AREA DE PRODUCCION AGRICOLA

Transcripción

1 Proyecto núm. SC PUESTA A PUNTO DE TECNICAS DE CULTIVO DE TEJIDOS IN VITRO PARA LA MEJORA GENETICA Y CONSERVACION DE GERMOPLASMA DE AGRIOS Equipo Investigador Luis Navarro Lucas (Dr. I.A.); Nuria Durán-Vila (Dra. I.A.); Juana María Arregui García (I.A.); José Juárez Roldán (I.T.A.); José Francisco Ballester-Olmos (I.T.A.); Leandro Peña (Dr. C.B.); Ana María Galiana Balaguer (I.A.); Rosa María Pérez-Clemente (I.A.); Magdalena Cervera (L.B.); Oscar Olivares (L.B.); Joaquín Arnau (I.A.). Equivalente de jornada completa: 3,40 Centro de Investigación Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias. (IVIA). Valencia Duración: Enero, Diciembre, Coste: Miles de pesetas: Financiación INIA: 100% 217

2 PLANTEAMIENTO Y OBJETIVOS El material vegetal es el factor más importante de la citricultura española. La disponibilidad de variedades de calidad de las distintas especies a lo largo de la campaña es imprescindible, debido a que se dedica la producción a la exportación en fresco (somos el primer país exportador del mundo) y es necesario mantener una oferta continua en los mercados. Además, la explotación del potencial genético de patrones y variedades requiere la ausencia de patógenos transmisibles por injerto y la resistencia o tolerancia a factores de estrés. Hasta el momento de iniciar este proyecto, nuestro grupo se había dedicado principalmente a la realización de un Programa de Mejora Sanitaria de Cítricos, que incluía la obtención de plantas libres de patógenos de variedades españolas, la importación de variedades de otros países mediante procedimientos de cultivo de tejidos vegetales in vitro, el establecimiento de un banco de germoplasma de plantas sanas y la distribución de las mismas a los agricultores. Los objetivos globales de este Programa se habían cubierto con creces, ya que se habían obtenido plantas sanas de todas las variedades españolas de interés comercial, se habían importado las variedades de mas calidad de otros países y se había constituido un amplio banco de germoplasma del que proceden todas las variedades propagadas actualmente por los viveros comerciales. A pesar de las enormes contribuciones de este programa en cuanto a disponibilidad de variedades sanas de calidad, el problema del material vegetal para la citricultura española no está totalmente resuelto debido a los siguientes factores: Inexistencia de variedades de las distintas especies que permitan una producción de fruta de calidad a lo largo toda la campaña de producción, con la finalidad de mantener una oferta constante en los mercados internacionales. Hay una excesiva concentración de variedades tempranas que maduran entre mediados de Septiembre y mitad de Febrero, lo que provoca un exceso de oferta en esta época y un desabastecimiento de los mercados en el resto del año. Este problema se ha resuelto de forma bastante satisfactoria en naranjos mediante la importación de variedades de otros países. En el caso de las mandarinas el problema se ha intentado resolver mediante la implantación de mandarinos híbridos tardíos, como Fortune, Nova, Ellendale u Ortanique. Estos mandarinos no producen semillas en plantaciones aisladas 218 debido a que son autoincompatibles. Sin embargo, son compatibles con las variedades de clementino tradicionalmente cultivados, lo que provoca la formación de semillas en ambos grupos de variedades. Dado que la carencia de semillas es un requisito imprescindible para la exportación de fruta fresca, la problemática de la estructura varietal de los mandarinos sigue sin resolverse. El patrón citrange Carrizo se usa en mas del 90% de las nuevas plantaciones, con lo que se está llegando en la práctica a una situación de monocultivo. Esto coloca a la citricultura en una posición muy vulnerable frente a la hipotética aparición de plagas y enfermedades específicas de este patrón. Seria deseable disponer de nuevos patrones resistentes y/o tolerantes a plagas, enfermedades y fisiopatías. Las razas de tristeza existentes en España son relativamente suaves, ya que solo producen daños a mandarinos, naranjos y pomelos cuando están injertados sobre naranjo amargo y se controlan fácilmente mediante la utilización de patrones tolerantes. Sin embargo, la experiencia de otros países indica que pueden aparecer razas severas por mutación de las existentes o por introducción accidental con material vegetal importado clandestinamente. Estas razas producen daños incluso a los árboles con patrones tolerantes. El banco de germoplasma de cítricos existente es la fuente de material vegetal para la propagación comercial y para numerosos trabajos de investigación. Sin embargo, los cítricos tienen semillas recalcitrantes, por lo que el mantenimiento del mismo se realiza en forma de plantas vivas, lo que conlleva el peligro de perdida de genotipos por diversos problemas, que van desde accidentes de cultivo, riesgos climatológicos o infección por patógenos. Para la solución de estos problemas a medio/largo plazo es necesaria la realización de programas continuos de mejora genética. Sin embargo, la mejora clásica de los cítricos tiene muchos problemas debido a la biología reproductiva compleja (apomixis, esterilidad parcial o total, autoincompatibilidad, elevada heterocigosis, desconocimiento genético básico y largo periodo juvenil). La aparición y rápido desarrollo de nuevas biotecnologías permite vislumbrar la posibilidad resolver los problemas de la mejora clásica de los cítri-

3 cos y encontrar nuevas vías para la conservación de germoplasma. En este contexto, se planteó el proyecto de investigación con el objetivo de explorar las posibilidades de distintas biotecnologías basadas en el cultivo in vitro para mejora genética y conservación de germoplasma cítricos. Un objetivo adicional también importante era la búsqueda de nuevas áreas de investigación para reorientar parte de la actividad de nuestro grupo de trabajo, una vez resueltos los problemas mas importantes del saneamiento de variedades. Los objetivos concretos que se establecieron fueron los siguientes: 1. Obtención de híbridos triploides. Las plantas trípodes no producen semillas y no presentan problemas de polinización cruzada con otras variedades. La obtención de híbridos triploides se planteó por dos vías: a) obtención de parentales tetraploides (mediante cultivo de óvulos in vitro en presencia de colchicina) para el posterior cruzamiento con parentales diploides y b) obtención directa de híbridos triploides mediante cultivo de endospermos. 2. Aislamiento, cultivo y fusión de protoplastos. La fusión de protoplastos permite la obtención de híbridos somáticos allotetraploides, que pueden usarse directamente para la mejora de patrones o como parentales para la obtención de híbridos sexuales triploides. 3. Transformación genética de cítricos. La transformación genética se vislumbra como la tecnología de mejora más importantes del futuro. Permite la introducción en una planta de genes específicos que pueden conferir resistencia y/o tolerancia a plagas, enfermedades o fisiopatías o modificar otros caracteres de calidad sin alterar el resto de las características de la planta. En el proyecto se pretendía explorar las distintas vías posibles de transformación de cítricos para establecer una tecnología que permitiese en el futuro introducir genes de interés agronómico. 4. Crioconservación La conservación en nitrógeno líquido de células y tejidos se vislumbra como la alternativa más adecuada en cuanto costo y seguridad para la conservación a largo plazo de genotipos de especies con semillas recalcitrantes. En el proyecto se planteó un estudio sobre la viabilidad de la crioconservación, haciendo uso de un equipo de congelación programable, de diversos tejidos de cítricos para la conservación de germoplasma de forma complementaria o alternativa a la conservación de plantas vivas. RESULTADOS 1. OBTENCION DE HIBRIDOS TRIPLOIDES 1.1. Puesta a punto de métodos de análisis de la ploidía El conteo de cromosomas en cítricos es muy difícil, debido al pequeño tamaño de los mismos y al escaso número de células en metafase que se encuentran incluso en tejidos óptimos, como los del ápice de la raíz de plantas cultivadas in vitro. No obstante, se consiguió poner a punto un método de análisis cromosómico basado en técnicas histológicas clásicas con modificaciones específicas para cítricos, que incluyen pretratamientos con paradiclorobenceno y posterior tinción con hematoxilina. Este método tienen el inconveniente de su extraordinarialentitud, ya que una persona especializada sólo puede procesar y analizar unas 10 muestras en dos días. Por consiguiente no puede utilizarse para trabajos a gran escala relacionados con la obtención de poliploides. La alternativa a este método es la utilización de la citometría de flujo, que se usó por primera vez para análisis de ploidía en El problema de esta técnica es el elevadísimo precio (más de 20 millones de pesetas) de los equipos y la dificultad del mantenimiento y uso de los mismos, ya que son muy complejos y con diversidad de aplicaciones. Sin embargo en el trans- 219

4 curso del proyecto apareció en el mercado un equipo compacto, diseñado para determinar la cantidad de DNA de los núcleos, que es proporcional al número de cromosomas y por tanto adaptado para la determinación de la ploidía. El precio del equipo es aceptable (4 2 millones) y su uso es relativamente sencillo. El equipo fue adquirido con fondos procedentes de una convocatoria de infraestructura de la Generalidad Valenciana y ha sido usado para poner a punto un método rápido de determinación de ploidía que consiste en una trituración delicada de los tejidos de la planta (normalmente hojas) en una solución de extracción de núcleos, una tinción con DAPI y el análisis en el citómetro de flujo. El método es extraordinario fiable y repetible y permite determinar la ploidía de una planta en unos 10 minutos, por lo que puede curarse en programas masivos de obtención de poliploides. No se ha encontrado ninguna relación entre la concentración y duración del tratamiento con colchicina con la incidencia de formación de plantas tetraploides. En el resto de los mandarino ensayados y en pomelo no se obtuvo ninguna planta tetraploide por este procedimiento. La disponibilidad del citómetro de flujo nos ha permitido realizar una prospección, no prevista en el proyecto inicial, de plantas nucelares procedentes de semilla con la finalidad de identificar tetraploides espontáneos que ocurren naturalmente en cítricos. Ello ha permitido identificar una planta tetraploide adulta de tangelo Orlando y otra de lima Mejicana, que podrán ser utilizadas de forma inmediata para la polinización de plantas diploides con la finalidad de obtener híbridos triploides. También se han identificado plantas tetraploides juveniles de los mandarinos Salteñita, Dweet y Parson s Special y de limonero Eureka Obtención de parentales autotetraploides Se han cultivado óvulos in vitro en presencia de colchicina para provocar la duplicación cromosómica en células que posteriormente puedan dar lugar a embriones y plantas. Se ensayaron distintas concentraciones de colchicina (0,05, 1% y 5%), tiempos de tratamiento (3 y 6 semanas) y estados de desarrollo de los óvulos (preantesis, 10 semanas postantesis) con las siguientes variedades: mandarino Murcott, Ortanique, Nova y Fortune, naranjos Navel y Pineapple, limonero Verna, pummelo Chandler y pomelo Star Ruby. El estado de preantesis ha sido el menos adecuado para la evolución de los óvulos y la colchicina tiene un efecto deletéreo en la mayoría de las especies en concentraciones superiores al 1%. El análisis de la ploidía de más de plantas obtenidas en presencia de colchicina ha permitido obtener plantas tetraploides con los siguientes porcentajes Mandarino Comun 1 4% Mandarino Murcott 1 6% Mandarino Nova 11% Naranjo Pineapple 5 7% 1.3. Cultivo de endospermos En el momento de iniciar este trabajo se había realizado una publicación por el Dr. Gmitter (Florida) en el que se habían obtenido cinco híbridos triploides por cultivo de endospermos de naranjo Ridge. Siguiendo la experiencia previa disponible se cultivaron endospermos de semillas inmaduras de mandarinos Común, Fortune, Tardivo di Chiaculi y Murcott, naranjo Pineapple, limonero Eureka y clementinos Monreal, Hernandina y Nules. Tan solo se obtuvieron callos en bajo porcentaje en Murcott, Tardivo de Chiaculi, Pineapple y Nules. Durante el recultivo de estos callos sólo se obtuvo una buena proliferación en el caso de Murcott y Pineapple. Los callos de estas dos variedades, que se comprobó que eran triploides, se recultivaron en cuatro medios distintos que promueven la formación de embriones en callos de cítricos. Tan solo en el caso de Murcott se consiguió la formación de embriones globulares que no evolucionaron posteriormente. La conclusión es que el procedimiento no es válido para la obtención de híbridos triploides, debido a su gran laboriosidad y bajísimo rendimiento. A la misma conclusión ha llegado el Dr. Gmitter (comunicación personal), que ha abandonado el procedimiento en el programa de mejora de Florida. 220

5 1.4. Obtención de híbridos triploides por cultivo in vitro de embriones de semillas abortadas Este objetivo no estaba inicialmente incluido en el proyecto y está basado en observaciones antiguas que indican que en hibridaciones entre parentales diploides de cítricos se producen eventualmente algunos embriones triploides, probablemente originados en la fecundación de un ovocito no reducido por un gameto del polen. Normalmente estos embriones no se desarrollan totalmente y las semillas abortan. Se realizó una prospección preliminar en distintas variedades monoembriónicas con polinización abierta con el objetivo de obtener información sobre la frecuencia de aparición de semillas abortadas, la posibilidad de extraer y cultivar in vitro los pequeños embriones existentes en las mismas y la frecuencia de obtención de híbridos triploides. En este trabajo preliminar se han obtenido más de 100 híbridos triploides procedentes de semillas abortadas de las siguientes variedades: mandarinos Campeona, Honey, Encore, Fortune y Ellendale y clementinos Hernandina, Nules y Tardia Villarreal. Los resultados preliminares obtenidos indican claramente las enormes posibilidades de este procedimiento, que jugará un papel de gran importancia en la mejora de variedades de cítricos. 2. AISLAMIENTO, CULTIVO Y FUSION DE PROTOPLASTOS 2.1. Producción de líneas celulares competentes Se han obtenido a partir de cultivo de óvulos procedentes de frutos en desarrollo (2-10 semanas postantesis) callos embriogénicos de las siguientes variedades: Naranjos: Washinton navel, Pineapple, Salustiana Mandarinos: Común, Avana apireno, Kinow, Page, Sunburst, Nova, Fairchild y Cleopatra. Tangor: Murcott Tangelos: Minneola y Orlando Pomelos: Star Ruby Naranjo amargo Lima Mejicana Relativos de los cítricos: Fortunella hindsii, F. Crassifolia y Glycosmis pentaphylla. El porcentaje de óvulos que dieron lugar a callo fue normalmente inferior al 2%, excepto en algunos naranjos en los que se llegó a tasas del 12%. Los callos embriogénicos se mantuvieron durante los primeros años mediante recultivos mensuales y posteriormente se mantuvieron en crioconservación Aislamiento y cultivo de protoplastos a partir de líneas celulares Para la puesta a punto de un método rutinario de aislamiento y cultivo de protoplastos se efectuaron ensayos de los siguientes parámetros: edad de las líneas celulares desde el último recultivo, composición de las soluciones enzimáticas y de lavado, concentración de manitol como osmótico, duración del tratamiento enzimático, métodos de purificación de protoplastos, medios de cultivo para protoplastos y regeneración de plantas. Se ha conseguido poner a punto un procedimiento rutinario que permite el aislamiento y cultivo de protoplastos y posterior regeneración de plantas. Los aspectos más importantes de este procedimiento son los siguientes: Material vegetal: Callo embriogénico de 1-2 semanas de edad después del último subcultivo. Solución enzimática: 0 3% de macerocima R-10, 0 2% de celulasa Onozuka R- 10, 0 1% de driselasa, 0 2M de manitol, 0 5M de sacarosa, _ micronutrientes del medio de Murashige y Tucker. Tiempo tratamiento con solución enzimática: Hr. Solución de lavado 1: 0 73M de sacarosa, sales minerales de medio CPW Solución de lavado 2: 0 71M de manitol, sales minerales del medio CPW 221

6 Cultivo de protoplastos: los protoplastos obtenidos se cultivan para dar lugar a microcallos, embriones y finalmente a plantas. En este proceso se usan hasta seis medios distintos. El protocolo rutinario para aislamiento y cultivo de protoplastos se ha utilizado con éxito en los naranjos dulces Pineapple, Salustiana y Washington navel, los mandarinos Cleopatra, Común, Kinnow y el naranjo amargo Aislamiento de protoplastos a partir de mesófilo de hoja Para la puesta a punto de un método rutinario de aislamiento y cultivo de protoplastos se ensayaron parámetros similares a los indicadores en el apartado anterior. Se consiguió determinar un procedimiento rutinario para el aislamiento de protoplastos de hoja cuyos aspectos más importantes son los siguientes: Material vegetal: Los rendimientos máximos se obtienen a partir de hojas de plántulas de 1-3 meses de edad producidas por germinación de semillas in vitro. También pueden obtenerse protoplastos con rendimientos aceptables a partir de hojas totalmente expandidas, pero no endurecidas, de plantas cultivadas en un fitotrón a 25ºC y con 70-80% de humedad relativa. Solución enzimática: 0 4% de celulasa Onozuka R-10, 0 4% de macerocima R- 10, 0 04% de Pertoliasa Y-23, 0 6M de manitol, _ macronutrientes del medio de Murashige y Tucker. Tiempo de tratamiento: horas. Solución de lavado 1: 0 62M de Sacarosa, sales minerales del medio CPW. Solución de lavado 2: 0 6M de manitol, sales minerales del medio CPW. Los protoplastos de hoja se pueden cultivar y regeneran la pared celular y en algunos casos se forman microcolonias, pero no tienen una evolución posterior. El procedimiento rutinario se ha aplicado con éxito al naranjo Pineapple, naranjo amargo, Clementino de Nules, citrange Troyer y los relativos de los cítricos Clausena anisata, Fortunella hindsii, F. margarita, F. ovobata, Poncirus trifoliata, Microcitrus inodora, M. australis, M. australis x M. australasica, Aegle marmelos y Triphasia trifolia. También se han obtenido protoplastos de mesófilo de hoja de citrange Carrizo transgénico portador de los genes GUS y NPT-II con el objetivo de valorar la utilidad de dichos genes para la selección de heterocariontes en las experiencias de hibridación somática Fusión de protoplastos Para la puesta a punto de la técnica de fusión de protoplastos se ha utilizado el procedimiento de quimiofusión (usando PEG al 40%) y un método mixto de electroquimiofusión (corriente continua más PEG al 20%) usando como modelo callo embriogénico de mandarino Común y hojas de clementino de Nules. De este cruce se han obtenido plantas tetraploides que están pendientes de analizar genéticamente. Además se han efectuado los siguientes cruzamientos con los procedimientos indicados. Mandarino Cleopatra x naranjo Pineapple: Quimiofusión Mandarino común x clementino de Nules: Quimiofusión Mandarino Cleopatra x Poncirus trifoliata: Quimiofusión y electroquimiofusión Mandarino Cleopatra x citrange Troyer: Quimiofusión y electroquimiofusión Naranjo amargo x Poncirus trifoliata: Quimiofusión y electroquimiofusión Naranjo amargo x citrange Troyer: Quimiofusión y electroquimiofusión Mandarino Cleopatrax Microcitrus australis: Quimiofusión y electroquimiofusión Mandarino Cleopatra x (M.australis x M.australasica): Quimiofusión Naranjo amargo x Microcitrus australis: Quimiofusión y electroquimiofusión Naranjo amargo x (M.australis x M.australasica): Quimiofusión 222

7 Mandarino Cleopatra x Aegle marmelos: Quimiofusión Los experimentos actualmente en ejecución nos indicarán los condiciones óptimas de fusión para una amplia gama de cruzamientos y probablemente permitirán establecer un procedimiento rutinario en el laboratorio para la obtención de híbridos somáticos. 3. TRANSFORMACION GENETICA 3.1. Puesta a punto de procedimientos de transformación Se ha desarrollado un procedimiento de transformación genética para el naranjo dulce Pineapple y el citrange Carrizo utilizando métodos de transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens y de regeneración por microinjerto. Los aspectos más importantes de este procedimiento son los siguientes: Material vegetal: se han usado entrenudos de plántulas de citrange Carrizo de 3 semanas de edad producidas por cultivo de semillas in vitro y entrenudos de naranjo Pineapple procedentes de plantas de 6-12 meses de edad cultivadas en invernadero. Cepa bacteriana y vector: se ha utilizado la cepa de Agrobacterium desarmada EHA 105 con el plásmido binario p35sgusint. El T-DNA de este plásmido contiene el qen NPTII, que confiere a las células transformadas resistencia a antibióticos aminoglicosidos como la kanamicina y el gen GUS, que permite la localización de las células transformadas y la selección de brotes transgénicos mediante análisis histoquímico. Cocultivo: los entrenudos cortados transversalmente se cultivan en medio de Murashige y Skoog con vitaminas sacarosa y benzyladenina y A. tumafaciens a la concentración de 10 7 células ml -1. Los cultivos se mantienen en un tambor rotatorio a 1 r.p.m. durante 2 días. Regeneración y selección: después del cocultivo: los entrenudos se colocan en un medio de regeneración, similar al de cocultivo pero sin Agrobacterium y con la adición de agar y kanamicina, como agente de selección y cefotaxamina y vancomicina para evitar el crecimiento de la bacteria. Los explantes se cocultivan cada 4 semanas en un medio fresco. Al cabo de un periodo de 1-3 meses se forman brotes de cm de longitud. Análisis de los brotes obtenidos y regeneración de plantas: porciones basales de cm de los brotes obtenidos se someten en ensayo histoquímico GUS. En los casos positivos la parte apical del brote transgénico se injerta in vitro sobre patrones de citrange Troyer para regenerar plantas completas. La naturaleza transgénica de las plantas regeneradas se confirma con análisis moleculares tipo PCR, Southern y Northern. La técnica descrita permite obtener eficiencias de transformación de un 6% para naranjo Pineapple y de más del 20% para citrange Carrizo. Estas eficiencias son las más altas descritas en cítricos y de las más altas de las leñosas en general. Uno de los factores importantes del procedimiento es el uso del microinjerto, que permite regenerar plantas prácticamente del 100% de los brotes transgénicos, incluso los de pequeño tamaño (0 2 cm). Este sistema evita la etapa de enraizamiento de los brotes transgénicos in vitro, que es un factor limitante muy importante en la transformación de leñosas. Los óptimos resultados obtenidos con la transformación mediada por Agrobacterium han desaconsejado las investigaciones de otros métodos de transformación, como la electroporación de protoplastos, que en general tienen una eficiencia muy inferior. Aunque no estaba previsto en el proyecto, se han iniciado experimentos de transformación de lima Mexicana y de material adulto de naranjo Pineapple. La lima Mexicana es la especie idónea para estudiar la viabilidad de la introducción de genes del virus de la tristeza como medio de control de la enfermedad y la transformación de material adulto supone un paso de gran importancia para acortar en muchos años los periodos de evaluación de los caracteres introducidos. En ambos casos se han obtenido plantas, pero no se han realizado aún los análisis moleculares para confirmar la naturaleza transgénica de las mismas. 223

8 3.2. Introducción de genes de posible interés agronómico La puesta a punto del sistema de transformación en un periodo muy inferior al previsto nos ha aconsejado iniciar experimentos no previstos inicialmente para la introducción de genes de posible interés agronómico. En este sentido, se han iniciado experimentos para la transformación genética con el gen HAL 2, procedente de Saccharomyces cerevisiae, que confiere mayor tolerancia a salinidad y de naranjo dulce con el gen precursor de la PR P32 de tomate, que tiene actividad antifúngica. En ambos casos se han obtenido algunas plantas positivas por GUS y PCR, pero cuya naturaleza transgénica hay que confirmar con análisis Southern y Northern. 4. CRIOCONSERVACION 4.1. Crioconservación de líneas celulares embriogénicas Se ha establecido un protocolo de crioconservación de líneas celulares embriogénicas que consta de los siguientes pasos: Colocación de mg de callo en criotubos con 1 8 ml de medio de cultivo suplementado con 10% del agente crioprotector DMSD. Mantenimiento de los criotubos a 4ºC durante 30 minutos. Enfriamiento a una velocidad de 0 5ºC/ min hasta -40ºC. Enfriamiento a una velocidad de 20ºC/min hasta -150ºC. Inmersión en nitrógeno líquido. Almacenamiento. Descongelación por inmersión de los criotubos durante 5 minutos en un baño de agua a 37ºC. Cultivo de las células para producir embriones y posteriormente plantas. El procedimiento es muy eficaz, ya que se regeneran plantas en el 100% de los cultivos. El procedimiento se ha aplicado con éxito a las líneas embriogénicas indicadas en el apartado 2.1 y a las siguientes proporcionadas por el Dr. Groser (CREC, Florida): Pomelo Red Marsh, Limonero Lac, Microcitrus papuana. Se ha comprobado que los callos pueden almacenarse en nitrógeno líquido o en un congelador eléctrico a -150ºC durante 2 años sin pérdida de viabilidad. Actualmente se mantiene una colección de todas las líneas celulares embriogénicas almacenada en nitrógeno líquido y en congelador eléctrico a -150ºC. Estas líneas se pueden usar después de la descongelación para el aislamiento de protoplastos, por lo que se evita una gran cantidad de mano de obra para el mantenimiento convencional por recultivo mensual. El procedimiento de congelación se puede también aplicar a embriones somático, pero no funciona con óvulos o ápices caulinares Crioconservación de semillas Tradicionalmente se ha considerado que las semillas de cítricos eran recalcitrantes, es decir, que pierden su viabilidad al desecarlas. En los estudios realizados en el laboratorio se ha demostrado que esto no es totalmente cierto. La tolerancia de las semillas de cítricos a la desecación varía según la especie y pueden agruparse en tres grupos: tolerantes, parcialmente tolerantes y sensibles a la desecación. Se ha diseñado un método de crioconservación por enfriamiento rápido (inmersión en nitrógeno líquido) que permite la conservación de semillas tolerantes y parcialmente tolerantes a la desecación. La supervivencia es muy alta para las semillas tolerantes, mientras que en las parcialmente tolerantes es intermedia y depende del nivel de desecación alcanzado. 224

9 INFORMACION CIENTIFICA Y TECNICA PROPORCIONADA POR EL PROYECTO. POSIBLES APLICACIONES 1. Se ha puesto a punto un procedimiento basado en la citometría de flujo que permite determinar la ploidía de plantas de cítricos de forma rápida (10-15 minutos) y fiable. Ello permite abordar programas de obtención de poliploides a gran escala, en los que sea necesario efectuar centenares e incluso miles de análisis de ploidía al año. El método ha sido eficaz para determinar la ploidía en muestras de peral, vid y mango (especies en las que se han identificado genotipos triploides tetraploides) enviadas por investigadores de otros centros. 2. Se han obtenido plantas autotetraploides de los siguientes variedades: mandarinos Común, Murcott, Nova, Salteñita, y Parson s Special, tangelo Orlando, limonero Eureka, lima Mexicana y naranjo Pineapple. Estas plantas podrán ser utilizadas como parentales para polinizar plantas diploides y obtener híbridos triploides sin semillas. 3. Se ha establecido de forma preliminar un procedimiento que permite obtener con gran eficiencia híbridos triploides mediante el cultivo in vitro de embriones de semillas abortadas procedentes de cruzamientos entre parentales diploides. Aunque el procedimiento aún requiere investigaciones adicionales, permitirá sin duda abordar programas de obtención de centenares de híbridos triploides anualmente, lo que puede representar un gran avance en le mejora de variedades decítricos. 4. Se han obtenido 20 líneas de callos embriogénicas de cítricos que pueden utilizarse como fuente de material para la obtención de híbridos somáticos. 5. Se han puesto a punto métodos rutinarios para el aislamiento y cultivo de protoplastos procedentes de callos embiogénicos y para el aislamiento de protoplastos de hojas de diversas especies de cítricos y de relativos de los cítricos. Estos procedimientos son imprescindibles para abordar trabajos de fusión de protoplastos. 6. Se han obtenido los primeros híbridos somáticos allotetraploides por fusión de protoplastos de mandarino Común y de clementino de Nules. Estas plantas podrán usarse como parentales, cuando pierdan los caracteres juveniles, para hibridar sexualmente plantas diploides y obtener híbridos triploides. Se han realizado numerosas fusiones adicionales que nos permitirán probablemente obtener híbridos somáticos de interés para la mejora de patrones y disponer de un procedimiento rutinario para la obtención de híbridos somáticos que podrá usarse para la mejora de los cítricos. 7. Se han puesto a punto métodos de transformación genética de cítricos, que son los mas eficientes descritos para esta especie y de los más eficientes para especies leñosas en general. Los sistemas de transformación disponibles permiten abordar de forma inmediata la mejora genética de los cítricos mediante introducción de genes foráneos. Los resultados obtenidos nos colocan en una situación puntera a nivel internacional en este campo. 8. Se han iniciado experimentos de introducción de genes que potencialmente puedan conferir a los cítricos mayor tolerancia a salinidad y a hongos patógenos. 9. Se ha puesto a punto un procedimiento muy eficaz de crioconservación de líneas celulares embriogénicas y se ha establecido una colección de genotipos que se mantienen en nitrógeno líquido y en congelador eléctrico a -150ºC. Esta colección es complementaria a la colección de plantas vivas del Banco de Germoplasma de Cítricos y tiene la ventaja de que puede usarse directamente para el aislamiento de protoplastos o para la transformación genética. 10. Se ha demostrado que en algunas especies de cítricos es posible la crioconservación de semillas con altas tasas de supervivencia. Serán necesarios estudios prospectivos más amplios para determinar la utilidad real de este procedimiento como alternativa a la conservación de germoplasma. FORMACION DE PERSONAL Elaboración y presentación de la tesis doctoral de Ana Mª Galiana Balaguer, titulada "Obtención y cultivo de protoplastos de cítricos", en la Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos de la Universidad Politécnica de Valencia Apto cum laude. Elaboración y presentación de la tesis doctoral de Rosa María Pérez Clemente, titulada "Criocon- 225

10 servación de germoplasma de cítricos", en la Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos de la Universidad Politécnica de Valencia Apto cum laude. Elaboración y presentación de la tesis de Master of Science en Citricultura de Riadh Ghorbel, titulada "Caracterisation biologique de souches du virus de la tristeza des agrumes (CTV) moyennant des techniques de culture de tissus in vitro", en la Universidad Politécnica Valencia, CIHEAM-IAMZ e IVIA Calificación: Sobresaliente. PUBLICACIONES Artículos científicos Peña, L., Cervera, M., Juárez, J., Ortega, C., Pina, J.A., Duran-Vila, N., Navarro, L High efficiency Agrobacterium-mediated transformation and regeneration of citrus. Plant Science, Peña, L., Cervera, M., Juárez, J., Navarro, A., Pina, J.A., Duran-Vila, N., Navarro, L Agrobacteriummediated of sweet orange and regeneration of transgenic plants. Plant Cell Rep., Artículos de divulgación Navarro, L Posibilidades de la biotecnología para la mejora genética de los cítricos. Phytoma, Libros Duran-Vila, N Cryoconservation of Germplasm of citrus, p En: Y.P.S. Bajaj (ed.), Biotechnology in Agriculture and Forestry, vol. 32, Springer.Verlag, Berlin. Trabajos presentados a congresos, reuniones o simposios 226 Pérez, R.M., Mas, O., Navarro, L., Duran-Vila, N. La crioconservación de líneas celulares como alternativa para la conservación de recursos genéticos de cítricos. II Congreso Ibérico de Ciencias Hortícolas, Actas de Horticultura Galiana, A., Pérez, R.M., Navarro, L., Duran- Vila, N. Obtención de líneas celulares embriogénicas de cítricos. II Congreso Ibérico de Ciencias Hortícolas, Actas de Horticultura Pérez, R.M., Navarro, L., Duran-Vila, N. Cryoconservation of seeds and embryogenic cell lines as an alternative to the conservation of citrus genetic resources. VII Int. Congress Plant Tissue Cell Culture. Firence Galiana, A., Navarro, L., Duran-Vila, N. Isolation and culture of citrus protoplasts. VII Int. Congress Plant Tissue Cell Culture. Firence Peña, L., Cervera, M., Juárez, J., Navarro, A., C., Pina, J.A., Duran-Vila, N., Navarro, L. Agrobacterium-mediated transformation of sweet orange (Citrus sinensis L. Osb.) and regeneration of transgenic plants. VII Int. Congress Plant Tissue Cell Culture. Firence Navarro, L. Aplicaciones del cultivo de tejidos in vitro a la agricultura. VI Congreso de la Soc. Española de Ciencias Hortícolas. Barcelona (Espana). (Ponencia Invitada) Peña, L, Cervera, M., Juárez, J., Navarro, A., Ortega, C., Pina, J.A., Duran-Vila, N., Navarro, L. Transformación genética de naranjo dulce (Citrus sinensis L. Osbeck cv. pineapple) y regeneración de plantas transgénicas. VI Congreso de la Sociedad Española de Ciencias Hortícolas. Barcelona (Espana) Galiana, A., Navarro, L., Duran-Vila, N. Aislamiento y cultivo de protoplastos de cítricos. VI Congreso de la Sociedad Española de Ciencias Hortícolas. Barcelona (Espana) Pérez, R.M., Navarro L., Duran-Vila, N. Conservación y crioconservación de semillas de cítricos. VI Congreso de la Sociedad Española de Ciencias Hortícolas. Barcelona (Espana) Duran-Vila, N., Galiana, A., Olivares, O., Navarro, L. Embryogenic cell lines, protoplast culture and somatic hybridization as tools for mandarin breeding. Symposium Mediterraneen sur mandarines. San Giuliano, Corse (France) Duran-Vila, N., Pérez, R.M., Navarro, L. Cryoconservation of citrus germplasm. Symposium Mediterraneen sur mandarines. San Giuliano, Corse (France) Peña, L., Cervera, M., Juárez, J., Navarro, A, Ortega, C., Pina, J.A., Duran-Vila, N., Navarro, L. Towards molecular genetic improvement of citrus transgenic plants. Symposium Mediterraneen sur mandarines. San Giuliano, Corse (France) Juárez, J., Ortega, C., Navarro, A., Arregui, J.M., Navarro, L. Endosperm and ovule culture

11 as tools for ploidy level manipulation in citrus. Preliminary results. Symposium Mediterraneen sur Mandarines. San Giuliano, Corse (France) Duran-Vila, N., Pérez, R.M., Galiana, A., Ortega, C., Navarro, L. Líneas celulares de cítricos. Segunda reunión rama española de la Sociedad Europea de Cultivo de Tejidos. Madrid (Espana) Peña, L., Cervera, M., Juarez, J., Navarro,A., Pina, J.A.,Duran-Vila, N., Navarro, L. Agrobacteriummediated transformation and regeneration of sweet orange plants. VII Congress of the International Society of Citriculture. Sun City (South Africa)