Mecanismos de Resistencia a los Antibióticos
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- Luz Rodríguez Peña
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1 Mecanismos de Resistencia a los Antibióticos
2 Resistencia microbiana a los antibióticos Perdida de sensibilidad de un microorganismo a un ATB Intrínseca - La bacteria no tiene la molécula/reacción enzimática que es el blanco del antibiótico - Diferencias en la permeabilidad - El ATB es expulsado eficientemente por sistemas de eflujo Adquirida - Adquisición de genes por transferencia horizontal: Conjugación Transformación Transducción Mutaciones Gram - Gram + 2
3 Resistencia frente a ATB Antibiótico Uso Clínico Resistencia observada Sulfonamidas Penicilina Estreptomicina años Cloramfenicol Tetracycline Erythromycin Vancomicina Cefalosporinas 1960 Fines de 1960 Meticilina Ampicilina años Necesidad constante de encontrar o desarrollar nuevos y mejores antibióticos 3
4 Evolución de la resistencia en Staphyloccocus aureus BlaZ Staphylococcus aureus MRSA Bacteria Gram-positiva que causa graves infecciones intrahospitalarias MecR-MecI-MecA VanH-VanA-VanX Linezolid (Zyvox) del grupo de las 2-oxazolidona Su mecanismo de acción consiste en inhibir la síntesis proteica de la bacteria al impedir la formación del complejo de iniciación ARNr L3 o L4 Cfr 4
5 Cuál es el origen de los mecanismos de resistencia a los ATB? 5
6 Autoprotección de Bacterias productoras de Antibióticos Los productores de antibióticos desarrollaron mecanismos de protección e inmunidad contra sus propias armas y representan un reservorio natural de genes de defensa anteriores al uso clínico de los antibióticos... 6
7 Autoprotección de Bacterias productoras de Antibióticos 7
8 Mecanismos de Resistencia frente a ATB 1- Inactivación por destrucción o modificación de la droga: - Hidrólisis - Modificación covalente 2- Modificación del sitio blanco: - Modificación covalente - Reemplazo - Mutaciones 3- Disminución de la concentración intracelular: - Disminución de la entrada - Aumento de la salida 8
9 Evolución de la resistencia en Staphyloccocus aureus BlaZ Staphylococcus aureus MRSA Bacteria Gram-positiva que causa graves infecciones intrahospitalarias MecR-MecI-MecA VanH-VanA-VanX ARNr L3 o L4 Cfr 9
10 Destrucción o modificación de la droga 10
11 Destrucción de la droga β-lactámicos: Inhiben las transpeptidasas 11
12 Transpeptidasas β-lactamasas PBPs Destrucción de la droga Inhibición de la reacción de transpeptidación y del entrecruzamiento del peptidoglicano Activan el mecanismo autolítico endógeno bacteriano Existe enzimas de diferentes tipo: Serin-β-lactamasas (Tipo A, C y D) Metalo-β-lactamasas (Zn +2 ) Periplasmicas o unidas a membrana interna (Gram -) o extracelulares (Gram +) Constitutivas o inducibles 12
13 Las β-lactamasas en el periplasma evitan que los ATB lleguen a sus blancos 13
14 Regulación de la expresión de los genes de las β-lactamasas E. coli : ampgdr y ampc Penicilina Amidasa β-lactamasa AmpC Regulador transcripcional 14
15 Regulación de la expresión de los genes de las β-lactamasas Resistencia a β-lactámicos: Síntesis de β-lactamasa BlaZ S. aureus MRSA PBP Regulador negativo 15
16 Estrategias para neutralizar las β-lactamasas - Desarrollo de β-lactámicos semisintéticos que sean hidrolizados lentamente: carbapenem (Thienamycin), monobactam - Inhibidores (competitivos) de β-lactamasas: Ac. clavulánico Reareglo estuctural del acyl-enz 16
17 Estrategias para neutralizar las β-lactamasas 17
18 Modificación del blanco 18
19 Evolución de la resistencia en Staphyloccocus aureus BlaZ Staphylococcus aureus MRSA Bacteria Gram-positiva que causa graves infecciones intrahospitalarias MecR-MecI-MecA VanH-VanA-VanX ARNr L3 o L4 Cfr 19
20 Reemplazo del sitio blanco Resistencia a β-lactámicos: Síntesis de PBP2a insensible a β-lactámicos S. aureus MRSA
21 Reemplazo del sitio blanco Resistencia a β-lactámicos: Síntesis de PBP2a insensible a β-lactámicos S. aureus MRSA
22 Evolución de la resistencia en Staphyloccocus aureus BlaZ Staphylococcus aureus MRSA Bacteria Gram-positiva que causa graves infecciones intrahospitalarias MecR-MecI-MecA VanH-VanA-VanX ARNr L3 o L4 Cfr 22
23 Modificación del sitio blanco Resistencia a Vancomicina: vanr, vans, vanh, vana,, vanx, vany y vanz D-ala-D-ala D-ala-D-Lac VanS: Proteina snesora VanR: Activador transcripcional VanH: Piruvato reductasa VanA: Ligasa A-ala-X VanX: D-ala-D-ala dipeptidasa VanY: D-D Carboxipeptidasa 23
24 Modificación del sitio blanco Resistencia a Vancomicina por modificación de D-Ala por D-Lac 1000 Kd 24
25 Antibióticos que inhiben la síntesis de proteínas Que actúan sobre la subunidad 30S del ribosoma Aminoglicósidos: Kanamicina Tetraciclinas: Tetraciclina Que actúan sobre la unidad 50S del ribosoma Cloranfenicol Macrólidos: Eritromicina, Azitromicina, Claritromicina 25
26 Modificación de la droga Modificaciones químicas de aminoglicosidos: Kanamicina Adenilación Fosforilación Acetilación 26
27 Modificación de la droga Modificaciones químicas de aminoglicosidos: Cloranfenicol O 2 N OH HO H N O Cl Cl Hidrólisis OH NH 2 Cl Acetilación O 2 N HO + O Cl OH H N Cl Cl Fosforilación OH H N Cl Cl O 2 N O O O 2 N O O O O P OH OH O O O H N Cl Cl O H N Cl Cl O 2 N HO O O 2 N O O O
28 Resistencia frente a Macrólidos - Inactivación de la droga: Glicosilación del OH del aminoazúcar - Disminución de cc intracelular: Bombas de transporte - Modificacion de sitio blanco: Dimetilación de residuo Adenina rrna Mutaciones puntuales de rrna o proteínas ribosomales 28
29 Resistencia frente a Macrólidos - Inactivación de la droga: Glicosilación del OH del aminoazúcar OleB 29
30 Modificación del sitio blanco - Modificacion de sitio blanco: Dimetilación de residuo Adenina rrna Mutaciones puntuales de rrna o proteínas ribosomales 30
31 Streptogramin B Modificación del sitio blanco Unión de Macrólidos al ribosoma 31
32 Modificación del sitio blanco Resistencia a Rifampicina: Mutaciones puntuales de subunidad β RNA Pol Resistencia a Quinolonas: Mutaciones puntuales de subunidad A o B de la DNA Girasa o mutaciones puntuales que causen una disminusión del ingreso o un aumento de la expulción de la droga. Por adquisición de genes que codifican enzimas que modifican la droga por acetilación o bombas de eflujo. 32
33 Disminución de la concentración intracelular de la droga 33
34 Disminución de la concentración intracelular: Bombas de eflujo Gram negativas Gram positivas 1) ABC: ATP-binding cassette 2) MSF: major facilitator superfamily 3) SMR: small multidrug-resistance 4) RND: resistance-nodulation-division 5) MATE: multidrug and toxic compound extrusion 34
35 Disminución de la concentración intracelular Mecanismo de resistencia a Tetraciclina Cuando la tetraciclina entra a la célula se une con alta afinidad a la proteina TetR, que funciona como represor del gen de la bomba TetA (MFS), se sobreproduce y se inserta en la membrana 35
36 Resumen Mecanismos de Resistencia 36
37 Problemas de la resistencia frente a ATB Antibiótico Uso Clínico Resistencia observada Sulfonamidas Penicilina Estreptomicina Cloramfenicol Tetracycline Erythromycin Vancomicina Cefalosporinas 1960 Fines de 1960 Meticilina Ampicilina Necesidad constante de encontrar o desarrollar nuevos y mejores antibióticos
38 Búsqueda de nuevos antibióticos
39 Mayores Productores de Compuestos Naturales Actinomicetes Penicillum Bacillu s Existen alrededor de ATB conocidos 160 utilizados en la clínica 55% producidos por Streptomyces
40 Mayores Productores de Compuestos Naturales: Actinomycetes Genilloud (2010) J Ind Microbiol Biotechnol
41 Género Streptomyces Producen 55% ATB de uso medicinal Incluyen: Policetónicos Macrólidos y Aromáticos, Peptidos de Síntesis no Ribosomal, β-lactámicos, Policetónico- NRPS hibridos, Cumarinas y Polipirroles.
42 Productos Naturales: Antibióticos Christoffersen (2006) NATURE BIOTECHNOLOGY 24(12)
43 Aislamiento de Productos Naturales: Nuevas estructuras? Walsh (2003) Nat Review Micro 66 (1)
44 Aislamiento Tradicional de Productos Naturales Muestra de suelo - Optimizar crecimiento de microorganismos - Preparar extractos celulares - Ensayar contra cepas testigos - Purificar compuesto activo Fuentes alternativas Bacterias no cultivable Ensayos diferenciables - Nuevas técnicas de cultivo: enriquecimiento - Aislamiento de ADN: Expresión de rutas en bacterias cultivables - Ingeniería metabólica en bacterias cultivables
45 Compuestos de uso terapéutico
46 Análisis de genomas de actinomicetes Aigle y col. (2014 J Ind Microbiol Biotechnol 41:
47 Análisis de genomas de actinomicetes Wong and Khosla. Current Opinion in Chemical Biology 2012, 16:
48 Expresión heterologa de PKS Rodriguez et al, Meth Enzy 2009
49 Expresión heteróloga de clusters
50 Enriquecimiento de muestras del suelo Capilar lleno de buffer que contiene un atrayente para los actinomicetos móviles Granos de polen que flotan en una suspensión de suelo como cebos para actinomicetos móviles Muestra de suelo incubada con carbonato de calcio para enriquecer la población de Actinokineospora spp. Crecimiento de actinomicetos a partir de restos radiculares de plantas para Actinomycetos endofíticos Hayakawa (2008) Actinomycetologica 22:12 19
51 Estrategia de screening diferencial Young y col (2006) AAC 50(2): ; Wang y col (2007) PNAS 104(18):
52 Estrategia de screening diferencial: Mycobacterias Pyridomycin Estudios bioquímicos y estructurales muestran que pyridomycin inhibe la enoilreductasa InhA directamente como un inhibidor competitivo del sitio de unión NADH y de esta manera se inhibe la síntesis de ácidos micólicos en M. tuberculosis. Hartkoorn y col. (2012) EMBO Mol Med 4,
53 Búsqueda a partir de Nuevos Nichos: Esponjas marinas
54 Microorganismos no cultivables
55 Cultivo de microorganismos no cultivables: ichip Ling y col Nature 517:
56 Cultivo de microorganismos no cultivables: ichip Ling y col Nature 517:
57 NRP: Teixobactin A new antibiotic without detectable resistance Ling y col Nature 517:
58 Teixobactin: A new antibiotic without detectable resistance Ling y col Nature 517:
59 NRP: Teixobactin Ling y col Nature 517:
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