Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo

Transcripción

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2 DEDICATORIA A Dios todo poderoso por su infinito bendición y bondad, por fortalecer mi corazón e iluminar mi mente y por estar conmigo en cada paso que doy; porque él es mi pastor y nada me faltará. A mi madre por ser el pilar fundamental en todo lo que soy, por su apoyo incondicional en todo momento con su grande esfuerzo y por aconsejarme siempre en lograr lo mejor en mi vida profesional y personal. A mis amigos que compartimos momentos inolvidables y nos apoyamos mutuamente durante nuestra vida universitaria alentándome a cumplir mis objetivos. ii

3 AGRADECIMIENTO Al Dr. Manuel R. Rodríguez La cherre profesor principal del área de fitopatología del Departamento de Ciencias Biológicas, Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo. Por su asesoramiento, dirección y apoyo constante en la presente investigación. A mi madre Irma por ser gran ejemplo de perseverancia y constancia que la caracterizan y que me ha infundado siempre; por su valores y motivación constante que me inculca y que me han permitido ser una persona de bien; pero más que nada, por su amor. A mis hermanos por el apoyo sincero y motivador ya que siempre tuvieron palabras de aliento en momentos complicados que juntos y a la distancia pasamos. A mi esposa Silvia Mariana por estar siempre a mi lado por creer en mí y apoyarme directa o indirectamente desde el inicio de mi vida profesional. A mi pequeña hija Valentina Guadalupe por darme alegría siempre que te veo y que veas en mí un ejemplo a seguir. Como no recordar y sentirme muy agradecido por todo lo brindado por ustedes, mi familia. A los profesores de la Escuela de Ciencias Biológicas por sus enseñanzas y conocimientos que me ofrecieron durante mi formación como futuro profesional. A mis grandes amigos de la Universidad Nacional de Trujillo por su amistad sincera y honesta con quienes compartimos buenos y desagradables momentos, y que seguiremos compartiéndolos seguro. Gracias a ustedes! iii

4 AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO Dr. ORLANDO VELÁSQUEZ BENITES Rector Dra. VILMA JULIA MÉNDEZ GIL Vicerrectora Académica Mg. Dr. PEDRO LAVALLE DIOS Secretario General iv

5 AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Dr. HERMES MARIO ESCALANTE AÑORGA Decano Dr. CÉSAR AUGUSTO JARA CAMPOS Profesor Secretario Dr. SEGUNDO ELOY LÓPEZ MEDINA Director de la Escuela Académico Profesional de Ciencias Biológicas v

6 CERTIFICACIÓN DEL ASESOR El que suscribe, en calidad de profesor asesor de la tesis Acción antagónica in vitro de Trichoderma harzianum Rifai. sobre el crecimiento de Botrytis cinerea Pers F. en cultivo de Fragaria vesca L. fresa procedente del caserío de Quirihuac- distrito de Laredo, Provincia de Trujillo, certifica que ésta ha sido desarrollada de conformidad con los objetivos propuestos en su perfil académico y que el informe ha sido revisado y acoge las observaciones y sugerencias alcanzadas. Por lo tanto, autorizo al Br. Roberto Ricaldi Guadalupe a continuar con el trámite de reglamento correspondiente. Dr. MANUEL R. RODRIGUEZ LACHERRE vi

7 PRESENTACIÓN Señores miembros del Jurado Dictaminador: en cumplimiento con las disposiciones reglamentarias vigentes para la obtención de grados y títulos de las Escuela Académica Profesional de Ciencias Biológicas, Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo; someto a vuestra consideración y criterio el presente informe de tesis Acción antagónica in vitro de Trichoderma harzianum Rifai. sobre el crecimiento de Botrytis cinerea Pers F. en cultivo de Fragaria vesca L. fresa procedente del caserío de Quirihuac - distrito de Laredo, Provincia de Trujillo, con la cual pretendo cumplir con los requisitos para optar el título de Biólogo. Trujillo, Julio del 2013 Br. ROBERTO RICALDI GUADALUPE vii

8 MIEMBROS DEL JURADO Dr. MANUEL ROBERTO RODRIGUEZ LACHERRE Presidente Dr. JULIO CHICO RUÍZ Secretario Ms.C. ROGER VENEROS TERRONES Vocal viii

9 APROBACIÓN Los profesores que suscriben, miembros del jurado dictaminador, declaran, que la presente tesis ha cumplido con los requisitos formales y fundamentales, siendo aprobado por UNANIMIDAD. Dr. MANUEL ROBERTO RODRIGUEZ LACHERRE Presidente Dr. JULIO CHICO RUÍZ Secretario Ms.C. ROGER VENEROS TERRONES Vocal ix

10 DEDICATORIA ÍNDICE ii AGRADECIMIENTO iii AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS CERTIFICACIÓN DEL ASESOR PRESENTACIÓN MIEMBROS DEL JURADO APROBACIÓN INDICE RESUMEN ABSTRACT INTRODUCCION 1 MATERIAL Y MÉTODOS 4 RESULTADOS 8 DISCUSIÓN 13 CONCLUSIONES 18 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 19 iv v vi vii viii ix x xi xii ANEXOS 24 x

11 RESUMEN Botrytis cinerea es una especie de hongo causante de la enfermedad podredumbre gris en Fragaria vesca L. fresa, generando grandes pérdidas económicas hasta del 90%. Durante muchos años se han utilizado fungicidas sintéticos para su control; pero, se ha demostrado que se hace resistente a dichos productos, constituyendo un riesgo potencial al ambiente y la salud humana. Esto nos lleva a la búsqueda de alternativas naturales como el empleo de extractos vegetales y antagonistas microbianos, siendo Trichoderma sp. el antagonista más utilizado como control biológico. El objetivo de la investigación fue determinar la acción antagónica in vitro de Trichoderma harzianum Rifai. sobre el crecimiento de Botrytis cinerea Pers F, que proceden del cultivo de Fragaria vesca L. fresa. Se realizaron aislamientos, monocultivos y microcultivos de B. cinerea en medios de cultivo Agar Sabouraud Dextrosa (DSA), para efectuar observaciones macro y microscópicas de las estructuras fúngicas, previa coloración con azul de Amann. Se comprobó el efecto antagónico, mediante la prueba dual, luego de 120 horas de incubación en cultivo dual B. cinerea obtuvo un crecimiento de 4.5 cm y control, alcanzó un crecimiento de 6 cm, con un porcentaje de inhibición del crecimiento micelial radial (PICR) de 34.8%; mientras que, T. harzianum a las 120 horas de incubación en el cultivo dual obtuvo un crecimiento de 5.3 cm y, de manera aislada (control), alcanzó un crecimiento de 8.3 cm, con un mayor porcentaje de inhibición del crecimiento micelial radial (PICR) de 46.1%. De esta manera, se demuestra la capacidad antagónica de T. harzianum; en la prueba de antagonismo; ya que además, de inhibir el crecimiento vegetativo y reproductivo del hongo patógeno, parasita las hifas, destruyéndolas e impidiendo su desarrollo. De este modo, se demuestra que T. harzianum reúne las características para ser utilizado como controlador biológico de B. cinerea. PALABRAS CLAVE: Hongo antagonista, Trichoderma harzianum, Botrytis cinerea, Fragaria vesca. xi

12 ABSTRACT Botrytis cinerea is a species of fungus causing the disease "gray rot" in Fragaria vesca L. "Strawberry", causing major economic losses up to 90%. For many years we have used synthetic fungicides to control, but it has been shown that it is resistant to such products and constitute a potential risk to the environment and human health. This leads to the search for natural alternatives such as the use of plant extracts and microbial antagonists, with Trichoderma sp. more antagonist used as biological control. The objective of the research was to determine the in vitro antagonistic action of Trichoderma harzianum Rifai. on the growth of Botrytis cinerea Pers F, coming from the culture of L. Fragaria vesca "Strawberry", using diseased plants attacked by this fungus fitopatogeno. Also, there were isolates microculture monocultures and B. cinerea in culture media Sabouraud Dextrose Agar (DSA), to make macro and microscopic observations of fungal structures upon Amann Blue staining. We demonstrated the antagonistic effect exerted T. harzianum on the growth of B. cinerea by dual test, after 120 hours of incubation in culture dual B. cinerea growth obtained 4.5 cm and, alone (control), growth reached 6 cm, with a percentage of radial mycelial growth inhibition (PICO) of 34.8%, whereas, T. harzianum at 120 hours of incubation in dual culture achieved a growth of 5.3 cm and in isolation (control), growth reached 8.3 cm, with a higher percentage of radial mycelial growth inhibition (PICO) of 46.1%. Thus demonstrates the antagonistic capacity of T. harzianum; in antagonism test, and furthermore, inhibit the vegetative and reproductive growth of the pathogenic fungus, parasite hyphae, destroying and preventing their development. Thus, it is demonstrated that T. harzianum has the characteristics to be used as biological control agents of B. cinerea. KEYWORDS: Fungus antagonistic, Trichoderma harzianum, Botrytis cinerea, Fragaria vesca. xii

13 INTRODUCCION Fragaria vesca L. fresa es una planta herbácea cultivada en el mundo, que se desarrolla tanto en regiones templadas como tropicales; pero, la mayoría de los cultivos están establecidos en zonas húmedas. El amplio uso de sus frutos, bien como fruta de mesa o como materia prima para procesar mermeladas, helados y muchas cosas más, ha llevado a que evolucione hasta convertirse en uno de los cultivos que tiene mayores niveles de perfeccionamiento a nivel genético y en labores de producción, manejo post cosecha y comercialización 1. En Latinoamérica como en el resto del mundo, existen numerosos hongos que son parásitos obligados o facultativos de las plantas, y constituyen la principal causa de infecciones y enfermedades en ellas. En el Perú el panorama es parecido, encontrándose una gran variedad de hongos que atacan a plantas de interés económico, como Fragaria vesca L. fresa, como los que le causan podredumbre que se caracterizan por producir daños a la planta de la fresa en cualquier etapa de desarrollo, causando grandes pérdidas en la producción, con porcentajes que varían entre el 20% al 90% de acuerdo a las condiciones ambientales y el manejo del cultivo. Varios son los hongos que afectan a la planta, entre éstos tenemos a Fusarium sp, Phytophtora sp., Rhizoctonia sp, Rhizopus sp, Pythium sp, Botrytis sp, Cladosporium sp, Alternaria sp y Penicillium sp. 2 Botrytis cinerea, es un hongo fitopatógeno que causa una de las enfermedades más comunes y que más estragos ocasiona en la fresa, atacando hojas, flores y frutos, produciendo gran cantidad de micelio gris, conidióforos largos y ramificados, que presenta en el extremo apical racimos de conidios ovoides incoloros o de color gris que asemeja a un racimo de uva. El hongo libera fácilmente sus conidios cuando existen condiciones húmedas y, luego éstos, son diseminados por el viento y en el suelo en forma de esclerocio o de micelio, el cual se desarrolla sobre las plantas muertas y en descomposición, muestra actividad a bajas temperaturas (0 a 10 o C) y produce pérdidas considerables en cosechas que se han mantenido almacenadas durante largos periodos; una vez que han germinado las conidias, sus hifas rara vez penetran directamente en los tejidos que muestran un crecimiento activo, haciéndolo principalmente a través de heridas o después de que han formado micelio sobre los pétalos de las flores senescentes, follaje moribundo de las plantas, etc 3,4,5. 1

14 Los métodos de control que se emplea para disminuir el ataque de B. cinerea conocido como el moho gris, son diversos, citándose entre los más importantes el uso de métodos preventivos y prácticas culturales; tales como, la desinfección de semillas, solarización para el control de esclerocios, control de niveles de nitrógeno en el suelo y fundamentalmente el retiro de restos de cultivos afectados por la enfermedad, empleándose también el control químico; sin embargo, aunque el control químico continúa siendo el soporte del manejo de esta enfermedad, recientes estudios han constatado una disminución en la efectividad durante las aplicaciones, debido, al aumento de los niveles de resistencia del patógeno a fungicidas benzimidazoles, dicarboximidas, carbendazimas e hidrocarburos aromáticos, lo que ha conducido a la búsqueda de controladores biológicos por ser más específicos y no tóxicos y porque no contaminan el medio ambiente ni afectan al hombre y animales 6,7,8,9. El control biológico consiste en la utilización de enemigos naturales (predadores, parasitoides, entomopatógenos y antagonistas) para controlar a la población de una plaga y/o enfermedad que produce daño a las plantas, describiéndose a diversas bacterias, nemátodos y hongos como organismos controladores biológicos de un amplio número de plagas y de organismos patógenos de vegetales. Entre los controladores biológicos, destaca Trichoderma sp, como antagónico de hongos fitopatógenos que afectan a cultivos hortícolas 10, 11,12, 13,14. En la naturaleza existen microorganismos antagónicos habitantes del suelo y que son llamados nativos cuando se encuentran desarrollándose en su hábitat natural; a pesar, de las actividades humanas ejercen cierto grado de control biológico sobre organismos fitopatógenos que se desarrollan en su mismo hábitat. Las especies de Trichoderma pueden ser utilizados como microorganismos eficientes biocontroladores de aquellos hongos fitopatógenos que se desarrollan en el área donde se encuentra Trichoderma, ya que son capaces de mantener su viabilidad, patogenicidad, virulencia y habilidad de reiniciar el crecimiento en el suelo, además, de ser adaptadas a su hábitat durante todo el año en rangos propios de temperatura, humedad relativa, ph, etc. 15,16 El género Trichoderma pertenece a los Deuteromycetes que presentan conidióforos complejos y altamente ramificados en forma piramidal o cónica, desde donde se desprenden esporas circulares hialinas, las colonias presentan un crecimiento rápido, al comienzo el micelio es blanco algodonoso para posteriormente tornarse de color verde oscuro o verde limón 2

15 característico de este género. comprende varias especies: T. viride, T. harzianum, T. virens, T. artroviride, T. hamatum, T. koningii, de las cuales la primera ha sido la más estudiada entre numerosos agentes de control biológico, por sus características de antagonismo en condiciones naturales; además, se comporta como hiperparásito frente a un amplio rango de fitopatógenos; entre los cuales, están Alternaria solani. Botrytis cinere, Fusarium oxisporum, Phytophthora capsici, Phytium sp, Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfssi, Sclerotium cepivorium, Sthepmhylium vesicarium, Sclerotinia minor, Venturia inaequalis. 17,18,19 Trichoderma como antagonista tiene diferentes mecanismos de acción, entre los que se encuentran el micoparasitismo, la competencia por el sustrato y nutrientes, y la actividad antibiótica producida por metabolitos que inhiben la actividad parasítica de los fitopatógenos. Se ha demostrado que Trichoderma es capaz de colonizar las flores de la vid desplazando al patógeno de su habitual sitio de infección, lo que constituye la principal forma de antagonismo contra Botrytis cinerea; además, produce enzimas líticas (quitinasas y gluconasas) capaces de degradar la pared celular de este patógeno. 20,21 Numerosos estudios realizados en cultivos de albahaca, garbanzo, frutilla, frambuesa, cebolla, tomate, bulbos de flores, especies de eucaliptos y uva, han mostrado la efectividad de Trichoderma sp sobre B. cinerea, y que en algunos casos ha sido superior que los fungicidas recomendados para el cultivo. 22,23 Por lo expuesto; se desea investigar la acción antagónica de T. harzianum,en particular, como agente de control biológico, dada sus características de ser eficaz contra hongos fitopatógenos que atacan órganos aéreos y subterráneos de algunos cultivos,24,25,26 En nuestro medio, no se ha reportado trabajo alguno sobre el control biológico de T. harzianum sobre B. cinerea productor de podredumbre gris, en cultivos de Fragaria vesca L. fresa ; es por ello, que se ha creído conveniente realizar el presente trabajo de investigación que tiene como objetivo determinar la acción antagónica in vitro de Trichoderma harzianum sobre el crecimiento de Botrytis cinerea en cultivo de Fragaria vesca L. fresa, teniendo en cuenta el peligro potencial que representa para la salud pública la acción de este hongo, como causante de daño y productor de micotoxinas en la parte comestible. 3

16 MATERIAL Y MÉTODOS 1. MATERIAL DE ESTUDIO. 30 plantas de Fragaria vesca fresa con signos característicos de Botrytis cinerea, recolectadas del caserío de Quirihuac-distrito de Laredo, provincia de Trujillo. La cepa de Trichoderma harzianum se obtuvo del Servicio Nacional de Sanidad Agrícola (SENASA-Perú). 2. PROCEDIMIENTO. 2.1 Recolección de la muestra 27. Se recolectaron plantas de F. vesca fresa que presentaban signos y síntomas de enfermedad fúngica, como: pudrición, presencia de esporas. Las plantas (hojas, tallos y frutos) fueron transportadas en bolsas de papel, etiquetadas y acondicionadas en una caja de cartón. Fig 1: Plantas de F. vesca fresa con presencia de signos y síntomas de enfermedad fúngica, como: pudrición y presencia de esporas. 4

17 2.2. Aislamiento y obtención de B. cinerea. 28,29 De cada muestra recolectada se tomó una porción de micelio y se sembró por puntura en las placas Petri, las cuales contenían Agar Sabouraud Dextrosa (DSA). Las colonias cuya determinación correspondieron a B. cinerea se sembraron en tubos de penicilina (técnica de agar inclinado) e incubadas durante cinco días a temperatura ambiente, para obtener el cultivo puro Determinación de B. cinerea. Se llevó a cabo, teniendo en cuenta las características de las macrocolonias y los microcultivos de B. cinerea, y se determinaron utilizando las claves taxonómicas especializadas. 30, Obtención de cultivo puro de T. harzianum. 32 Se realizó siguiendo el procedimiento correspondiente para obtención de la cepa de T. harzianum, establecido por el Servicio Nacional de Sanidad Agrícola (SENASA).De la cepa que estaba creciendo sobre granos de arroz Anexo (fig 11), una vez en laboratorio, se aislaron las fructificaciones fúngicas (conidias) y se sembraron en cinco placas Petri previamente rotulados y esterilizadas, que contenían Agar Sabouraud Dextrosa (DSA). Luego se llevaron a incubación en temperatura ambiente por un período de cinco (5) días, a fin de obtener cultivo puro de T. harzianum. 3. Control biológico in vitro (Prueba de antagonismo o cultivo dual ). 33 La prueba de antagonismo se realizó empleando la técnica de cultivo dual en placas Petri, para lo cual se tuvo en cuenta lo siguiente: Utilizando 10 placas Petri conteniendo 10 ml de Agar Sabouraud Dextrosa (DSA), previamente esterilizados, se sembró en un extremo de la placa el inóculo del cultivo de B. cinerea; en el otro extremo de la placa, se sembró el inóculo del cultivo de T. harzianum a una distancia entre ambos hongos de 9 cm. Asimismo, se sembró en 6 placas Petri con DSA, al antagonista y al hongo fitopatógeno por separado, constituyéndose en los respectivos controles. Posteriormente, los cultivos se incubaron a temperatura ambiente, durante 5 días, haciéndose mediciones cada 24 horas del crecimiento radial del micelio correspondiente. 5

18 El antagonismo de T. harzianum se comprobó estudiando las variables. Radio de Crecimiento Antagonista (RCA), Radio de Crecimiento Patógeno (RCP) y Porcentaje de Inhibición del Crecimiento Radial (PICR), empleando la fórmula de Ezziyyani 34 : PICR = (R1 R2) x 100, R1 Dónde: R1= Radio del patógeno testigo. R2= Radio del patógeno en el enfrentamiento. Para indicar el micoparasitismo (MICMO) como posible mecanismo de acción de T. harzianum, se realizaron observaciones macroscópicas del cultivo dual, tomándose como índice de micoparasitismo, la invasión del antagonista sobre la superficie del micelio del hongo fitopatógeno, teniéndose en cuenta la escala de Bell et al (1982), citada en Ezziyyani (2004) 34 ; con la siguiente calificación: Antagonismo tipo 1: Antagonista crece completamente sobre la colonia del patógeno y cubre la superficie del medio de cultivo. Antagonismo tipo 2: Antagonista crece al menos sobre las dos terceras partes de la superficie del medio de cultivo. Antagonismo tipo 3: Antagonista y el patógeno cubren aproximadamente la mitad de la superficie del medio de cultivo. Antagonismo tipo 4: El patógeno crece al menos en las dos terceras partes del medio de cultivo imitando el crecimiento de Antagonista. Antagonismo tipo 5: El patógeno crece sobre la colonia de Antagonista, ocupando toda la superficie del medio de cultivo. Así mismo, señala que el Antagonista que presenten antagonismo tipo 1 ó 2 se considera como altamente antagonista. Luego que T. harzianum alcanzó a invadir el micelio de B. cinerea, se tomó una porción del micelio en la línea de contacto entre los 2 hongos, y con la ayuda de un microscopio compuesto a 400x, se analizaron las interacciones de las hifas antagónicas colocándolas 6

19 en un portaobjetos con una gota de azul de Amann, y se observó el mecanismo de acción antagónica del biocontrolador. 4. Diseño experimental. 35 Se realizó un diseño al azar, con un número de 3 tratamientos y 10 repeticiones por tratamiento, incluyendo a un testigo (control) de cada uno, que permitan obtener los mejores resultados. DISEÑO EXPERIMENTAL TIPO DE CULTIVO COMBINACIONES TRATAMIENTOS Monocultivos Trichoderma harzianum (testigo) T 1 Botrytis cinerea (testigo) T 2 Cultivo dual T. harzianum vs B. cinerea T 1 X T 2 = T 3 7

20 RESULTADOS Las plantas de F. vesca L. fresa recolectadas presentaron signos y síntomas caracteristicos de una enfermedad fúngica, como: pudrición, presencias de esporas, en la zona de estudio. Luego, del análisis fitopatológico se aisló y determinó a B. cinerea (Pers.)F. como el causante de enfermedad de la planta Anexo(Figura 9). Según la comparación diaria del radio del crecimiento antagonista (RCA), con el radio de crecimiento del hongo fitopatógeno (RCP) de cada cultivo dual, se determinó la competencia por nutrientes y espacio, donde T. harzianum creció a una velocidad superior a la de B. cinerea, observándose que a las 120 horas en el cultivo dual B. cinerea obtuvo un crecimiento de 4.5 cm y, de manera aislada (control), alcanzó en el mismo número de horas un crecimiento de 6 cm; mientras, que T. harzianum a las 120 horas en el cultivo dual obtuvo un crecimiento de 5.3 cm y de manera aislada (control) su crecimiento fue de 8.3 cm; como se observa en la Tabla 1 y Figura 4,5. La inhibición de T. hazianum sobre el crecimiento de B. cinerea en F. vesca fresa al sexto día (144 horas), se presentó de la siguiente manera: T. harzianum mostró el mayor porcentaje de inhibición del crecimiento micelial radial (PICR) de 46.1%; en cambio, B. cinerea presentó un menor porcentaje de inhibición del crecimiento micelial radial (PICR) de 34.8%, como se observa en la Tabla 2 y Figura 6. Luego de las observaciones microscópicas realizadas con la ayuda del microscopio compuesto OLIMPUS, se determinó que el mecanismo de acción antagónica de T. harzianum sobre B. cinerea hongo fitopatógeno en la planta de F. vesca fresa, fue el de micoparasitismo; ya que, las hifas de T. harzianum cubrieron a las hifas de B. cinerea, creciendo sobre el micelio del hongo controlado, correspondiendo a un antagonismo tipo 2, donde el antagonista crece al menos sobre las dos terceras partes de la superficie del medio de cultivo (según la escala de Bell et al (1982), citada por Ezziyyani (2004), 34 como se observa en la Figura 7E; asimismo, se observó la penetración de las hifas de T. harzianum sobre las hifas de B. cinerea, como se observa en la Figura 8. 8

21 400 X Figura 2: Observación microscópica de conidioforos y conidias (microcultivo sin coloración). 400 X T. harzianum Figura 3: Observación microscópica de conidióforos y conidias de B. cinerea. (microcultivo con coloración de azul de Amann). 9 de T. harzianum B. cinerea

22 Tabla 1. Promedio del crecimiento micelial radial (cm) en la prueba de antagonismo y crecimiento de la prueba control (cm) de T. harzianum y B. cinerea, tomado cada 24 horas. PRUEBA DE ANTAGONISMO PRUEBA CONTROL HORAS B. cinerea T. harzianum B. cinerea T. harzianum 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h h Fuente: Datos obtenidos en trabajo de laboratorio y gabinete. cm CRECIMIENTO EN LA PRUEBA DUAL Horas 24h 48h 72h 96h 120h Leyenda: B. cinerea T. harzianum Figura 4. Crecimiento micelial radial (cm) en la prueba de antagonismo de T. harzianum y B. cinerea, tomado cada 24 horas x 5 dias. 10

23 12 (cm) CRECIMIENTO CONTROL 10 8 Leyenda: h 1 48h 2 72h 3 96h 4 120h 5 144h 6 Figura 5. Crecimiento de la prueba control (cm) de T. harzianum y B. cinerea, tomado cada 24 horas x 6 dias. Tabla 2. Porcentaje de inhibición del crecimiento radial (PICR) de T. harzianum y B. cinerea, tomado cada 24 horas x 6 dias. Horas (h) B. cinerea T. harzianum 24 7% 12.7% % 26.3% % 31.25% % 34.2% % 36.1% % 46.1% Fuente: Datos obtenidos en trabajo de laboratorio y en gabinete. B.cinerea T.harzianum T. harzianum Horas 11

24 50% PORCENTAJE DE INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO RADIAL (PICR) 45% 40% 35% 30% 25% 20% 15% 10% 5% 0% 24h 1 48h 2 372h 496h 120h 5 144h 6 B. cinerea Botrytis cinerea Trichoderma harzianum T. harzianum Horas Leyenda: Figura 6. Porcentaje de inhibición del crecimiento radial (PICR) de T. harzianum y B. cinerea, tomado cada 24 horas x 6 dias. 12

25 7A: 24 horas horas 7B: 48 horas 7C: 72 horas 7D: 96 horas 7E: 120 horas B. cinerea T. harzianum Figura 7. Observación macroscópica del cultivo dual de T. harzianum y de B. cinerea a los 5 días de incubación a temperatura ambiente en Agar Sabouraud Dextrosa. A) A las 24 horas B) A las 48 horas. C) A las 72 horas. D) A las 96 horas. E) A las 120 horas, en la cual se observa que presenta una clase de antagonismo tipo 2. 13

26 T. harzianum B. cinerea 400 x Figura 8. Observación microscópica del micoparasitismo de T. harzianum sobre B. cinerea: Penetración de las hifas de T. harzianum a las hifas de B. cinerea. 14

27 DISCUSION Según los resultados obtenidos, la presencia de signos y síntomas de la enfermedad causada por el hongo B. cinerea; es decir, podredumbre gris en la planta de F. vesca L. fresa en estudio, se debería a que la planta es muy susceptible a los daños físicos y al deterioro de las hojas, flores y frutos por agentes externos como insectos y cambios de temperatura; es por ello, que su manejo tiene que ser muy cuidadoso, ya que el medio ambiente donde se desarrolla contiene un alto porcentaje de humedad, óptimo para el desarrollo de este hongo patógeno; concordando. 2 Con respecto a la inhibición del crecimiento in vitro de B. cinerea procedente de la planta de F. vesca L. fresa por el hongo antagonista T. harzianum, en la prueba de antagonismo, se debería por diversos mecanismos, destacándose la producción de compuestos inhibitorios al medio, antibiosis por producción de metabolitos entre los cuales se encuentran, pirones, isocianatos pépticos, y trichocinas; además, la producción de enzimas tales como peptinasas, cutinasas, glucanasas, y quitinasas e inactivación de las misma hacia el patógeno. 14,26 Según Molina et al 16 ; cuando un hongo antagonista reduce la colonización y la esporulación de un patógeno, permite predecir que ha iniciado su actividad antagónica oportunamente; así mismo, Arzate et al 12, describen luego de evaluar aislamientos de Trichoderma que los cultivos con clase de antagonismo tipo 1 y 2 presentan buenas perspectivas para ser utilizadas en campo; en este sentido, Fernandez et al 10 sostiene que el género Trichoderma es un agente de control biológico muy eficiente puesto que presenta una alta velocidad de crecimiento, abundante esporulación y una amplia gama de sustratos donde pueden crecer debido a la riqueza de enzimas que posee; además, menciona que la habilidad de Trichoderma como excelente competidor por espacio y recursos nutricionales se debe a la presencia en forma natural de este hongo en diferentes tipos de suelos antagonista. que evidencia el amplio rango de hospedante de este Al respecto, Mont, 32 refiere que T. harzianum tiene una alta capacidad de competencia por el substrato; como consecuencia de ello, el organismo afectado tiende a entrar en un estado de latencia, que podría ser por deficiencia de nutrientes o la presencia de cierto 15

28 nivel de sustancias inhibitorias, lo cual impide que siga creciendo; coincidiendo, con los resultados obtenidos en el presente trabajo. Según Ordoñez, 36 afirma que T. harzianum produce sustancias como trichodermina, dermina, sesquiterpeno, suzukacilina, alamethicina, rochotoxina y acetaldehído, todas con propiedades antifúngicas y antibacteriales; así como, las enzimas β-1-3 glucanasas, quitinasas y celulasa, las cuales facilitan la habilidad del antagonista para atacar un amplio rango de fitopatógenos, ejerciendo su efecto sobre las paredes celulares. Asimismo, Ezziyani, 34 refiere que T. harzianum presenta una gran adaptabilidad a diferentes temperaturas del medio ambiente, pudiendo crecer y reproducirse normalmente hasta los 35ºC, a este nivel estas enzimas juegan un importante papel en el micoparasitismo. De la misma manera T. harzianum mostró una alta capacidad para parasitar (micoparasitismo) a B. cinerea; al presentar una alta actividad competitiva frente al fitopatógeno, impidiendo su crecimiento en el mismo substrato. Al respecto, se debe tener en cuenta que el micoparasitismo es un proceso complejo de quimiotropismo cuya acción antifúngica específica es desconocida; sin embargo, se ha propuesto una serie de etapas por la que T. harzianum lleva a cabo el antagonismo, las cuales son: (a)reconocimiento, (b) penetración de la hifa, (c) invasión y secreción de enzimas hidrolíticas, como lo sostienen Vázquez-Garcidueñas et al 24 ; siendo éste último el de mayor interés, ya que no se ha determinado con exactitud el mecanismo mediante el cual se controla la expresión de cada una de las enzimas involucradas; así como, su orden. Durante la etapa de reconocimiento, se lleva a cabo un proceso de quimiotropismo, el cual es mediado por el reconocimiento de lectinas, que se encuentran incorporadas en el hongo fitopatógeno, y cuando el micoparásito reconoce al hongo, las hifas de T. harzianum lo atrapan y lo rodean formando estructuras apresorios, como lo sostienen Hernández-Lauzardo et al. 25 En cuanto a la penetración de la hifa, ésta se realiza mediante la degradación de la pared celular del hongo fitopatógeno, por medio de la secreción de enzimas que actúan sinérgicamente y a las que se les denomina en conjunto como las enzimas degradadoras de pared celular, conformado por β-1,3-glucanasas, quitinasas y proteasas, las cuales se 16

29 inducen por la presencia de las paredes celulares de hongos fitopatógenos, como lo afirma Ordoñez. 36 Hernández-Lauzardo et al 25, al respecto señalan, que en el micoparasitismo, la formación y secreción de estas enzimas es el paso fundamental para la destrucción del hongo fitopatógeno, y que el mecanismo de acción del hongo antagonista, que en éste caso es T. harzianum, puede ser variable y depende del hongo a controlar y del aislamiento; así como, de la especie de Trichoderma utilizada. De esta manera se demuestra la capacidad antagónica que tiene T. harzianum L. sobre B. cinerea en condiciones de laboratorio; ya que además, de inhibir el crecimiento vegetativo, parasitan las hifas, destruyéndolas e impidiendo su desarrollo. 17

30 CONCLUSIONES T. harzianum demostró en la prueba de cultivo dual in vitro, ser un efectivo controlador biológico de B. cinerea, inhibiendo el crecimiento de este hongo fitopatógeno, con una clase de antagonismo tipo 2 (Según la escala de Bell et al (1982), citada en Ezziyyani (2004). T. harzianum presentó el mayor porcentaje de inhibición del crecimiento micelial radial (PICR) de 46.1%; en cambio, B. cinerea presentó un menor porcentaje de inhibición del crecimiento micelial radial (PICR) de 34.8%. T. harzianum realizó el micoparasitismo como mecanismo de acción antagónica. 18

31 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. MOSTACERO, J & MEJÍA F. Taxonomía de Fanerógamas Peruanas. Edit. Libertad E.I.R.L. Trujillo-Perú ALEXOPOULOS C; MIMS C. Introducción a la Micología. Edit. Omega S.A. Barcelona, España AGRIOS, C. Fitopatología. 3ª ed. Edit. Limusa S.A. México D.F FERNÁNDEZ E. HERNÁNDEZ S. SOLÓRZANO E, FERNÁNDEZ A, LORENZO M. concentraciones de NaH 2 PO 4 en la inducción de resistencia del tomate frente al hongo Alternaria Solani, (CENSA) Revista Protección Vegetal 11 (2) :( ) PARIONA, D.; C. HIGAONNA; B. MATOS. Enfermedades en hortalizas. Edit. Instituto Nacional de Investigación Agraria. Dirección General de Investigación Agraria. Lima-Perú MOLINA G; ZALDÚA S; GONZÁLES G; SANFUENTES E. Selección de hongo antagonista para el control biológico de Botrytis cinerea en viveros forestales en Chile, Bosque, 27(2): ) HOWELL C. Mechanismo employed by Trichoderma species in the biological control of plant diseases: the history and evolution of current concepts Plant diseases. Costa Rica, 87(1) :(4-10) LIECKFELDT, E., SAMUELS, G.J. & NIRENBERG, H.I. Amorphological and molecular perspective of Trichoderma viride: is it one or two species Applied and Environmental Biology. 65: ( ) PAPAVIZAS G. Trichoderma and Gliocladium: Biology, Ecology, and potencial for biocontrol. Annual Review of Phytopathology. 23: (23-54) FERNÁNDEZ J,SUÁREZ C. Antagonismo in vitro de Trichoderma harzianum Rifai sobre Fusarium oxysporium Schlecht. F. Passiflorae sp en maracuyá (pasiflora edulis Sims var. Flavicarpa) del municipio zona bananera colombiana. Rev. Fac. Nal. Agr. Medellín. 62(1) :( )

32 11. HERMOSA R, GRONDONA I, DIAZ M, ITURRIAGA E, MONTE E. Development of a strain specify scar marker for the detection of Trichoderma atrovidiride a biological control agent against soilborne fungal plant pathogens. Current Genetics. Costa Rica. Disponible 38(6):( ) Disponible en: ARZATE J, CASIMIRO A, DOMINGO V, SANTOS O. Antagonismo de Trichoderma spp. sobre Mycospharella fijiensis Morelet, Agente causal de la Sigoteca Negra del Plátano (Musa sp.) in vitro e invernadero. Revista Mexicana de Fitopatología 24 (002): (98-104) Disponible en: ALVAREZ A, HYLIN J, OGATA N. Postharvest diseaseas of papaya reduced by biweekly orchard sprays. Plant Dis. Resp. 61:( ) Disponible en: BERNAL A, ANDREÚ C. Utilización de Trichoderma spp. Como alternativa ecológica para el control de Botrytis cinerea Schlecht F. spp cubense (e.f. Smith) Snyd & Hans Disponible en: MENJIVAR R. Estudio del potencial antagonista de hongos endofiticos para el biocontrol del nematodo barrenados Radopholus similisen plantaciones de bananos en Costa Rica. Centro agronómico tropical de investigación y enseñanza. Turrialba, Costa Rica UMAÑA G. Control biológico de enfermedades postcosecha de frutas. Centro de Investigaciones Agronómicas. X Congreso Nacional Agronómico. III Congreso de Fitopatología. Universidad de Costa Rica GHISALBERTÍ L. Antifungal antibiotics produced by Trichoderma spp. Soil Biology and Biochemistry. Costa Rica. Disponible, 23: ( ) Disponible en: 20

33 18. GONZÁLES H; RODRÍGUEZ L; ARJONA C; PUERTAS A; FONSECA M. efecto de aplicación de Trichoderma harzianum R. sobre la composición cuantitativa de bacterias, hongos y actinomicetos de la rizosfera de solanáceas y su influencia en el crecimiento vegetativo. Investigación Agrícola: Productividad y Protección Vegetal. 14 (1_2): ( ) HANNAN G. Trichoderma sp. Including T. harzianum T, virtde T, Koningil and T. hamatum. Deuteromycetes, Moniliales (asexual classification system): Universidad de Costa Rica; Disponible en: HIDALGO N, Uso de Trichoderma spp. En combate biológico. San José. Universidad de Costa Rica; Disponible en: ELAD Y, BAKER R, The role of competition for iron and carbon in suppressions o Chlamidospore germination of Fusarium spp. By Pseudomonas spp. Annual Review of Phytopathology.75: ( ) BELANGER R, DUFUOR N, CARON J, BENHAMOU N, Chronological events associated with the antagonistic properties of Trichoderma harzianum against Botrytis cinerea: Indirect evidence for sequential role of antibiotics and parasitism. Biocontrol Science Technology Universidad de Costa Rica.5(41_45) VAZQUES-GARCIDUEÑAS, S., LEAL-MORALES, C. Y HERRERA- ESTRELLA, A. Analysis of the β-1, 3-glucanolytic system of the biocontrol agent Trichoderma harzianum. App. Environ. Microbiol.64 (4): ( ) HERNÁNDEZ-LAUZARDO A, S. BAUTISTA-BAÑOS, M. VELÁSQUEZ-DEL VALLE. Uso de microorganismos antagonistas en el control de enfermedades postcosecha en frutos. Rev. Mex. Fitopatol. 25: (66-74) DURÁN, E., F. ROBLES, J. MARTÍNEZ Y M. BRITO. Trichoderma, un hongo combatiente de patógenos. Revista Técnico Ambiental: Teorema ambiental. Bogotá- Colombia

34 26. HARMAN, G.E. & KUBICEK, C.P. (Eds.) Trichoderma and Gliocladium. Vol. 2. Enzymes, biological control and commercial applications Taylor & Francis, London. 393 pp RIMAR S, OLIVERA N, In vitro antagonistic potential of Trichoderma sp against Botrytis cinerea agent of antracnose in the passion fruit (Passiflora). Rev. American Mycophatologia.Universidad de Costa Rica. 13:( ) GÓMEZ H, SOBERANIS W, TENORIO M, TORRES E, MARTINES A, Manual de producción y uso de hongos antagonistas. Laboratorio de antagonistas Servicio de Sanidad Agraria (SENASA). Perú ECHANDI, E. Manual de Laboratorio de Fitopatología General. Edit. Herrero Hnos. Sucesos S.A. México, D.F BARNETT L, HUNTER B. Illustrated Genera of Imperfect Fungi 4ta ed. The American Phytopathological Society. Minnesota.U.S.A GILMAN J. Manual de hongos del suelo. Edit. Continental S.A México MONT, R. Manejo integrado de las enfermedades de las plantas. SENASA. Lima- Perú. pp HOWELL, C. R. Mechanisms employed by Trichoderma species in the biological control of plant diseases: The history and evolution of current concepts. Plant Diseases. Universidad de Costa Rica; 87(1): (4-10) SID AHMED A, EZZIYYANI M, PÉREZ C, CANDELA M, Effect of chitin on biological control activity of Bacillus spp. And Trichoderma harzianum against root rot disease in pepper (Capsicum anuum) plants. European Journal of Plant Parhology Disponible en: &lng=es 35. BOCANEGRA, F. Bases metodológicas de la investigación científica. Edit. Publi- Ciencia. Trujillo, Perú

35 36. ORDOÑEZ, V. Producción de enzimas microbianas y sus aplicaciones en la industria. II Congreso internacional de Microbiología Industrial. Pontificia Universidad Javeriana. Colombia DEACON, J. Introducción a la Micología Moderna. Edit. Limusa S.A. México MOSSEL, D. & B. MORENO. Microbiología de los alimentos. 2ª ed. Editorial Acribia S.A. Zaragoza-España

36 ANEXOS 24

37 Fig 9: Recolección de la plantas de Fragaria vesca L fresa procedente del caserío de Quirihuac- distrito de Laredo, Provincia de Trujillo. 25

38 1. 1.Realización de la siembras en frasco de penicilina las cuales contenían Agar Sabouraud Dextrosa (DSA) Realización de la siembra por puntura en las placas Petri, las cuales contenían Agar Sabouraud Dextrosa (DSA). 2. Mediante la técnica de agar inclinado e incubadas durante cinco días a temperatura ambiente se pudo aislar al B. cinerea. 4. B. cinerea B. cinerea 4. Cultivo puro de B. cinerea en placas Petri. 2. Fig 10: Eventos de aislamientos de B. cinerea de la planta de Fragaria vesca L fresa recolectada en el campo. 26

39 Cepa de T. harzianum, enviada por el Servicio Nacional de Sanidad Agrícola (SENASA), cepa que estaba creciendo sobre granos de arroz. 3. T. harzianum 3. Cultivo puro de T. harzianum en placas Petri. 2. Disolución de 10 gr de arroz con 10 ml a agua destilada, para de esta manera, aislar las fructificaciones fúngicas (conidias) y sembrar en placas Petri. Fig 11: Obtención de T. harzianum procedente de Servicio Nacional de Sanidad Agraria (SENASA-PERU). 27

40 1. 1.Utilización de materiales de seguridad para evitar la contaminación del cultivo. B cinerea Siembra en las placas Petri las cuales contenían Agar Sabouraud Dextrosa (DSA). B. cinerea VS T. harzianum 3. Control biológico in vitro (Prueba de antagonismo o cultivo dual y control. 2. Fig 12: Técnica del cultivo dual, a nivel macroscópico de T. harzianum sobre B. cinerea. 28

41 Tabla 3: Toma de datos de control biologico in vitro en prueba de antagonismo o cultivo dual. Crecimiento de los hongos a las 24 horas realizada la siembra. Número de placas T. harzianum B. cinerea Promedio Total

42 Crecimiento de los hongos a las 48 horas realizada la siembra. Número de placas T. harzianum B. cinerea Promedio Total

43 Crecimiento de los hongos a las 72 horas realizada la siembra. Número de placas T. harzianum B. cinerea Promedio Total

44 Crecimiento de los hongos a las 96 horas realizada la siembra. Número de placas T. harzianum B. cinerea Promedio Total

45 Crecimiento de los hongos a las 120 horas realizada la siembra. Número de placas T. harzianum B. cinerea Promedio Total

46 Tabla 4 : Resultados de la evaluación de porcentaje de inhibición del crecimiento radial (PICR) de T. harzianum y B. cinerea. Dónde: PICR = (R1 R2) x 100 R1 R1 = Radio del patógeno testigo. R2 = Radio del patógeno en el enfrentamiento. Botrytis cinerea PICR (24 horas) = ( ) = 7 % (0.7 X 100)% PICR (48 horas) = ( ) = 14.3 % (1.4 X 100)% PICR (72 horas) = ( ) = 18.5 % (2.7 X 100)% PICR (96 horas) = ( ) = 22.2 % (4.5 X 100)% PICR (120 horas) = ( ) = 25 % (6.0 X 100)% PICR (144 horas) = ( ) = 34.8 % (6.9 X 100)% 34

47 Trichoderma harzianum PICR (24 horas) = ( ) = 12.5 % (0.8 X 100)% PICR (48 horas) = ( ) = 26.3 % (1.9 X 100)% PICR (72 horas) = ( ) = % (3.2 X 100)% PICR (96 horas) = ( ) = 34.2 % (6.2 X 100)% PICR (120 horas) = ( ) = 36.1 % (8.3 X 100)% PICR (144 horas) = ( ) = 46.1 % (9.8 X 100)% 35