente sensibles y específicos para su detección y diagnóstico y que 25 puedan ser empleados en gran escala de una forma sencilla. Además, la invención permite la conservación y el uso de controles inmovilizados sin riesgos de escapes. Los viroides son moléculas de RNA monocatenario, covalentemente cerradas, sin capacidad codificante, pero capaces de replicarse de forma autónoma utilizando la maquinaria transcripcional de las células a las que parasitan. Estos constituyen la forma 30 más extrema de parasitismo en el mundo vegetal. Los viroides son los entes biológicos más 3

4 simples descritos hasta el momento (Flores y Duran, In: Patología vegetal. Tomo 1. SEF-Phytoma España ). Poseen propiedades estructurales, funcionales y evolutivas propias. El tamaño de los viroides oscila entre 246 y 399 nucleótidos, correspondientes respectivamente al viroide del "Cadang-cadang" (Coconut cadang- 5 cadang viro id, CCCV d) del cocotero y al viroide del moteado clorótico del crisantemo (Chrysanthemun chlorotic mottle viro id, CChMVd) (Flores et al., In: Viroids. CSIRO Publishing, Collingwood ). La familia Pospiviroidae, comprende cinco géneros que incluyen al género Pospiviroide que contiene, hasta el momento, nueve especies: Po tato spindle tuber viroid 10 (PSTV d) (especie tipo), Tomato chlorotic dwarf viroid (TCDV d), Mexican papila viroid (MPV d), Tomato planta macho viro id (TPMV d), Chrysanthemum stunt viro id (CSV d), Tomato apical stunt viro id (TASV d), Iresine viroid (IrV d), Columnea latent viro id (CL Vd) y Cilrus exocortis viroid (CEV d). Los viroides PSTV d y CEV d son objeto de esta patente de invención por ser los de mayor repercusión económica en los cultivos de patata y 15 cítricos, respectivamente. PSTV d causa la enfermedad del ahusado o tubérculos fusiformes de la patata (Solanum tuberosum), enfermedad que causa cuantiosas pérdidas económicas en dicho cultivo por lo cual se considera de cuarentena en la legislación europea (EU Annex l/al, EPPO A2) y en la de otros países. Este viroide posee una considerable estructura 20 secundaria y en patata normalmente posee un tamaño de 359 nucleótidos. Es el único viroide conocido que infecta naturalmente a especies cultivadas de patata, aunque se ha encontrado MPV d en S. cardiophyllum (papita guera o cimantli). PSTV d es muy polífago pudiendo parasitar a 94 especies de 31 familias, pero su principal hospedador son especies de solanáceas de diversos géneros (Solanum, Brugmansia, Datura, entre otros). 25 CEV d causa la enfermedad de la exocortis de los cítricos, aunque puede parasitar a plantas de interés económico de muy diversas familias botánicas, siendo la mayoría de ellas portadores asintomáticos. No obstante, CEVd es limitante del uso de patrones tolerantes al síndrome de tristeza causado por Citrus tristeza virus (CTV), ya que son muy sensibles al viroide que induce descamación de la corteza, enanismo y 30 disminución del rendimiento en cosecha. CEVd está distribuido en la mayoría de los países 4

5 citrícolas y las pérdidas económicas son variables y dependen de la estirpe del patógeno, la edad del árbol en el momento que tiene lugar la infección y las condiciones climáticas de la zona. Para una citricultura moderna es imprescindible disponer de cultivares y patrones libres de CEV d y de otros viroides de los cítricos (Duran; In: Enfermedades de los 5 cítricos, SEF, Mundi Prensa, 87-92). El tamaño de su genoma oscila entre nucleótidos y presenta numerosas variantes de secuencia. Los métodos de detección de viroides se basan principalmente en técnicas biológicas, bioquímicas, moleculares o en combinación de las mismas. Los viroides no posen envoltorio proteico, haciendo imposible el uso de métodos inmunológicos utilizados 10 normalmente para la detección de virus. Se han publicado protocolos internacionales para diagnóstico de PSTVd (OEPPIEPPO, Bull OEPPIEPPO Bull 34, ). Las pruebas biológicas son únicamente utilizadas para detección de CEV d y otros viroides de los cítricos y consisten en la inoculación de plantas indicadoras de cidro Etrog (Roistacher. 1991), pero estos métodos no son específicos y por tanto no permiten distinguir entre 15 viroides (Duran-Vila y Semancik, Ann. App!. Bio!. 17, ), además son lentos y caros. Los métodos bioquímicos se basan en la realización de electroforesis secuencial en geles de poliacrilamida (spage) (Semancik y Harper Proc. Nat!. Acad. Sci. USA, 81, ) que permite distinguir los viroides presentes en un aislado por su movilidad electroforética. Para la detección molecular es importante considerar que el 20 material genético de los viroides es RNA de cadena sencilla, circular y fuertemente estructurado. Entre los métodos moleculares de detección de viroides figura la hibridación molecular con sondas radiactivas o marcadas con digoxigenina (Flores Proc. 10th Conf. Int. Org. Citrus Virol., IOCV, ; Podleckis et al., J. Virol. Methods 43, ). Una interesante versión de la hibridación molecular combinada con la 25 realización de impresiones de material vegetal fue descrita por Palacio-Bielsa et al. (1999). Eur. J. Plant Pathol. 105, En este método se combinan técnicas biológicas de amplificación de la población de viroides en huéspedes apropiados previa a la realización de impresiones de secciones de tejido vegetal en membranas y su posterior hibridación con sondas específicas. También se ha descrito un sistema de hibridación "northern" con 3 O sondas marcadas con digoxigenina que permite detectar viroides en extractos de muestras 5

6 de campo (Murcia et al., Mol. Cell Probes 23, ). No obstante, todos estos métodos moleculares o híbridos poseen escasa sensibilidad y frecuentemente son muy laboriosos limitando el número de muestras que pueden ser procesadas por operario y día. La puesta a punto de la RT-PCR y su aplicación a la detección de viroides ha permitido 5 incrementar la sensibilidad, aunque la detección rutinaria mediante esta técnica no se ha popularizado por problemas de inhibiciones que inducen falsos negativos y amplificaciones inespecíficas (Garnsey et al., Proc. 15th Conf. Int. Org. Citrus Virol., IOCV, ). Además, la RT-PCR convencional posee altos riesgos de contaminación (falsos positivos) (Olmos et al., In: Molecular diagnostic methods for plant viruses. CABI 10 Press, London ; López et al., 2009). La aplicación de RT- PCR a tiempo real a la detección de viroides está en su etapa inicial, de hecho únicamente se han publicado tres trabajos, del mismo grupo de investigación, aplicados a PSTV d (Boonham et al., J. Virol. Methods 116, ; OEPPIEPPO, 2004, y Monger et al., J. Virol. Methods doi: /j.jviromet.201O ). Para e! método propuesto se utiliza RNA purificado 15 que complica y encarece el coste de la detección y limita e! número de muestras procesables diariamente por un operario. La presente invención proporciona un procedimiento de preparación de muestras de patata, solanáceas en general, plantas hortícolas, ornamentales y cítricos para su uso directo en RT-PCR a tiempo real, su conservación por largos periodos antes de! 20 análisis o como controles y su análisis directo, mediante un kit basado en e! protocolo, tras una sencilla extracción de las dianas de los viroides PSTV d y CEV d directamente inmovilizadas en soportes sólidos (véanse ejemplos de aplicación 1 y 2). DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN 25 Así pues, en un pnmer aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento de preparación de dianas para RT-PCR a tiempo real, su conservación y su extracción para análisis mediante RT-PCR a tiempo real utilizando los iniciadores identificados como PSTV df, PSTV dr y PSTV dp para detección de PSTV d, CEV df, CEV dr 6

7 y CEV dp para detección de CEV d. El término "diana para RT-PCR" en el sentido utilizado en esta descripción, se refiere a fragmentos de ácidos nucleicos (ARN) desnudos o situados dentro de células de vegetales. 5 El procedimiento comprende las siguientes etapas: i) Inmovilización de las dianas para RT-PCR a tiempo real de secciones impresas o de escachados de muestras de tejidos de vegetales que las contienen (Figuras 1) o de sus extractos brutos; ii) Conservación de las dianas inmovilizadas en soportes sólidos conteniendo muestras de 10 cualquier tipo; iii) Extracción de las dianas para posterior análisis por RT-PCR a tiempo real; iv) Análisis de las muestras mediante RT-PCR utilizando los iniciadores y las sondas específicas identificadas y descritas en esta invención, mediante un kit. Para efectuar la inmovilización o fijación de las dianas para RT-PCR a tiempo 15 real a partir de muestras vegetales: secciones o la zona de escisión tras arrancado manual de órganos de vegetales (hojas enteras emolladas, pedicelo de hojas, pedúnculo de frutos, partes de flores, brotes, tallos, corteza de raíces) se ponen en contacto con un soporte apropiado, bajo condiciones adecuadas y durante un período de tiempo suficiente como para que la diana para RT-PCR a tiempo real quede retenida sobre dicho soporte. El 20 soporte adecuado para llevar a cabo esta etapa puede ser una membrana de nylon o de cualquier tipo de papel convencional, preferentemente Whatman 3MM por su alta capacidad de absorción de líquidos y su bajo coste. En este caso concreto, se ha utilizado membranas de nylon para la detección de los viroides PSTV d y CEV d aunque se puede utilizar cualquier otro papel convencional o membranas de nitrocelulosa o de éster de 25 nitrocelulosa. Las muestras pueden ser sólidas, por ejemplo, secciones frescas de tejidos de vegetales directamente escachados, o muestras líquidas, como por ejemplo, extractos de vegetales o ácidos nucleicos previamente purificados. Cuando la muestra es sólida, por ejemplo, una sección fresca de tejido de vegetal, su inmovilización en el soporte se realiza por impresión o escachado, es decir, presionando la muestra firmemente sobre el soporte 30 durante un corto período de tiempo (unos segundos). En el caso de muestras líquidas, unos 7

8 5 micro litros del extracto bruto o de la solución purificada de ácidos nuc1eicos, se depositan directamente en el soporte quedando así retenidas por absorción. La operación de fijación de muestras se puede realizar directamente en membranas en condiciones de campo o laboratorio o en secciones de unos 5 mm 2 previamente introducidas en tubos tipo 5 Eppendorf o en pocillos de microplacas de 96 pocillos tipo ELISA. Esta última modalidad es la más apropiada para extractos y muestras líquidas por facilitar su depósito directamente en el contenedor en el que se realizará la extracción de las dianas. Las dianas retenidas en el soporte sólido, impresionadas, escachadas o absorbidas (membrana o trozos de la misma contenidos en tubos Eppendorf o placas 10 ELISA) pueden ser procesadas directamente o bien pueden ser conservadas en condiciones de poca humedad y preferentemente en la oscuridad durante un período de tiempo de al menos dos años, sin que se produzca una pérdida de sensibilidad en la detección por RT PCR a tiempo real. Para ello, las membranas conteniendo las dianas se introducen en un sobre de papel para garantizar la obscuridad, se conservan a temperatura ambiente o a 4 C 15 en un contenedor hermético con desecante tipo silica gel o cloruro de calcio. Otra modalidad consiste en introducir el sobre conteniendo las membranas con las muestras inmovilizadas en una bolsa de plástico apta para realizar vacío y efectuarlo mediante un simple aparato de vacio alimentario. La conservación de tubos Eppendorf o placas ELISA con secciones de 20 membranas impresas o absorbidas con líquidos se realiza cerrando los tubos y/o sellando las placas y manteniendo las muestras inmovilizadas en obscuridad y a temperatura ambiente en un lugar de ambiente seco. Para la extracción de las dianas previamente fijadas en el soporte, para análisis 25 por RT-PCR a tiempo real, se introducen secciones recortadas del soporte conteniendo las dianas en contenedores adecuados, tubos Eppendorf por ejemplo. En este caso y en el caso de haber dispensado líquido en secciones de membranas ya introducidas en tubos o microplacas ELISA, se realizará el siguiente tratamiento: 1) Dispensar 100 microlitros de agua destilada o tampón glicina 0.1 M o bien del detergente no iónico octoxinol (Tritón X Merck) para cubrir la sección de soporte contenida en el tubo o pocillo de microplaca, 8

9 2) Calentar a 100 C durante 10 minutos en un termobloque o al baño María. Esta operación se puede obviar en análisis de rutina, 3) Realizar agitación durante 5 segundos para asegurar el contacto del agente extractor de las dianas caliente, y 4) Realizar un pulso de centrifugación (unas rpm en unos 5 segundos). 5 A continuación, con las dianas solubilizadas se procede a realizar la amplificación por RT-PCR a tiempo real de la manera que se detalla para cada uno de los agentes fitopatógenos descritos en los ejemplos. Mediante el procedimiento desarrollado en esta invención se evita, en primer lugar, la necesidad de preparar extractos de material vegetal y purificar ácidos nucleicos, y loen segundo lugar, con este procedimiento se logra una inmovilización eficiente y duradera de las dianas para su posterior análisis por RT-PCR a tiempo real. Además, el protocolo diseñado permite la realización sencilla y rutinaria de numerosos análisis de forma rápida y con la alta precisión de la técnica molecular utilizada. Los siguientes ejemplos ilustran formas concretas de realización de los 15 procedimientos y kit, objeto de esta invención. Ejemplo 1. Detección por RT-PCR a tiempo real de PSTVd en material vegetal impreso en 20 membranas de nylon Preparación de la diana para RT -PCR a tiempo real y otros métodos. Secciones frescas de tejido vegetal procedentes de 135 muestras de Solanum jasminoides, Brugmansia spp., Datura sp., Gynura aurantiaca y de Chrysanthemum coronarium se inmovilizaron en membranas de nylon positivamente cargado, presionando 25 firmemente las secciones de dichos tejidos sobre el soporte. Se imprimieron al menos 10 hojas tomadas alrededor de cada planta a analizar. Con ello quedaron inmovilizadas las posibles dianas de PSTV d presentes en las muestras. A continuación, las impresiones directas de material vegetal en papel fueron recortadas e introducidas en tubos Eppendorf de 1,5 mi a los a los que se añadieron 100..tI de tampón O.lM glicina conteniendo 0.01 M 30 NaCl y lmm EDTA en agua destilada estéril. Los tubos fueron calentados a 100 C durante 9

10 10 minutos en un termo bloque y a continuación se aplicó un "vortex" o agitación vigorosa durante 5 segundos. Seguidamente se centrifugaron los tubos (6.000 rpm durante 5 segundos), con lo que las dianas pasaron al sobrenadante. Además, todas las muestras se analizaron mediante el protocolo de diagnóstico de PSTV d de la Organización Europea y 5 Mediterránea para la Protección de Plantas (OEPP/EPPO, 2004) basado en preparación de un extracto bruto, clarificación y purificación de ARN total, realización de sp AGE electroforesis, hibridación molecular con sondas específicas del género Pospiviroide, RT PCR y secuenciación para confirmar la identidad del viroide amplificado Amplificación por RT -PCR a tiempo real. 10 Las muestras inmovilizadas en membranas se procesaron según el procedimiento descrito en esta patente. Se utilizaron los dos iniciadores y la sonda TaqMan descritos en esta patente PSTV df y PSTV dr y la sonda PSTV dp. Se preparó el cóctel de amplificación en un volumen final de 12 J.lI compuesto por: 1 x AgPath-ID One Step PCR master mix (Ambion), 1 x RT-PCR enzyme mix (Ambion), 0.5 J.lM de cada uno de 15 los iniciadores, 100 nm de la sonda TaqMan y 3 J.ll de las dianas directamente extraídas según el procedimiento descrito. El protocolo de amplificación consistió en 1 ciclo de (45 C durante 10 minutos y 95 C durante 10 minutos) y 45 ciclos de (95 C durante 15 segundos y 60 C durante 1 minuto) y se realizó en un termociclador StepOne Plus (Applied Biosystems). 20 Un ejemplo de los resultados obtenidos tras el análisis se muestra en la Figura 2 donde se observan las curvas de amplificación típicas de RT-PCR a tiempo real de parte de las muestras positivas analizadas frente a PSTV d. Se amplificaron dianas de PSTV d del 29,62 % (40 de 135) de las muestras analizadas mediante el procedimiento objeto de la invención. Las mismas muestras resultaron positivas mediante el procedimiento clásico 25 descrito por la OEPPIEPPO (2004). Ello demuestra la detección precisa y fiable de PSTVd mediante el procedimiento descrito que evita la extracción y purificación de ARN, la necesidad de hibridación y/o RT-PCR convencional y la posterior secuenciación de los productos de amplificación para confirmar la presencia de PSTV d. Por tanto, el procedimiento objeto de la invención es más rápido, sencillo, económico que el método 30 utilizado hasta ahora y es igualmente sensible y preciso. 10

11 Ejemplo 2. Detección por RT-PCR a tiempo real de CEVd en material vegetal de cítricos impreso en membranas de nylon Preparación de la diana para RT-PCR a tiempo real Se inmovilizaron secciones frescas de pedicelo de hojas (arrancadas manualmente) procedentes de diversos árboles de campo de naranjo dulce (Citrus sinensis) con y sin síntomas de la enfermedad de la exocortis, en membranas de nylon positivamente cargado. Ello se efectuó presionando firmemente las secciones de dichos tejidos sobre el 10 soporte. En el caso de árboles con síntomas se imprimieron (parcialmente superpuestas véase ejemplo en la Figura 1) 5 hojas por árbol. En el caso de árboles asintomáticos se imprimieron 10 hojas tomadas alrededor del árbol sospechoso a analizar (véase ejemplo de la Figura1). También se imprimieron hojas recolectadas de árboles de cidro (C medica) inoculados con HSV d y de tallos de plantas de Solanum jasminoides infectadas con 15 PSTVd. A continuación, las impresiones directas de material vegetal en membranas de nylon fueron recortadas e introducidas en tubos Eppendorf de 1,5 mi a los que se añadieron 100 ~l de tampón O.lM glicina conteniendo 0.01 M NaCl y 1mM EDTA en agua destilada estéril. Los tubos fueron calentados a 100 C durante 10 minutos en un termobloque y a continuación se aplicó un "vortex" o agitación vigorosa durante 5 segundos. Seguidamente 20 se centrifugaron los tubos (6.000 rpm durante 5 segundos), con lo que las dianas pasaron al sobrenadante que constituyó la muestra para RT-PCR a tiempo real Amplificación por PCR a tiempo real Se utilizaron los dos iniciadores y la sonda TaqMan descritos en esta patente CEV df y CEV dr y la sonda CEV dp. Se preparó el cóctel de amplificación en un volumen 25 final de 12 ~l compuesto por: 1 x AgPath-ID One Step PCR master mix (Ambion), 1 x RT-PCR enzyme mix (Ambion), 0.5 ~M de cada uno de los iniciadores, 100 nm de la sonda TaqMan y 3 ~l de las dianas directamente extraídas según el procedimiento descrito. El protocolo de amplificación consistió en 1 ciclo de (45 C durante 10 minutos y 95 C durante 10 minutos) y 45 ciclos de (95 C durante 15 segundos y 60 C durante 1 minuto) y 30 se realizó en un termociclador StepOne Plus (Applied Biosystems). 11

12 Un ejemplo de los resultados obtenidos tras el análisis se muestra en la Figura 3 donde se observan las típicas curvas de amplificación de RT-PCR a tiempo real en algunas muestras que contenían dianas amplificables de CEV d. Se detectó CEV d en todas las plantas que mostraban síntomas y en alguna que todavía no los mostraban, pero que 5 estaban inoculadas con el viroide. No se obtuvo amplificación en ninguno de los controles sanos ni de material vegetal infectado con otros viroides (HSV d y PSTV d). Estos resultados muestran la sencillez y la eficacia de la detección de dicho viroide en material vegetal inmovilizado en soporte de nylon, extraído y directamente procesado por RT-PCR según el procedimiento específico desarrollado. 10 DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Para complementar la descripción que se está realizando y con objeto de 15 ayudar a una mejor comprensión de las características del invento, se acompaña como parte integrante de dicha descripción, un juego de dibujos en donde con carácter ilustrativo y no limitativo, se ha representado lo siguiente: La figura 1.- Muestra impresiones de secciones de brotes de naranjo dulce ligeramente superpuestos (de 1 a 5 en la parte superior y de 6 a loen la parte 20 inferior) en membrana de papel Whatman 3MM. El área a recortar para introducir en tubos Eppendorf o pocillos de placas ELISA es de aproximadamente 0.5 mm 2, tal y como se indica en el círculo de la figura. La figura 2.- Muestra curvas de amplificación por RT-PCR a tiempo real de Potato spindle tuber viroid (PSTVd) utilizando muestras de Solanumjasminoides 25 impresas en membranas de nylon. La figura 3.- Muestra curvas de amplificación por RT-PCR a tiempo real de Citrus exocortis viroid (CEVd) utilizando muestras de naranjo dulce de campo impresas en membranas de nylon. 12

13 REIVINDICACIONES 1 a._ Procedimiento directo de detección específica de Potato spindle tuber viroid y Citrus exocortis viro id mediante dianas inmovilizadas y RT-PCR a tiempo real, 5 caracterizado porque comprende las etapas de: i) Inmovilización de las dianas para RT PCR a tiempo real de muestras vegetales en un soporte sólido, y ii) Extracción de las dianas para RT-PCR a tiempo real con agua destilada o un agente capaz de solubilizar dichas dianas a._ Procedimiento directo de detección específica de Po tato spindle tuber viroid y Citrus exocortis viroid mediante dianas inmovilizadas y RT-PCR a tiempo real, según reivindicación 1 a, caracterizado porque en la conservación de las dianas inmovilizadas permite largos periodos de almacenamiento y su envío por correo para posterior análisis por RT-PCR a tiempo real. 3 a._ Procedimiento directo de detección específica de Potato spindle tuber viroid y Citrus exocortis viroid mediante dianas inmovilizadas y RT-PCR a tiempo real, según reivindicación la, caracterizado porque se emplea para analizar sistemáticamente por RT-PCR a tiempo real, dianas inmovilizadas y conservadas en tubos Eppendorf o en 20 pocillos de placas ELISA. 4 a.-procedimiento directo de detección específica de Potato spindle tuber viroid y Citrus exocortis viroid mediante dianas inmovilizadas y RT-PCR a tiempo real, según reivindicación a, caracterizado porque utiliza como iniciador directo para la 25 amplificación por RT-PCR a tiempo real del viroide PSTVd. la secuencia (SEQ ID N 1) de 19 nucleótidos (posición ) de la secuencia de Po tato spindle tuber viro id (GenBank n GU ), denominada PSTVdf. 7 a._ Procedimiento directo de detección específica de Po tato spindle tuber 30 viroid y Citrus exocortis viroid mediante dianas inmovilizadas y RT-PCR a tiempo real, 13

14 según reivindicación la, caracterizado porque utiliza como iniciador reverso para la amplificación por RT-PCR a tiempo real del viroide PSTVd. la secuencia (SEQ ID N 2) de 16 nucleótidos (complementaria a la posición ) de la secuencia de Po tato spindle tuber viroid-pstvd (GenBank no GU ), denominada PSTVdr. 5 8 a._ Procedimiento directo de detección específica de Potato spindle tuber viroid y Citrus exocortis viro id mediante dianas inmovilizadas y RT-PCR a tiempo real, según reivindicación 1 a, caracterizado porque utiliza como sonda en la amplificación por RT-PCR a tiempo real del viroide PSTVd la secuencia (SEQ ID N 3)de 27 nucleótidos 10 (posición 19-45) de la secuencia de Potato spindle tuber viroid-pstvd (GenBank n GU ), denominada PSTVdp. 9 a._ Procedimiento directo de detección específica de Po tato spindle tuber viro id y Citrus exocortis viroid mediante dianas inmovilizadas y RT-PCR a tiempo real, 15 según reivindicación 1 a, caracterizado porque utiliza como iniciador directo para la amplificación por RT-PCR a tiempo real del viroide CEVd la secuencia (SEQ ID N 4) de 20 nucleótidos (posición ) de la secuencia de Citrus exocortis viroid-cevd (GenBank no FJ ), denominada CEVdf. 20 loa._ Procedimiento directo de detección específica de Potato spindle tuber viroid y Citrus exocortis viroid mediante dianas inmovilizadas y RT-PCR a tiempo real, según reivindicación a, caracterizado porque utiliza como iniciador reverso en la amplificación por RT-PCR a tiempo real del viroide CEVd la secuencia (SEQ ID N 5) de 18 nucleótidos (complementaria a la posición 80-97) de la secuencia de Citrus exocortis 25 viroid-cevd (GenBank no FJ ), denominada CEVdr. 11 a._ Procedimiento directo de detección específica de Potato spindle tuber viroid y Citrus exocortis viroid mediante dianas inmovilizadas y RT-PCR a tiempo real, según reivindicación a, caracterizado porque utiliza como sonda en la amplificación por 30 RT-PCR a tiempo real del viroide CEVd la secuencia (SEQ ID N 6) de 28 nucleótidos 14

15 (posición ) de la secuencia de Citrus exocortis viroid-cevd (GenBank no FJ ), denominada CEVdp Procedimiento directo de detección específica de Po tato spindle tuber 5 viro id y Citrus exocortis viroid mediante dianas inmovilizadas y RT-PCR a tiempo real, según reivindicaciones anteriores, caracterizado por el uso de dichas secuencias para la fabricación de un kit completo de diagnóstico, detección, identificación o caracterización de los viroides PSTV d y CEV d u otros del mismo género Pospiviroide. 15

16 Figura ~ ~~M»»~»»»»».4 CycIt Figura 2 16

17 ES B1 Al 0,1 c: 93 0,01 0,001 0,0001 0, a I ~ a u M M Z ~ ~ ~ a ~» ~ ~ e G ~ Cycle Figura 3 17

18 Lista de Secuencias <110> Instituto valenciano de Investigaciones Agrarias <120> procedimiento directo de detección específica de los viroides potato spindle tuber viroid y Citrus exocortis viroid mediante dianas inmovilizadas y RT-PCR a tiempo real y kit para su detección <160> 6 <170> BissAP 1.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> source <222> <223> /mol_tr,pe="dna" /note='forward primer pstvdf" /organism="artificial sequence" <400> 1 ccttggaacc gcagttggt 19 <210> 2 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial sequen ce <220> <221> sou rce <222> <223> /mol_tvpe="dna" /note=f'reverse Primer PSTVd R" /organism="artificial sequence" <400> 2 tttccccggg gatccc <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> source <222> <223> /mol_tvpe="dna" /note=f'probe PsTVd p" /organism="artificial sequence" <400> 3 tcctgtggtt cacacctgac ctcctga <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artifi ci al sequence <220> <221> source <222>

19 PSTVd y CEvd 20 <223> jmol_tvpe="dna" jnote=1'forward Primer cevd F" jorganism="artificial sequence" <400> 4 ccctcggaac cctagattgg <210> 5 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> source <222> <223> jmol_type="dna" jnote="reverse primer cevd R" jorganism="artificial sequence" <400> 5 cggggatccc tgaagga <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequen ce <220> <221> source <222> <223> jmol_type="dna" jnote="probe CEvd p" jorganism="artificial Sequence" <400> 6 ctcgggatct ttcttgaggt tcctgtgg

20 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 21 N.º solicitud: Fecha de presentación de la solicitud: Fecha de prioridad: INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA 51 Int. Cl. : C12Q1/70 ( ) DOCUMENTOS RELEVANTES Categoría 56 Documentos citados Reivindicaciones afectadas X X X X ES A1 (IVIA) , ejemplos 1 y 2; reivindicaciones 1-4. OSMAN, F. et al., Application of a spotting sample preparation technique for the detection of pathogens in woody plants by RT-PCR and real-time PCR (TaqMan), JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS, 2006, Vol.133, No. 2, páginas , ISSN: , Materiales y Métodos. HU, Y. et al., Role of the variable domain in modulating potato spindle tuber viroid replication., VIROLOGY. 1996, Vol. 19, No.1, páginas ISSN: , Materiales y Métodos. SHAMLOUL, A. M. et al., A novel multiplex RT-PCR probe capture hybridization (RT-PCR- ELISA) for simultaneous detection of six viroids in four genera: Apscaviroid, Hostuviroid, Pelamoviroid, and Pospiviroid, JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS, 2002, Vol. 105, No. 1, páginas , ISSN: , Materiales y Métodos; Tabla , , 10 Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud El presente informe ha sido realizado para todas las reivindicaciones para las reivindicaciones nº: Fecha de realización del informe Examinador J. L. Vizán Arroyo Página 1/6

21 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 21 N.º solicitud: Fecha de presentación de la solicitud: Fecha de prioridad: INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA 51 Int. Cl. : C12Q1/70 ( ) DOCUMENTOS RELEVANTES Categoría 56 Documentos citados Reivindicaciones afectadas X X GANDIA, M. et al., Genetic variation and population structure of an isolate of Citrus exocortis viroid (CEVd) and of the progenies of two infectious sequence variants, ARCHIVES OF VIROLOGY, 2005, Vol. 150, No. 10, páginas , ISSN: , Materiales y Métodos. XIAN-FENG, M. et al., Molecular Detection and Characterization of Citrus Viroids, AGRICULTURAL SCIENCES IN CHINA, 2008 Nov, Vol. 7, No. 1, páginas , ISSN: , Materiales y Métodos; Tabla Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud El presente informe ha sido realizado para todas las reivindicaciones para las reivindicaciones nº: Fecha de realización del informe Examinador J. L. Vizán Arroyo Página 2/6

22 INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICA Nº de solicitud: Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación) C12Q Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de búsqueda utilizados) INVENES, EPODOC, BIOSIS, MEDLINE, EMBASE, EBI Informe del Estado de la Técnica Página 3/6

23 OPINIÓN ESCRITA Nº de solicitud: Fecha de Realización de la Opinión Escrita: Declaración Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986) Reivindicaciones 4-10 SI Reivindicaciones 1-3 NO Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986) Reivindicaciones SI Reivindicaciones 1-10 NO Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986). Base de la Opinión.- La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica. Informe del Estado de la Técnica Página 4/6

24 OPINIÓN ESCRITA Nº de solicitud: Documentos considerados.- A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión. Documento Número Publicación o Identificación Fecha Publicación D01 ES A1 (IVIA) D02 Osman, F. et al., J. Virol. Methods, (2006), 133(2): D03 Hu, Y. et al., Virology, (1996), 219(1): D04 Shamloul, A. M. et al., J. Virol. Methods, (2002),105(1): D05 Gandia, M. et al., Arch. Virol., (2005), 150(10): D06 Xian-feng, M. et al., Agric. Sci. China, (2008), 7(1): En D1-D2 se describen métodos de preparación de dianas inmovilizadas para una reacción PCR. En D3-D5 se describen procedimientos de detección del los viroides PSTVd ('Potato Spindle Tuber Viroid') y CEVd ('Citrus Exocortis Viroid'). 2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración 1. NOVEDAD (Art y Art de la Ley de Patentes) Reivindicación independiente El objeto de la reivindicación 1 consiste en un método para la detección de los viroides PSTVd y CEVd que comprende una reacción RT-PCR a tiempo real caracterizada por la inmovilización de las secuencias diana en un soporte sólido y su posterior extracción con agua destilada o un agente capaz de solubilizarlas. En los documentos D1 y D2 del estado de la técnica se describen procedimientos de preparación de dianas para PCR caracterizados porque las secuencias diana son inmovilizadas en un soporte sólido y posteriormente extraídas para su amplificación enzimática (cf. D1: ejemplos 1 y 2; reivindicaciones 1-4. D2: Materiales y Métodos). Por consiguiente, el objeto de protección de la reivindicación independiente 1 y el de las reivindicaciones dependientes 2 y 3 se considera que no es nuevo sobre la base de los documentos D1-D La presente solicitud no satisface el criterio establecido en el Art de la Ley de Patentes, pues el objeto de las reivindicaciones 1-3 no es nuevo de acuerdo con el Art de la Ley de Patentes. 2. ACTIVIDAD INVENTIVA (Art y Art de la Ley de Patentes) Reivindicación independiente 1 en combinación con las reivindicaciones 4 a Los documentos D1, D3-D6 constituyen el estado de la técnica más próximo. En D1 se divulga un procedimiento de preparación de dianas para PCR. En D3-D6 se describen procedimientos de detección y cuantificación de PSTVd y CEVd que consisten básicamente en una reacción RT-PCR caracterizada por el uso de pares de cebadores específicos. Concretamente, en D3-D4 se divulgan pares de cebadores cuyas secuencias son complementarias con las posiciones y (RAO34-RAO14), y con las posiciones y (CPSTVd-HPSTVd) de la secuencia de PSTVd (cf. D3: Materiales y Métodos, Sequence analysis of viroid progeny. D4: Materiales y Métodos, Tabla 1). Por otro lado, en D5-D6 se describe el uso de los cebadores CEVd-1 CEVd-2 complementarios con las posiciones y de CEVd, y los cebadores C1 (posiciones ) y C2 con las posiciones y de CEVd (f. D5: Materiales y Métodos. D6: Materiales y Métodos, Tabla 2) El problema técnico a resolver por el objeto de la reivindicación independiente 1 puede ser considerado, por consiguiente, como la provisión de un nuevo procedimiento de detección de los viroides PSTVd y CEVd. Informe del Estado de la Técnica Página 5/6

25 OPINIÓN ESCRITA Nº de solicitud: La solución propuesta es el procedimiento de la reivindicación 1 en combinación con las reivindicaciones 4 a 10 que consiste básicamente en una reacción RT-PCR a tiempo real caracterizada por el uso los cebadores PSTVd-f (SEQ ID No 1) y PSTVd-r (SEQ ID No 2) cuyas secuencias son complementarias con las posiciones y de la secuencia de PLMVd (cf Reivindicaciones 4 y 5), y por el uso de los cebadores CEVd-f (SEQ ID No 4) y CEVd-r (SEQ ID No 5) cuyas secuencias son complementarias con las posiciones y de la secuencia de CEVd (cf Reivindicaciones 7 y 8). Por consiguiente, la diferencia entre el procedimiento de la invención y los descritos en D3-D6 radica básicamente en los cebadores empleados en cada caso para la amplificación de la secuencia de los viroides PSTVd y CEVd. Los cebadores utilizados tanto en el procedimiento de la invención como en los descritos en D3-D6 comparten parcialmente las mismas secuencias de los viroides concernidos. Puesto que en la solicitud no se especifica el supuesto efecto sorprendente e inesperado derivado del uso de los cebadores de la invención frente a los descritos en D3-D6 que se traduciría en una mejora del procedimiento de detección de la invención frente a los divulgados en D3-D6, se considera que la solución propuesta por el objeto de las reivindicación 1 en combinación con las reivindicaciones 4 a 10 al problema técnico planteado es una alternativa no inventiva a la solución existente en el estado de la técnica que no requeriría de la aplicación de conocimientos técnicos inventivos por parte del experto en la materia La presente invención no satisface el criterio establecido en el Art de la Ley de Patentes porque el objeto de la invención, definido en las reivindicaciones 1, 4-10, no implica actividad inventiva de acuerdo con el Art de la Ley de Patente. Informe del Estado de la Técnica Página 6/6