ESTERILIZACIÓN Y DESINFECCIÓN- 2016

Transcripción

1 1 ESTERILIZACIÓN Y DESINFECCIÓN Introducción La esterilización es un proceso a través del que se puede lograr la destrucción total de los microorganismos viables presentes en un determinado material. Este procedimiento es de gran utilidad dentro del campo farmacéutico, ya que existen muchos procesos que requieren la utilización de materiales estériles. Entre éstos podemos destacar: La esterilización de equipos quirúrgicos y otros materiales de uso médico con el propósito de reducir el riesgo de infecciones en pacientes. El acondicionamiento del material (pipetas, tubos, placas de Petri, pinzas, etc) que va a ser utilizado en el laboratorio de Microbiología. La preparación de medios de cultivo que serán empleados con diferentes propósitos (cultivo de microorganismos, control de ambiente, equipos o personal, análisis microbiológico de alimentos, medicamentos, cosméticos, etc) La descontaminación del material utilizado. Es importante definir los siguientes términos fundamentales relacionados con el control microbiano: - Esterilización: es un proceso por el que se eliminan todas las formas de vida microbiana, incluso las esporas bacterianas, produciendo una condición de esterilidad. Se logra por métodos físicos y químicos. - Estéril: es la ausencia absoluta de toda forma viable de vida. - Desinfección: uso de agentes químicos para eliminar la infectividad potencial de un material (no implica la eliminación de todas las formas microbianas). Destrucción de las formas vegetativas de los patógenos. - Asepsia: conjunto de medidas destinadas a impedir toda contaminación microbiana. - Germicida (o biocida): sustancia capaz de matar las formas vegetativas de los gérmenes. - Bactericida: tiene igual significación, pero referido específicamente a las bacterias. - Bacteriostático: sustancia que inhibe el crecimiento bacteriano. - Fungicida: sustancia que mata los hongos. - Fungistático: sustancia que inhibe el crecimiento fúngico.

2 2 - Virucida: sustancia que detiene la replicación y la actividad vírica. - Virustático: sustancia que inhibe la replicación vírica. Los nombres de los tratamientos que producen la muerte directa de los microorganismos llevan el sufijo cida, que significa muerte, (ejs. virucida, fungicida), mientras que los procedimientos que llevan el sufijo stático significa detener o inhibir el crecimiento y la multiplicación de las bacterias, como bacteriostático. Una vez eliminado el agente bacteriostático podría reanudarse el crecimiento. Los términos esterilización y estéril son conceptos abstractos de estados negativos y como tales no son factibles de demostrar prácticamente, es decir, la muerte o remoción de las bacterias sigue una función de probabilidad, y siempre hay una posibilidad finita de que queden algunos microorganismos vivos intactos en el sistema. En la práctica, el concepto esterilización significa el proceso de alcanzar un estado con el mínimo riesgo calculado de sobrevivientes, mientras que por estéril se entiende la ausencia de formas de vida demostrables. Para la mayoría de los métodos de esterilización, este riesgo es normalmente de muy bajo orden. De allí surge el concepto de SAL (sterility assurance level) = 10-6 (probabilidad de sobrevida): la probabilidad de una unidad no estéril es igual a 1 en una población de 10 6 microorganismos. Podemos comprender que la esterilidad de un material, dependerá, entre otros factores, de No (número inicial de microorganismos viables contaminantes) y de la velocidad de muerte de dichos microorganismos para ese proceso de esterilización. Tasa de muerte microbiana Cuando las poblaciones bacterianas se calientan o se tratan con sustancias químicas por lo general mueren a una tasa constante. Por ejemplo, supóngase que una población de 1 millón de microorganismos ha sido tratada durante 1 minuto y que el 90% de los microorganismos de la población, han muerto, es decir que quedan (10 5 ) microorganismos. Si la población se vuelve a tratar durante otro minuto muere el 90% de esos microorganismos y quedan (10 4 ) sobrevivientes. Es decir, por cada minuto de tratamiento aplicado muere el 90% de los microorganismos restantes de la población.

3 3 Cinética de muerte de los microorganismos Para todos los microorganismos existe una temperatura máxima de crecimiento por encima de la cual mueren. A temperaturas muy altas, casi todas las moléculas pierden su estructura y su función, por el proceso denominado desnaturalización. Cuando una población de microorganismos es sometida a un proceso de esterilización (por ej. calor, radiación, o compuestos químicos), no todas las células mueren al mismo tiempo. El número de sobrevivientes disminuye exponencialmente con el tiempo de exposición hasta que no pueden detectarse más microorganismos viables. Mientras esto se mantiene la curva de sobrevivencia, es decir, el gráfico de logaritmo del número de sobrevivientes (N/No) en función del tiempo (t) independiente del número inicial de microorganismos, es lineal (Figs.1 y 9.1A). Esta curva del tipo indicado (Figs.1 y 9.1A) matemática: puede ser descripta por la expresión N/No = e - Kt ln N/No = - K t N/No: es la fracción de microorganismos viables que sobreviven el tratamiento de esterilización durante el tiempo t. donde: K es la constante de inactivación o de velocidad de muerte, No es el número de microorganismos viables presentes inicialmente, y N es el número de lo g N º s o b re v iv ie n te s N t = N o e Tiempo (min) microorganismos al final del proceso. Fig.1: Cinética de muerte La muerte de los microorganismos es una función exponencial (de primer orden) y ocurre más rápidamente cuanto mayor es la temperatura.

4 4 En el caso, de las esporas altamente resistentes, puede haber una fase inicial logarítmica en la muerte en función del tiempo antes que la curva de sobrevivientes comience a decrecer exponencialmente. Esto produce un hombro o plateau en la curva que luego puede ser lineal (Fig. 9-1B). Con microorganismos altamente sensibles, la porción inicial de la curva puede ser muy aguda y no exponencial antes de convertirse en lineal, dando lugar a una curva bifásica (Fig. 9-1 C). Estos casos son típicamente demostrados con procesos de esterilización por calor y radiación. En tratamientos químicos, la curva de supervivientes puede iniciarse con características de linealidad, pero luego de un tiempo muestra un retardo en la velocidad de muerte dando lugar a una cola (Fig. 9-1D). A veces toda la curva es sigmoidea, esto indica la presencia de sobrevivientes resistentes en la suspensión original, aún cuando se trate de bacterias del mismo tipo. En todos los casos la pendiente de la curva en la porción lineal varía con muchos factores, como la severidad del tratamiento y la presencia de agentes protectivos.

5 5 El valor D o tiempo de reducción decimal: es el tiempo en minutos requerido para reducir un 90% el número de microorganismos viables, es decir, al 10% del recuento inicial, lo cual corresponde a una disminución de un ciclo logarítmico en la curva de sobrevivencia a una temperatura determinada (Fig. cinética de termodestrucción). Todos los factores: temperatura o dosis de radiación, composición, ph del medio deben ser especificados. Si todos estos factores son bien conocidos, el valor D puede ser determinado con bastante precisión para muchos microorganismos. Este valor D es útil en la industria de la alimentación. Se usa para calcular la eficiencia de un proceso de esterilización para destruir un microorganismo específico. Factores que afectan la eficiencia de los procesos de esterilización - La presencia de humedad y oxígeno: incrementa la eficiencia de todos los procesos de esterilización. Entonces, el calor húmedo requiere temperaturas y tiempos de exposición bastantes menores para esterilizar, que el calor seco. - La presencia de sustancias químicas bactericidas: aumenta el efecto del calor y permite el uso de temperaturas más bajas para producir el mismo efecto.. - La mayoría de los microorganismos esporulados son más resistentes cuando se forman en su hábitat natural (ej. suelo) que cuando desarrollan en medios de cultivo artificiales. - Los aceites, ácidos grasos y grasas, y las proteínas (sangre): tienen un efecto protector sobre las bacterias, particularmente contra la acción del calor. - Las soluciones azucaradas con glucosa en alta concentración: protegen, probablemente por reducción de la actividad acuosa (a w ) dentro del sistema y generalmente aumentan la resistencia de los microorganismos al calor.

6 6 Condiciones previas que debe cumplir el material para una eficaz esterilización - Lavado - Secado - Envoltura Lavado: se realiza con agua y detergentes - Reduce la tensión superficial del agua, colaborando en la solubilización de albúmina, emulsión de grasas y suspensión de partículas. - El empleo de detergentes enzimáticos es de mayor eficiencia. Para qué realizamos el lavado? - Para remover toda materia extraña en la superficie de los materiales - Para eliminar materia orgánica que interfiere en los métodos de esterilización. Secado: es importante para evitar la recontaminación y deterioro del material. Envoltura Para qué envolvemos? - Para evitar la recontaminación microbiana en el momento de la salida de la cámara de esterilización, transporte y almacenamiento hasta su utilización. Cómo debe ser la envoltura? - La naturaleza del material de envoltura dependerá del procedimiento de esterilización empleado y del material a esterilizar - Permeable al agente esterilizante - Resistente a la penetración de microorganismos - Resistente a roturas y humedad - No debe ser tóxico. Libre de pérdida de fibras u otro tipo de sustancias. MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN Los métodos de esterilización se pueden clasificar en: MÉTODOS FÍSICOS - Calor seco: llama directa, incineración, aire caliente (estufa) - Calor húmedo: a presión (autoclave), a vapor fluente (tyndalización)

7 7 - Filtración: filtros de profundidad, filtros de membrana, filtros de nucleación - Radiaciones: ionizantes, ultravioletas MÉTODOS QUÍMICOS - Óxido de etileno - Formaldehído - Glutaraldehído - Gas plasma MÉTODOS FÍSICOS Calor: es el método preferido para esterilizar todos los materiales, excepto aquellos que sufren daño por su termosensibilidad. El proceso es rápido, todos los microorganismos son sensibles, y el calor llega a lugares que podrían estar protegidos para los agentes químicos. Los mecanismos de esterilización por calor húmedo se basan en la desnaturalización de proteínas, aunque es posible que también tenga alguna importancia la fusión de los lípidos de la membrana como así también el daño de los ácidos nucleicos. Los límites de temperatura a que se lleva a cabo este proceso corresponden a los que se desnaturalizan la mayoría de las proteínas. Estos procesos requieren una temperatura más alta cuando el material está totalmente desecado o la actividad del agua del medio se reduce por una alta concentración de una sustancia neutra como por ej. glicerol o glucosa. Microorganismos como los hongos, la mayoría de los virus y las células vegetativas de bacterias, pueden ser destruidos luego de varios minutos a 50 70º C, mientras que las esporas de diversos microorganismos requieren temperaturas de 121º C durante 15 a 20 min para lograr su destrucción. Calor seco Es de aplicación limitada, porque se requieren temperaturas elevadas y además porque pocos materiales resisten la acción oxidante del calor a esa temperatura en presencia de aire. El calor seco se puede llevar a cabo mediante acción directa a la llama: el material se lleva al rojo durante 5 10 segundos (ansas), o pasando el material por la llama

8 8 repetidas veces 2 ó 3 minutos; o bien colocando el material en un recipiente adecuado cubriéndolo de alcohol y encendiéndolo, de modo que la llama pase por todo el material durante 2 ó 3 minutos. Así se pueden esterilizar tijeras, agujas, portaobjetos. También, la incineración es el método más común de tratamiento de los desechos infecciosos. El material se quema a cenizas, a temperaturas de º C. Con más frecuencia, se utiliza el aire caliente o sea calor seco calentando el aire en el interior de una estufa diseñada especialmente que asegure una distribución homogénea de la temperatura. Se debe aprovechar la transmisión del calor por convención natural y en equipos de mayor magnitud se debe instalar una convención forzada para la circulación del aire; de esta forma no sólo se logra una temperatura uniforme en todos los puntos, sino también se puede acortar el tiempo correspondiente de esterilización. El calor seco requiere un período de exposición más prolongado: una hora y media a 160º C o una hora a 180º C. Es importante tomar el tiempo desde que la estufa y el material alcanzan la temperatura deseada, es conveniente cargar la estufa cuando está a la temperatura ambiente, porque la naturaleza del material a esterilizar, cantidad y tamaño influyen sobre el período de calentamiento. Aplicaciones. Se utilizan para esterilizar elementos como material de vidrio, de metal, aceites, vaselina, soluciones oleosas, sobre todo si están envasadas en recipientes herméticos, también en la esterilización de polvos cuya mala conductividad hace muy prolongado el tiempo de calentamiento. Por ejemplo, el talco, se puede distribuir en recipientes de poca profundidad (cajas de Petri). Para que un material se pueda esterilizar por calor seco, debe tolerar temperaturas de º C sin sufrir alteraciones, y si se trata de un líquido, debe tener punto de ebullición por encima de esa temperatura, es decir no debe entrar en ebullición durante la esterilización. No toleran estas temperaturas, materiales como guantes, sondas, textiles, etc. No se pueden esterilizar medios de cultivo porque se deshidratarían. Las estufas (u hornos) de esterilización son de construcción simple: constan de una caja metálica con una puerta frontal y estanterías regulables, con ingreso de aire caliente, y con una salida regulable de aire en la parte superior. Actualmente la fuente de calor es por calefactores eléctricos, y es regulable la temperatura por un

9 9 termostato. La pared metálica puede ser doble con una cámara de aire entre ellas. La pared externa puede estar recubierta con un material aislante. Pueden estar provistas de un circulador de aire que oriente la convención forzada, de esta manera aumenta la homogeneidad y la velocidad de calentamiento. Se han establecido otros métodos de calor seco para aumentar la eficiencia, como la estufa de calentamiento de infrarrojo de gran velocidad que opera con vacío, diseñada para esterilización de instrumental quirúrgico. La misma funciona a 280º C en alto vacío, y el corte del vacío se realiza con nitrógeno estéril para evitar la oxidación de los bordes. El tiempo del ciclo total dura aproximadamente 15 minutos. Calor húmedo El método estándar para esterilizar por calor húmedo es autoclave a 121º C durante minutos. Esa temperatura de 121º C se logra con vapor de agua a 1 atmósfera de presión sobre la presión atmosférica. Los objetos fríos son rápidamente calentados por la condensación sobre su superficie matando los microorganismos por desnaturalización de las proteínas y disolución de los lípidos de las estructuras esenciales de los mismos. Existen distintos tipos de autoclaves, hay autoclaves a vapor, con control digital, eléctricas, también hay manuales y automáticos, de una cámara o de dos cámaras, verticales u horizontales, pero todos se fundamentan en el mismo principio: al aumentar la presión interna del autoclave aumenta el punto de ebullición del agua. Fundamentalmente hay 3 tipos de autoclave de uso común: a) Autoclave de laboratorio (Chamberland): consiste en una cámara de esterilización que genera su propio vapor a partir de agua contenida en el fondo de la cámara, por medio de calentamiento interno (eléctrico) o externo (gas). Posee un manómetro que registra la presión interna de la cámara, una válvula de seguridad y puede contener un termómetro. El aire es retirado desde la cámara a través de la espita durante el período de calentamiento y ebullición inicial. Debido a la eyección de gotas de agua desde la superficie del agua hirviendo, éste autoclave es adecuado para recipientes con líquido. Otros artículos, como, ropa o aparatos, incluyendo sus envolturas, se humedecerán con agua

10 10 durante la esterilización, lo cual puede producir su recontaminación al ser introducidos en una atmósfera no estéril. b) Autoclave de alto vacío: está diseñada para la esterilización rápida de artículos secos como ropa, artículos de goma, etc. Consiste en una cámara revestida que puede ser evacuada a baja presión. El ciclo total puede demorar solamente 25 a 30 minutos. c) Autoclave de desplazamiento inferior de vapor: es una cámara alimentada con una fuente externa de vapor. Como el vapor que penetra es menos denso que el aire a la misma temperatura, este último es desplazado y ventilado a través de una apertura en el punto más bajo de la cámara. Completado el ciclo este tipo de autoclave permite un secado final de la carga por pasaje de aire caliente esterilizado por filtración. Con respecto a los tiempos de exposición, hay diversos ciclos de temperatura/tiempo recomendados para la esterilización por autoclave. Por ej. la Farmacopea de Estados Unidos recomienda el calentamiento a 121º C por 15 minutos como mínimo. Se pueden emplear otras combinaciones de tiempo y temperatura siempre que resulten efectivas. El autoclave de laboratorio tipo Chamberland, es un aparato cilíndrico de paredes dobles y doble fondo donde se coloca el agua, calefaccionada en la parte inferior, se cierra herméticamente con una tapa que tiene charnelas (o mariposas), en la parte superior de la tapa tiene una espita para escape de vapor, un manómetro para medir la presión y una válvula de seguridad. Autoclave tipo Chamberland: instrucciones en el manejo y precauciones con respecto al material a esterilizar - Controlar que el fondo del autoclave tenga agua suficiente para todo el proceso (debe llegar hasta la rejilla). - Colocar el material que no debe estar herméticamente cerrado, se puede tapar con tapones de algodón o gasa, tapas de plástico, si se usan tapones de goma o de vidrio esmerilado se coloca una piola para impedir el cierre hermético, al sacarlo del autoclave se retira la piola y se ajusta el tapón. Si se usan tapas a rosca, se esteriliza con la tapa floja y cuando se saca del autoclave se ajusta.

11 11 - El material debe estar envuelto en papel poroso para preservar su posterior esterilidad. - El volumen de los recipientes no debe ser más de la mitad o de las 2/3 partes del volumen del recipiente para evitar proyecciones y permitir que el líquido entre en ebullición libremente sin mojar los tapones. - Una vez acondicionado el material se cierra la tapa ajustando las charnelas o mariposas en forma enfrentada para asegurar el cierre hermético. - Encendidos los mecheros se abre la espita hasta que salga todo el aire contenido en el interior del autoclave, lo que se determina cuando sale flujo continuo de vapor de agua por la espita. Esta operación es muy importante porque si queda una mezcla de aire y vapor en el interior del autoclave, por ser el aire menor conductor del calor se logran temperaturas insuficientes para una correcta esterilización (la presión resultante será tanto menor cuando mayor sea la cantidad de aire que contenga el autoclave). - Luego se cierra la espita, el manómetro comienza a marcar el aumento de presión hasta una atmósfera que corresponde a 121º C. La presión absoluta en el interior del autoclave es de 2 atmósferas considerando que la presión atmosférica en ese momento sea de 1 atmósfera, se deja min, aunque el tiempo de esterilización depende del volumen y de la masa del material a esterilizar. Si se trata de material de laboratorio contaminado se deja 30 min para permitir la penetración del vapor a través de los desechos y el desplazamiento del aire atrapado dentro del autoclave. - Si el objeto que se esta esterilizando es muy voluminoso, la transferencia de calor a su interior tarda más tiempo, y se debe aumentar el tiempo total de calentamiento para garantizar que el objeto entero esté sometido a una temperatura de 121º C durante min. También se requieren mayores tiempos cuando se autoclavan grandes volúmenes de líquidos, dado que los volúmenes grandes tardan más tiempo en alcanzar la temperatura de esterilización. - Transcurrido el tiempo necesario se apagan los mecheros. - Se abre la espita lentamente para evitar que por diferencia de presión salten los tapones.

12 12 - Abrir el autoclave. - Si el material es de vidrio o metal se lleva a estufa para el secado total. - Si son medios de cultivo se realiza el control de esterilidad y se guardan en heladera. Las autoclaves automáticas poseen una válvula automática de purga que está controlada por un mecanismo termostático y se cierra al entrar en contacto con el vapor puro cuando sale el aire. Tyndalización Se puede realizar: A vapor fluente (olla presión o autoclave con espita abierta) Baño María a ebullición La tyndalización es un método de esterilización por calor húmedo en más de un proceso. Consiste en calentar a 100º C durante 20 minutos 3 veces a intervalos de 24 horas: el primer calentamiento destruye todas las formas vegetativas de los gérmenes que pudieran estar presentes, luego se incuba 24 h a 37º C o a temperatura ambiente y si el medio es adecuado (suficientemente rico para permitir la germinación de las esporas) las esporas que pudieran estar presentes germinarán (shock térmico) y pasarán a la forma vegetativa, al aplicar el segundo calentamiento serán muertas estas formas vegetativas provenientes de las esporas, se vuelve a incubar 24 h en las mismas condiciones anteriores, si alguna espora no germinó durante la primera incubación lo hace ahora y al calentar por tercera vez se destruirán. Este proceso en la industria suele repetirse 5 veces o más. Se pueden tyndalizar: leche, gelatina, hidratos de carbono, es decir sustancias que no resisten altas temperaturas y a su vez tienen una composición química tal que permiten la germinación de las esporas. No se pueden tyndalizar: solución de electrolitos, agua destilada, solución fisiológica, buffers, solución de bicarbonato. Ventajas del calor húmedo con respecto al calor seco Menor tiempo de esterilización

13 13 Menor temperatura El calor húmedo es más penetrante que el calor seco Se pueden esterilizar medios de cultivo y otros líquidos como solución fisiológica (SF), agua destilada (AD). Pasteurización La pasteurización es un proceso que reduce la población microbiana en leche y otros alimentos sensibles al calor. Pasteurización no es sinónimo de esterilización porque en ella no se destruyen todos los microorganismos. Inicialmente se utilizó la pasteurización para destruir bacterias patógenas, especialmente los organismos causantes de tuberculosis, brucelosis y fiebre tifoidea. Impide la transmisión de patógenos que actualmente sí son habituales como Listeria monocytogenes, y algunas especies de Campylobacter, Salmonella y Escherichia coli O157:H7.La pasteurización también retrasa el crecimiento de organismos alterantes e incrementa la vida útil de los líquidos perecederos. Muchas bacterias relativamente resistentes al calor (termodúricas) sobreviven a la pasteurización pero es poco probable que causen enfermedad o el deterioro de la leche refrigerada. Procesos de pasteurización: Pasteurización alta (o también denominada de corta duración a alta temperatura: high-temperature short-time; HTST): la leche se bombea a través de un tubo que está en contacto con una fuente de calor. Este procedimiento emplea temperaturas de 71-72º C durante 15 segundos. Luego la leche se enfría rápidamente. Pasteurización baja: la leche se calienta en grandes depósitos a 63-66º C durante 30 minutos. Este procedimiento es menos satisfactorio porque la leche se calienta y se enfría lentamente y debe mantenerse a temperaturas altas por períodos de tiempo más largos. Temperaturas ultra elevadas (ultra-high-temperature, UHT): temperaturas alcanzadas º C durante escasos segundos (menos de 3 seg), es un proceso continuo, se requiere envasado aséptico y se logra esterilidad comercial.

14 14 Filtración Este procedimiento es aplicable a la esterilización de líquidos y gases y los microorganismos son removidos y no destruidos. El método es rápido y puede llevarse a cabo a cualquier temperatura. Cuando el líquido a filtrar es termosensible se aplica la técnica de filtración. El líquido o el gas pasa por un filtro, que es un dispositivo con poros demasiados pequeños para que pasen los microorganismos, pero lo suficientemente grandes para permitir el paso de un líquido o un gas. El tipo de filtro de esterilización seleccionado dependerá del tamaño de las sustancias contaminantes que se quieran excluir. Algunas células microbianas pueden medir más de 10 µm de diámetro, mientras que las bacterias más pequeñas tienen un diámetro inferior a 0,3 µm. La filtración se utiliza para esterilizar soluciones termolábiles. Se usa para esterilizar aceites, soluciones oftálmicas, soluciones intravenosas, radioisótopos, vacunas, hidratos de carbono, medios para cultivos celulares, y soluciones de antibióticos y vitaminas. Existen tres tipos de filtros: a) Filtros de profundidad: Un filtro de profundidad es una lámina fibrosa compuesto de matrices dispuestas al azar de fibras de papel, asbesto o vidrio que se solapan. En este tipo de filtros las partículas quedan atrapadas en las tortuosas vías creadas a través de la profundidad de la estructura. Dado que el material de filtración está dispuesto al azar en una lámina gruesa, los filtros de profundidad se emplean a menudo como prefiltros para eliminar las partículas más grandes de las suspensiones líquidas y evitar la obstrucción del filtro final del proceso de esterilización. Los filtros de profundidad también se utilizan para esterilizar por filtración el aire en los procesos industriales. En el ámbito doméstico, el filtro que se utiliza en los sistemas de aire acondicionado es para atrapar partículas de polvo, esporas y alérgenos. Los filtros de profundidad son importantes para las aplicaciones de bioseguridad. Por ej. en las manipulaciones de cultivos celulares, cultivos microbianos, etc. Estas operaciones se pueden realizar en una cabina de seguridad biológica con flujo de aire, dirigido a través de un filtro de profundidad llamado filtro de aire particulado de alta eficacia (HEPA). Un filtro HEPA típico consiste en una lámina de fibras de vidrio de borosilicato que se ha tratado con un aglutinante y se ha plegado para aumentar el

15 15 área total de su superficie. Este filtro está montado sobre un marco rígido que lo sostiene. El control de partículas aéreas mediante filtros HEPA permite la construcción de habitaciones limpias y habitaciones de aislamiento para casos de cuarentena, así como laboratorios de seguridad biológica especializados. Los filtros HEPA suelen eliminar partículas de 0,3 µm con una eficacia del 99,97%. b) Filtros de membrana: Los filtros de membrana son los que se usan más habitualmente en los laboratorios de Microbiología para esterilizar líquidos. Los filtros de membrana se componen de polímeros con una elevada resistencia como acetato de celulosa, nitrato de celulosa o polisulfona- diseñados para presentar numerosos poros diminutos. En la actualidad se usan filtros de membrana con poros de un tamaño determinado, 0,45 µm y 0,22 µm. El tamaño de poro más usado es de 0,22 µm. Se dispone de filtros con poros de 0,01 µm, un tamaño que puede retener los virus. Alrededor del 80-85% de la superficie de la membrana está constituida por poros abiertos, obteniéndose una tasa de flujo de líquido alta. Los filtros de membrana previamente esterilizados diseñados para esterilizar volúmenes pequeños y medianos de líquidos, tales como los medios de cultivo se utilizan en forma rutinaria en los laboratorios de investigación. La filtración se realiza utilizando una jeringa, una bomba de vacío para hacer pasar el líquido a través del aparato de filtración y recolectarlo en un recipiente esterilizado. El mecanismo de acción de los filtros de membrana es por efecto tamiz únicamente. Además de actuar como esterilizantes tienen otras utilidades en Microbiología: recuentos, concentración, separación de microorganismos, etc. Ventajas: - Filtran más rápido - Filtran únicamente por efecto tamiz - No alteran las características organolépticas del líquido - Filtran por presión negativa o positiva

16 16 - No ensucian los líquidos esterilizados - Se pueden esterilizar en autoclave y se desechan luego de su utilización. c) Filtros de nucleación (nucleopore): Son películas muy delgadas de policarbonato que son perforadas por un tratamiento conjunto con radiación nuclear y sustancias químicas. Son filtros con orificios muy regulares que atraviesan la membrana verticalmente. Funcionan como tamices, evitando el paso de toda partícula con un tamaño mayor al del poro. Sin embargo por la menor cantidad de poros, la velocidad de flujo a través de estos filtros es más baja que a través de los filtros de membrana y el atascamiento se presenta más rápidamente. Los filtros de nucleación se usan en microscopia electrónica de barrido para aislar especímenes. Los microorganismos se separan del líquido y se concentran en un único plano en la superficie del filtro, donde se pueden observar al microscopio. Esterilización de gases La filtración de aire se logra mediante filtros de partículas de aire de gran eficiencia (high efficiency particulate air, HEPA) diseñados para eliminar microorganismos de más de 0,3 µm de diámetro de habitaciones de aislamiento, quirófanos, salas de prematuros, quemados, y cámaras de bioseguridad (CBS). Los filtros HEPA tienen una eficiencia del 99,97%. El mecanismo de acción es por efecto tamiz. Filtros ULPA: son filtros con características similares a los filtros HEPA, pero tienen una eficiencia de 99,999% para partículas de un tamaño entre 0,1 y 0,2 µm. Radiaciones Las microondas, las radiaciones ultravioletas (UV), los rayos X, las radiaciones gamma y los electrones son tipos de radiación que pueden reducir el crecimiento microbiano de forma eficaz si se aplican en la dosis y durante el período de tiempo adecuados. Radiaciones ultravioletas (UV) La radiación UV entre 220 y 300 nm de longitud de onda tiene suficiente energía para causar modificaciones o incluso roturas en el DNA, que provocan alteración del DNA y la muerte del organismo expuesto.

17 17 Mecanismo de acción: las ondas UV tienen suficiente energía para producir lesiones del DNA letales o modificaciones químicas como uniones cruzadas entre bases que interfieren en la subsiguiente replicación. Los dímeros de pirimidina son los fotoproductos más importantes en las células vegetativas bacterianas. El principal es el dímero de timina (T-T). Como se puede observar, se trata de uniones entre dos pirimidinas adyacentes en la misma hebra de ADN, mediante la creación de un anillo de ciclobutano. Su efecto principal es la distorsión local de la configuración de la doble hélice, que interfiere en el normal apareamiento de bases complementarias; ello, a su vez, provoca una interferencia en los procesos de replicación y transcripción, y secundariamente en el crecimiento de la célula. Presenta la desventaja adicional de que la mayoría de las bacterias tienen procesos enzimáticos activos que bajo condiciones favorables permiten la reparación del daño inducido por la luz UV, y de este modo resulta bastante frecuente la recuperación de células irradiadas. Aplicaciones: la luz UV se utiliza para la desinfección de superficies, aire y otros materiales como el agua que no absorben la radiación UV. Por ejemplo las cabinas de los laboratorios de biología vienen equipadas con una lámpara microbicida de luz UV (lámpara de vapor de mercurio) para descontaminar su superficie después de ser utilizadas. No obstante, la radiación UV no penetra las superficies sólidas, opacas, los materiales empaquetados, el vidrio, plásticos, líquidos turbios, resulta muy absorbida por estos materiales, y su utilidad se limita a la desinfección de las superficies expuestas. La eficiencia de esta lámpara se ve seriamente afectada por el polvo atmosférico, la disminución de la temperatura ambiental y el envejecimiento de la lámpara. Se usan ampliamente las lámparas de vapor de mercurio, que emiten 90% de su radiación a 254 nm para disminuir la infección del aire en salas de hospitales, quirófanos, y habitaciones en que se alojan animales de experimentación. También son útiles en zonas del laboratorio usadas para transferencias bacterianas, para disminuir la contaminación de cultivos y la infección de los operarios. Es importante proteger los ojos con gafas puesto que una exposición excesiva de la córnea a la luz UV produce una grave irritación.

18 18 Radiaciones ionizantes Mecanismo de acción: se absorben dentro de la célula produciendo la ionización de los contenidos celulares, formación de radicales libres, y moléculas excitadas y esto lleva a la desorganización de enzimas y del DNA. Son radiaciones electromagnéticas de alta energía El grado del daño sobre el DNA depende de la dosis recibida y puede llevar a la muerte celular. A diferencia del calor, el efecto de la radiación gama es acumulativo, es decir que dosis divididas son igualmente efectivas que una única dosis de la misma magnitud total. Es altamente penetrante y no induce radioactividad. Todos los microorganismos incluidos los virus son afectados por la radiación. Actualmente se consideran suficientes, dosis de radiaciones de 2,5 Mrads, lo cual brinda un factor de inactivación de aproximadamente 10 7 para esporas de Bacillus pumilus en condiciones de anoxia y de aproximadamente 10 9 para Streptococcus faecium. Aplicaciones: productos farmacéuticos: antibióticos como ampicilina y estreptomicina; vacunas, hormonas. Material médico-quirúrgico: guantes de goma descartables, injertos óseos y de tejidos, implantes (válvula cardiaca), catéteres, suturas quirúrgicas, jeringas desechables, agujas, bisturíes, etc. Actualmente las radiaciones gamma se utilizan en la industria de alimentos. Controles de esterilidad y esterilización Concluido el proceso de esterilización se dispone de diversos elementos para comprobar la eficiencia del mismo. Independientemente del método empleado es necesario realizar un control para asegurarse que el tratamiento ha sido adecuado. Hay dos tipos de controles: A) Control de esterilización: es el que se realiza para comprobar si se cumplieron las condiciones del procedimiento empleado.

19 19 B) Control de esterilidad: es el que se realiza sobre las muestras o alícuotas del material esterilizado con el objeto de comprobar la ausencia total de microorganismos en el mismo. Controles de esterilización a) control biológico: se utilizan como indicadores, esporas bacterianas, que constituyen el material de elección por su gran resistencia. Para su realización, las esporas son desecadas a partir de una suspensión acuosa, y colocadas sobre pequeñas tiras de un material de prueba apropiado (pueden usarse diferentes soportes, además del papel) para el tipo de proceso y las cargas usados. El inóculo usado es del orden de esporas por pieza testigo. Para cada proceso de esterilización colocar las tirillas con esporas (Bacillus stearothermophilus: para todos los procesos por calor húmedo) en lugares estratégicos, donde el calor o cualquier otro tratamiento empleado sea más difícil de penetrar. En este método se somete el indicador al mismo tratamiento esterilizante que el material a esterilizar. Los indicadores biológicos una vez cumplido el proceso de esterilización se colocan en un caldo nutritivo adecuado, y se incuban a 37º C durante 24 h (cualquier espora sobreviviente tendrá oportunidad para desarrollar), si el procedimiento estuvo bien realizado, el caldo nutritivo no muestra desarrollo bacteriano. Estos indicadores también se presentan en ampollas con caldo de cultivo incorporado. : Este método a pesar de que no puede ser leído inmediatamente (por el tiempo de incubación) es el más confiable. b) Control físico: Termocupla Es un método directo que registra la temperatura a la cual se desarrolla la esterilización. Consiste en colocar sondas en puntos significativos en la carga a ser esterilizada y registra la temperatura. Consiste en dos metales que están en contacto y por diferencia de temperatura generan una fuerza electromagnética que se detecta en un instrumento que puede hacerse incidir en una aguja inscriptota sobre una cinta que gira 360º en 12 ó 24 h. Son termógrafos e indican la temperatura alcanzada y durante cuanto tiempo se mantuvo la misma. De este modo queda un testigo de todas

20 20 las operaciones realizadas ese día. Este método permite que el proceso de esterilización sea controlado directamente y su eficiencia determinada sin demora. c) Controles químicos: sustancias químicas de punto de fusión conocido y bien definido Tubos testigos que contienen sustancias que funden a las temperaturas de esterilización, pero no resultan muy satisfactorios, porque no dan información sobre la relación temperatura/tiempo como tampoco miden la penetración del vapor. Estas sustancias suelen utilizarse para esterilizadores por vapor. Para tratamientos a 121º C se recomienda sustancias tales como anhídrido succínico (PF: 120º C) o ácido benzoico (PF: 121º C) y para tratamientos a 115º C es apropiado el azufre (PF: 115º C). Estas sustancias están mezcladas con un colorante y al fundir indican si se alcanzó la temperatura óptima de esterilización. Otros serían los tubos de Browne (hay varios tipos), que contienen una mezcla de reacción en solución e indicadores ajustados de forma tal que se necesita una combinación específica de tiempo y temperatura para que ocurra la reacción y se produzca el viraje del indicador. Además, existen cintas adhesivas sensibles al calor o radiación que modifican su color cuando se alcanza la temperatura o dosis deseada. También se dispone de tiras de papel impregnadas con derivados de 2,4- dinitrofenilhidraciana que funde a la temperatura de esterilización. Actualmente existen, los llamados integradores de esterilización que son una clase superior de indicadores, que mediante un cambio cromático progresivo integran todas las variables críticas del proceso. Estos integradores para calor seco (cambian de color del amarillo al marrón: ciclo correcto) y para vapor (cambian de color amarillo al azul: ciclo correcto). d) Otros indicadores químicos: envases conteniendo una solución de cloruro de magnesio con indicador azul de bromofenol para el control del proceso de esterilización con óxido de etileno, el cual luego de una exposición adecuada se alcaliniza y cambia el color del indicador. e) En la esterilización por filtración es necesario controlar la integridad del filtro, el cierre hermético entre la membrana y el soporte, la membrana normalmente no deja

21 21 pasar el aire, por lo tanto si no está rota, y el filtro se armó correctamente no debe pasar el aire. Controles de esterilidad Consiste en tomar muestras representativas de los objetos o materiales esterilizados y realizar controles con el fin de asegurar la no presencia de microorganismos. Si se trata de un medio de cultivo rico fraccionado en tubos, se toma los de la zona central de la cesta que los contiene, que es donde se supone que alcanza más difícilmente la temperatura y se incuban directamente. Si se trata de una sustancia termolábil esterilizada por filtración, se toma una alícuota y se coloca asépticamente en un medio de cultivo adecuado. Según la Farmacopea Argentina se debe usar: medio de tioglicolato para bacterias anaerobias incubando durante 7 días, agar nutritivo para bacterias aerobias e incubando durante 48 h, y en medio de caseína de soja para hongos incubando 10 días a 22 25º C. Microorganismos esporulados usados en controles de esterilización: - Bacillus stearothermophilus: para esterilizadores de vapor - Bacillus subtilis vr. niger: para esterilización por oxido de etileno - Bacillus subtilis vr. níger o Clostridium tetani: para esterilización por calor seco - Bacillus pumilus o Streptococcus faccium: para esterilización por radiaciones ionizantes MÉTODOS QUÍMICOS Oxido de etileno: destruye las bacterias en estado vegetativo, el bacilo de la tuberculosis, las esporas y los virus. El mecanismo de acción: es por alquilación, modifica la estructura molecular de las proteínas; los hidrógenos lábiles de las proteínas, como SH, -COOH u OH, son reemplazados por grupos alquilos, a través de reacciones irreversibles que alteran los procesos de reproducción y metabólicos normales de las células. Aplicaciones: se debe usar para esterilizar aquellos materiales que no pueden ser esterilizados por vapor o calor seco, como: - Fibras artificiales

22 22 - Aparatos termolábiles y ópticos - Accesorios de máquinas de circulación extracorpórea - Accesorios de respiradores - Hilos de sutura Ventajas: Es bactericida, esporicida y virucida Posee un coeficiente de difusión muy favorable Necesita humedades relativas superiores al 60% Puede usarse para material termosensible o muy delicado (cuero, libros, etc.) Desventajas: Es potencialmente explosivo e inflamable Tiene tendencia a polimerizarse Acción lenta. Se requieren concentraciones de 500 mg/l por un tiempo de aproximadamente 2 h con factores de inactivación de 10 7 para esporas de B. subtilis. Pueden emplearse tiempos de 3 4 h para garantizar un amplio margen de seguridad, Puede ser incompatible con algunos plásticos Es tóxico. Puede producir toxicidad aguda o crónica en el operador. Aguda: por inhalación comparable con el amoníaco puro, irritación ocular, irritación respiratoria, vómitos y diarrea, cefalea, quemaduras, reacciones de hipersensibilidad. Crónica: anemia, hepatotoxicidad, disminución del sentido del olfato, neurotoxicidad, aumento de incidencia de cáncer como leucemia y cáncer de estomago, irritación respiratoria e infección secundaria. Formaldehído: Puede resultar tan efectivo como el óxido de etileno siempre que se alcancen y se mantengan las condiciones correctas y que los artículos a esterilizar las soporten. Posee altos coeficientes de temperatura y de concentración, es de muy bajo poder penetrante, tiende a polimerizarse a una forma inactiva a bajas temperaturas, lo cual reduce rápidamente la concentración efectiva. Es afectado por materia orgánica como suero, esputo, pus, lo cual puede requerir tiempos de exposición prolongados.

23 23 Los artículos esterilizados mediante formaldehído deben estar perfectamente limpios, libres de sustancias protectivas, en envases abiertos. La humedad relativa debe ser mantenida entre el 80 y 90%, la temperatura por encima de 60º C, y la concentración al mayor nivel posible. El tiempo de exposición debería ser lo más prolongado posible y no menor de 4 h. Glutaraldehído: soluciones alcalinas pueden resultar esporicidas y adecuadas para la esterilización de superficies. Se necesitan concentraciones del 2% en solución acuosa a ph 7,5 y 8,5, el cual se logra con el agregado de 0,3% de bicarbonato de sodio que actúa como buffer, pero reduce la estabilidad de la solución a 2 semanas cuando se mantiene a 20º C, porque puede ocurrir una polimerización inactiva. Aplicaciones y precauciones Se pueden esterilizar por este método todo tipo de instrumental que no pueda esterilizarse por calor (inoxidables, lentes, sintéticos flexibles, etc.) efectuando inmersiones en cubas apropiadas. El material que va a ser esterilizado o desinfectado por este método debe lavarse previamente con abundante agua para reducir la presencia de sustancias orgánicas comunes (sangre, suero, pus, etc.). Deben utilizarse guantes de goma y antiparras durante su empleo porque es irritante de mucosas, piel y membranas. El material tratado debe enjuagarse muy bien con agua destilada estéril y secar con nitrógeno o se puede lograr un secado rápido con una mezcla de alcohol y agua (50%). Se debe trabajar en lugares que se pueden airear ya que el glutaraldehído es muy irritante y volátil. El mecanismo de acción del glutaraldehído y formaldehído es por alquilación. Gas plasma: es un sistema de esterilización a baja temperatura. Existen dos métodos de esterilización por producción de gas plasma: A) Peróxido de hidrógeno-gas plasma: se vaporizan 1,8 ml de peróxido de hidrógeno al 58% en una cámara de esterilización, el vapor es convertido en plasma cuando es expuesto a energía de frecuencia radial. El plasma consiste en partículas altamente cargadas y radicales libres que esterilizan instrumentos

24 24 en aproximadamente 1 hora y no produce residuos o emisiones tóxicas, dado que los productos finales son vapores de agua y oxígeno. B) Acido peracético-gas plasma: se provee una emisión continua de gas peracético dentro de la cámara de esterilización, cuando este gas es sometido a energía de frecuencia radial se convierte en estado de plasma. Estos métodos son tecnologías emergentes, que por el momento sólo pueden ser utilizadas en hospitales, y aún no han sido desarrollados como para poder ser usados a nivel industrial. Mecanismo de acción: consiste en partículas altamente cargadas y radicales libres esterilizantes. Aplicaciones: se puede esterilizar material metálico y no metálico e instrumental médico sin los efectos degradantes del vapor de agua, que puede deteriorar el instrumental de microcirugía. Los artículos esterilizados pueden ser usados inmediatamente o ser almacenados en empaques protectores hasta que sean utilizados. No se pueden esterilizar productos de celulosa, muselina, algodón, papel, agua, materiales orgánicos. ANTISEPTICOS - DESINFECTANTES Es importante destacar que, los agentes químicos que son usados para destruir microorganismos sobre objetos inanimados se denominan desinfectantes, mientras que antisépticos son aquellos que matan o inhiben el crecimiento de los microorganismos y pueden aplicarse sobre tejidos vivos. Desinfectantes. Clasificación de acuerdo a su mecanismo de acción: A) Agentes que dañan la membrana celular 1) Detergentes : a) catiónicos b) aniónicos c) no iónicos 2) Compuestos fenólicos: a) fenol b) cresoles c) bisfenoles (triclosán)

25 25 3) Alcoholes: a) etanol b) isopropanol B) Agentes desnaturalizantes de proteínas a) Ácidos y bases fuertes b) Ácidos orgánicos no disociables C) Agentes modificadores de grupos funcionales de proteínas y ácidos nucleicos 1) Metales pesados a) compuestos mercuriales b) compuestos de plata 2) Agentes oxidantes a) halógenos b) agua oxigenada c) ácido peracético Agentes que dañan la membrana celular Agentes tensioactivos. Los compuestos tensioactivos incluyen los jabones y detergentes. El jabón tiene escaso valor como antiséptico pero desempeña una importante función en la eliminación mecánica de los microorganismos. Los agentes tensioactivos más utilizados son los detergentes catiónicos, en especial los compuestos de amonio cuaternario. Estos compuestos presentan una fuerte actividad bactericida contra las bacterias Gram positivas y menos contra bacterias Gram negativas. También son fungicidas y viricidas contra los virus envueltos. No destruyen las endosporas ni las micobacterias. Mecanismo de acción: afectan la membrana citoplasmática, alteran la permeabilidad de la célula y provocan la pérdida de constituyentes citoplasmáticos esenciales, como el potasio. Uno de los compuestos de amonio cuaternario más utilizado es el cloruro de benzalconio, el cual presenta una fuerte acción antimicrobiana. Fenoles. Los derivados fenólicos ejercen su actividad al lesionar las membranas citoplasmáticas que contienen lípidos, lo que determina la pérdida del contenido celular. El fenol no se utiliza en la actualidad debido a los efectos irritantes sobre piel.

26 26 Alcoholes. Los alcoholes ejercen su acción mediante la desnaturalización de las proteínas y la disolución de los lípidos. La acción desinfectante aumenta con la longitud de la cadena alifática de los alcoholes. Dos de los alcoholes más utilizados son: Etanol: el etanol puro es menos eficaz que las soluciones acuosas porque la desnaturalización requiere agua. La concentración óptima recomendada de etanol es del 70%. Disuelve los lípidos que protegen a los microorganismos de la piel. Isopropanol: es menos volátil y más potente que el etanol como antiséptico y desinfectante.. B) Agentes desnaturalizantes de proteínas Ácidos y bases fuertes: son activos bactericidas, debido a los grupos H + y OH - disociados, respectivamente. Ácidos orgánicos: Los ácidos orgánicos simples o sales de ácidos orgánicos se utilizan como conservantes de alimentos. El ácido sórbico o su sal más soluble sorbato de potasio y el benzoato de sodio impiden el crecimiento de hongos filamentosos en alimentos. C) Agentes modificadores de grupos funcionales de proteínas y ácidos nucleicos Estos agentes se caracterizan porque alteran grupos que forman parte de los centros activos de enzimas y otras proteínas; alteran grupos funcionales de ácidos nucleicos, componentes de pared y membrana. Metales pesados: Varios metales pesados, como la plata, el mercurio y el cobre, pueden ser germicidas o antisépticos. Cuando estos iones se combinan con los grupos sulfhídrilo existentes en las proteínas celulares se produce su desnaturalización. La plata se utilizaba como antiséptico en una solución de nitrato de plata al 1% para evitar la oftalmía gonocócica neonatal, actualmente se ha reeemplazado por antibióticos.

27 27 Agentes oxidantes. Halógenos: el yodo es uno de los antisépticos más antiguos y más eficaces. Actúa contra toda clase de bacterias y contra endosporas, diversos hongos y algunos virus. El yodo puede combinarse con ciertos aminoácidos para inactivar enzimas y otras proteínas celulares. Sus principales presentaciones son la tintura de yodo ( solución acuosaalcohólica) y iodóforos. Tintura de yodo: es una mezcla de I 2 + IK en alcohol 70%, es un antiséptico de piel. Alcohol iodado: tintura de yodo al 10% en etanol de 96º C. Los iodóforos (combinación de yodo y una molécula orgánica, a partir de la cual el yodo se libera lentamente) son antisépticos. También se emplean en la desinfección de instalaciones en industrias alimentarías. El cloro como gas o en combinación con otras sustancias químicas, se lo utiliza como desinfectante. Su acción germicida está determinada por el ácido hipocloroso que se forma cuando el cloro se agrega al agua. El hipoclorito de sodio se usa para desinfectar superficies, es de acción rápida, es menos satisfactorio para materiales que contienen materia orgánica. El peróxido de hidrógeno es un antiséptico que se encuentra en la mayoría de los botiquines caseros. No es un buen antiséptico para las heridas abiertas, porque el H 2 O 2 es degrado a agua y oxígeno gaseoso por la catalasa tisular. Sin embargo, es eficaz en la desinfección de objetos inanimados. Factores que afectan la potencia de un desinfectante Concentración del agente y tiempo de acción ph Temperatura Presencia de materiales extraños Concentración del agente y tiempo de acción. La concentración para obtener un determinado efecto, así como el rango de concentraciones en que se puede demostrar un determinado efecto, depende del tipo químico del desinfectante y del tipo de microorganismos a eliminar. Existe una estrecha relación entre la concentración del agente y el tiempo necesario para matar una determinada fracción de la población bacteriana.