Germinación de tres especies de cactáceas endémicas de méxico en condiciones asépticas

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1 ISSN X (Versión impresa) ISSN (Versión electrónica) DOI: Centro de Investigaciones de Zonas Áridas Universidad Nacional Agraria La Molina, Lima - Perú Artículo original Germinación de tres especies de cactáceas endémicas de méxico en condiciones asépticas Germination of three species of endemic cacti of Mexico in aseptical conditions Rodrigo M. Villanueva, María del Carmen Navarro*, Héctor R. Eliosa Cuerpo académico de Biología de Grupos de Organismos, Escuela de Biología, Benemérita Universidad Autónoma de Puebla. *Autor para correspondencia. maria.navarro@correo.buap.mx Recibido: 17 de diciembre 2014 Aceptado: 8 de noviembre 2015 RESUMEN Echinocactus platyacanthus, Mammillaria pectinifera, y Escontria chiotilla son especies endémicas de México que tienen importancia ecológica y económica. Sus poblaciones han disminuido principalmente por el comercio y recolección ilegal de especímenes, así como por el cambio de uso de suelo y la industrialización en sus áreas de distribución, en consecuencia las tres especies están incluidas en los Apéndices de la Convención sobre el Comercio Internacional de Especies Amenazadas de Fauna y Flora Silvestres. El cultivo de tejidos vegetales permite la producción de gran número de plantas en corto tiempo y posibilita la conservación ex situ de estas especies. En el presente estudio se construyó una Cabina de Seguridad Biológica como alternativa de campana de flujo laminar y con el uso conjunto de una Cámara de Germinación se evaluó el posible efecto de la escarificación (alcohol, agua a 50 C/10 y 15min) en el porcentaje y la velocidad de germinación. También se determinó el efecto de diferentes concentraciones de suplementos orgánicos y aminoácidos en la formación de brotes mediante cultivo in vitro. El porcentaje de germinación mostró diferencias significativas entre las especies (X 2 =6.37; P= 0.041), el valor más alto se observó en E. platyacanthus (76.11). El índice de germinación también resultó significativamente diferente entre las especies (X 2 =28.013; P< 0.001) y por la interacción entre especie y tratamiento (X 2 =15.01; P=0.020). El mayor valor ocurrió en semillas de E. platyacanthus y M. pectinifera al sumergirlas en agua 50ºC/10 min y 50 C/15 min con y respectivamente. Por otra parte, en el cultivo de tejidos vegetales sólo se observaron tres brotes. Los resultados indican que es factible obtener plántulas de E. platyacanthus y de M. pectinifera cuando sus semillas son tratadas con agua a 50ºC/10 min y 50 C/15 min en cultivo in vitro con materiales de bajo costo. Palabras clave: escarificación, Escontria chiotilla, Echinocactus platyacanthus, germinación, Mammillaria pectinifera.

2 Villanueva et al. ABSTRACT Echinocactus platyacantus, Mammillaria pectinifera, y Escontria chiotilla are endemic Mexican species that have ecological and economic value. Whose populations had decreased owing to the traffic and illegal harvest, also the change in the ground use and industrialization in the distribution areas, in consequence the three species have been included in Appendix of Convention about International Trade of Endangered Species of Wild Fauna and Flora. The vegetable tissues culture allows the production of a big number of plants in a short time and allows ex situ preservation of these species. In the present study a Biological Security Cabin was built as an alternative of a laminar flow cabinet and the combined use of a Germination Cabinet with the purpose of appraise the possible effect of scarification (alcohol, water 50 C/10 min & 50 C/15 min) in the germination percentage and speed. Also the effect of the different concentrations of organic supplements and aminoacids in formation of sprouts by in vitro culture, was determined. The specie affected significantly the germination percentage (X 2 =6.37; P=0.041); the highest value was observed in E. platyacanthus (76.11). The germination index was resulted to be significantly different between the species (X 2 =28.013; P<0.000) and by the interaction between specie and treatment (X 2 = ; P=0.020). The highest value occurred in E. platyacanthus and M. pectinifera seeds by submerging them in water 50 C/10 and 15 min (30.02 and respectively); in vegetal tissue culture only three sprouts were observed. Results indicate that is feasible to obtain seedlees of E. platyacanthus and M. pectinifera when their seeds are treated with water 50 C/10 and 15 min in vitro culture using low cost materials. Keywords: scarification, Escontria chiotilla, Echinocactus platyacanthus, germination, Mammillaria pectinifera. INTRODUCCIÓN México es el país con mayor concentración de cactáceas distribuidas particularmente en zonas áridas y semiáridas (Bravo-Hollis & Sánchez-Mejorada, 1978; Jiménez-Sierra, 2011; Hernández-Oria et al., 2007). Estas plantas tienen valor cultural, social, económico y ecológico, por lo que se les ha dado diferentes usos como: alimento, forraje, medicinal, cercos vivos, ceremonias religiosas y ornamentales, lo que ha provocado un decremento de sus poblaciones debido al comercio y recolección ilegal, además del cambio de uso de suelo y la industrialización. De las 518 especies (25 géneros) y 206 subespecies de cactáceas distribuidas en el país, 276 se encuentran registradas en la NOM-059-SEMARNAT-2010 y 21 en la lista de especies y poblaciones prioritarias para la conservación (Hernández & Godínez, 1994; Bárcenas, 2006; Jiménez-Sierra, 2011; LGVS, 2014). De las cactáceas mexicanas, 80% se han reconocido como endémicas (Jiménez-Sierra, 2011); tal es el caso de Echinocactus platyacanthus, Mammillaria pectinifera, y Escontria chiotilla, las cuales tienen importancia ecológica y económica (Jiménez- Sierra et al., 2007; Navarro & Deméneghi, 2007). Las dos primeras se encuentran en la categoría de protección especial (NOM-059-SEMARNAT-2010), mientras que E. platyacanthus ha sido catalogada como especie amenazada categoría 4 debido a que sus tallos son utilizados para preparar dulces (acitrón) y como forraje (Bravo-Hollis & Sánchez-Mejorada, 1991; Eguiarte & Jiménez, - 2 -

3 Germinación de tres especies de cactáceas endémicas de méxico en condiciones asépticas 1999). M. pectinifera se encuentra en peligro de extinción categoría 2 (Hernández & Godínez, 1994) debido a la excesiva explotación de sus poblaciones con fines ornamentales (Jiménez- Sierra et al., 2007; Navarro & Deméneghi, 2007; Valverde et al, 2009; Portilla - Alonso, 2011). Por otra parte, los frutos de E. chiotilla se emplean en la elaboración de nieves, mermeladas, vinos, pasteles y en la industria farmacéutica como vehículo en pomadas (Nieto, 1980); sus tallos se utilizan como combustible, forraje y en la construcción y delimitación de predios (Casas & Barbera, 2002). Por tales razones las tres especies están incluidas en los Apéndices de la Convención sobre el Comercio Internacional de Especies Amenazadas de Fauna y Flora Silvestres (CITES). Como resultado de la extracción desmedida de cactáceas de su hábitat natural, ha sido necesario implementar acciones para preservarlas o incrementar su tasa de producción por medio de propagación por semillas, esquejes, brotes y vástagos que son considerados métodos tradicionales y de bajo costo o por medio de Cultivo de Tejidos Vegetales (CTV) (Arredondo, 2002), el cual constituye un procedimiento alternativo para la obtención y conservación ex situ de estas especies, principalmente de aquellas que se encuentran en alguna categoría de amenaza (López et al., 2000), debido a que permite su reproducción masiva y la obtención de material vegetal libre de patógenos con características uniformes a partir de semillas, embriones, tallos, meristemos, callos o granos de polen (Aceves & Hernández, 2000; Mendoza, 2007); sin embargo, algunas desventajas del CTV se presentan en la adquisición del material vegetal (Escobedo et al., 2002; Molina et al., 2005; Cuellar et al., 2006) y en la proliferación de bacterias u hongos que afectan y destruyen los cultivos, en consecuencia evitar la contaminación es un aspecto básico durante el desarrollo de ésta práctica (Mroginski & Roca, 1993). Otro aspecto que influye en la propagación de los cactus está relacionado con las características propias de las semillas, como: la viabilidad, que está condicionada por factores como la temperatura, luz y humedad (Bewley, 1997; Flores-Martínez et al., 2008), la longevidad (Franco & Nobel 1989; Rojas-Aréchiga & Batis, 2001), las características genéticas de las especies y la latencia de tipo endógena o exógena (Franco & Nobel, 1989; Rojas-Aréchiga & Batis, 2001; Cardoso, 2009) que en algunas especies se presenta debido al tiempo de germinación o por la morfología de las semillas. En cactáceas se ha observado que existen algunas características químicas o de estructura del embrión que impiden la germinación (Ochoa-Alfaro et al., 2008; Baskin & Baskin, 2014). La latencia puede interrumpirse mediante la escarificación química con el uso de ácidos (Rojas-Aréchiga & Vázquez-Yanes, 2000; García et al., 2004; Rosas-López & Collazo-Ortega, 2004; Ramírez & Valverde, 2005; Sánchez-Salas et al., 2006; Flores-Martínez et al., 2008; Larrea-Alcázar & López, 2008) o de manera mecánica mediante el desgaste de la testa (Álvarez & Montaña, 1997; Flores & Briones, 2001; Sánchez-Salas et al., 2006; Flores & Juardo, 2011). Para E. platyacanthus, M. pectinifera y E. chiotilla, se ha documentado la presencia de latencia fisiológica, que puede inhibirse mediante la aplicación de sustancias químicas o calor (Baskin & Baskin, 2014)

4 Villanueva et al. Para inhibir la latencia en semillas además de los ácidos se emplean otras sustancias como: tween, giberelina, agua destilada a 50ºC o 70ºC y alcohol etílico absoluto. Para las semillas de M. pectinifera y E. chiotilla el ácido sulfúrico ha provocado respuestas favorables 80% y 90% respectivamente. En E. platyacanthus el lavado de semillas por 5 min con agua destilada estéril y en agitación constante, ha ocasionado 85% de germinación. (Ffolliott & Thames, 1983; Medrano-García, 1998; Navarro & Deménegui, 2007; Tenango-Cabañas, 2005; Retes- Pruneda et al., 2007; Martínez-Flores, 2010). Cuando se propagan cactáceas in - vitro es importante considerar las técnicas de desinfección para garantizar su establecimiento, con este fin se ha utilizado agua jabonosa, inmersión en alcohol e hipoclorito de sodio, tween o métodos menos agresivos como agua destilada estéril y agitación constante, que no dañen el material vegetal (Retes-Pruneda et al., 2007; Manzo- Rodríguez, 2010; Cuellar et al., 2006; Tenango - Cabañas, 2005; Martínez Cárdenas et al., 2003; Martínez-Flores, 1999). Las semillas de E. platyacanthus al recibir un tratamiento de desinfección consistente de agua jabonosa corriente, inmersión en alcohol al 70% e inmersión de hipoclorito de sodio al 12% de solución comercial muestran contaminación en un 10.5%. Las semillas de E. chiotilla al ser lavadas con blanqueador comercial (Cloralex al 15%) por 25 minutos no manifiestan contaminación (Manzo-Rodríguez, 2010; Retes-Pruneda et al., 2007). Por otra parte, el uso de etanol (70%) e hipoclorito de sodio para desinfectar las semillas de E. platyacanthus provoca contaminación y oxidación de las partes vegetales en un 30% (Pérez et al., 1998). Los objetivos del presente estudio fueron 1) evaluar el efecto de la escarificación en el porcentaje y el índice de germinación de semillas de E. platyacanthus, M. pectinifera y E. chiotilla mediante el uso de una Cabina de Seguridad Biológica basada en el funcionamiento de una campana de flujo laminar, además de una Cámara de Germinación y 2) determinar el efecto de diferentes concentraciones de suplementos orgánicos y aminoácidos en la producción de brotes en cortes de disco de las plántulas en cultivo de tejidos vegetales empleando una Cabina de Seguridad Biológica y una Cámara de Germinación. MATERIALES Y MÉTODOS El trabajo se llevó a cabo durante un año en el Laboratorio de Ecología Vegetal de la Escuela de Biología de la Benemérita Universidad Autónoma de Puebla a partir de diciembre de Especies de estudio Echinocactus platyacanthus Link & Otto. Los ejemplares adultos alcanzan de 50 cm a 2 m de altura y de 40 a 80 cm de diámetro; sus tallos son simples, grandes, columnares o toneliformes, rara vez ramificados, verde oscuro, en ejemplares juveniles presentan franjas horizontales púrpura o rojas; el ápice está cubierto por abundantes tricomas amarillos; el número de costillas incrementa conforme la edad de los individuos que llegan a contarse hasta 60. Espinas rígidas, amarillentas a grisáceas, subuladas, ligeramente aplanadas, rectas o algo curvas, estriadas longitudinalmente Presenta flores amarillas. Frutos de cm de largo, cm de ancho, largamente oblongos, con tricomas abundantes; semillas mm largo, ca. 1.8 mm ancho, ovadas, pardas a negruzcas, brillantes (Arias et al., 2012)

5 Germinación de tres especies de cactáceas endémicas de méxico en condiciones asépticas Mammillaria pectinifera F.A.C.Weber. Tallos simples, aplanados a globosos con jugo semilechoso, tubérculos mm de largo, comprimidos lateralmente, axilas desnudas, aréolas elípticas. Espinas radiales, pectinadas, adpresas, blancas, sin espinas centrales. Flores de 1 a 2 cm de largo; pericarpelo ca. 1.0 mm largo, mm ancho, tépalos externos oblanceolados, ápice cuspidado, margen ligeramente fimbriado, blanquecino a blancoverdoso, franja media rosado claro a pardo claro, ápice agudo, margen ligeramente fimbriado, blanco, franja media rosada; frutos (-9.0) mm largo, parcialmente embebidos en las axilas de los tubérculos, verde claro a blanco cuando se encuentra seco; semillas mm de largo, mm de ancho, testa negra (Arias et al., 2012). Escontria chiotilla (F.A.C.Weber ex K.Schum.). Tallo principal corto, ramas hasta 2.0 m de largo y de 8 a 20 cm de ancho, costillas agudas, aréolas cm de largo, elípticas, generalmente confluentes en la parte terminal o media de las ramas, distantes entre sí. Espinas radiales de 0.5 a 10 cm de largo, subuladas, rectas, grises, las espinas centrales entre 1 y 7 cm de largo, desiguales, una más larga, rectas, subuladas, pardogrisáceas. Flores cm de largo y 2.0 cm de ancho; pericarpelo 1 a 1.4 cm de largo, cm ancho, brácteas deltoides, ápice acuminado, cartáceas, pardo claro o amarillo claro, tépalos largos, oblongos, ápice acuminado o cuspidado, amarillo. Frutos cm de largo, cm de ancho, púrpura, brácteas cm de largo, cm de ancho, deltoides, amarillas, translúcidas. Semillas mm de largo, mm de ancho (Arias et al., 2012). El material vegetal se obtuvo del banco de semillas de la Colección de Cactáceas y otras Suculentas del Estado de Puebla Helia Bravo - Hollis de la misma institución. Las semillas utilizadas en el experimento habían permanecido almacenadas durante dos años. Condiciones experimentales Para la realización del experimento fue necesario construir una Cabina de Seguridad Biológica basada en el funcionamiento de una Campana de Flujo Laminar; además de una Cámara de Germinación mediante el uso de materiales de bajo costo. Cabina de Seguridad Biológica (CSB) Para su construcción se utilizaron 6 placas de acrílico de 0.3 mm de espesor de 50 cm de ancho por 60 cm de largo, que se unieron con silicón (marca pens) para formar un cubo en cuya base y en el interior se fijó una manguera transparente de 1.5 cm de diámetro perforada cada 7 cm y con las perforaciones expuestas hacia la superficie. Dicha manguera sobresalía en la parte superior derecha del cubo (CSB) y su extremo se unió a la tapa de un recipiente de plástico con capacidad de 5 l que contenía 2 l de agua para la filtración. Al recipiente de plástico se le colocó otra manguera en el fondo, la cual suministraba aire desde un generador artificial para realizar la filtración por agua estéril. Al frente de la cabina se realizaron dos orificios para la colocación de guantes de plástico largos (europlex soft), los cuales fueron pegados con cinta de lámina metálica (scotch) para facilitar la manipulación de los objetos en su interior. La cabina fue colocada en una superficie de madera dentro de un cuarto cerrado que no permitía la entrada de corrientes de aire. Una vez terminada la construcción de la CSB se removieron todos los excesos de silicón mediante un - 5 -

6 Villanueva et al. lavado con antibenzil rojo concentrado (Altamirano) e hipoclorito de sodio (Cloralex; Figura 1a, b y c.). Una semana antes de la siembra la CSB fue desinfectada con antibenzil rojo concentrado (Altamirano), adicionalmente todos los días se roció con hipoclorito de sodio al 50% (Cloralex). Antes de la manipulación de material se lavaron manos y antebrazos con antibenzil rojo, secado al aire y posteriormente un lavado con alcohol al 96%. Para la manipulación y trabajo dentro de la CSB se utilizaron pinzas, navajas y agujas de disección, previamente esterilizadas en autoclave a 121ºC y 15 kg/cm2 de presión durante 25 min. Dentro de la CSB se colocaron dos placas de vidrio esterilizadas de 20 x 10 cm, que fueron utilizadas como área de trabajo y alrededor de ellas fueron ubicadas cuatro lámparas de alcohol, que se encendieron 15 minutos antes de la siembra de semillas manteniéndose así durante el periodo de trabajo. Cámara de Germinación (CG) La CG se construyó con una base de madera (1.30 x 0.60 m) y 4 lámparas de 20 watts/plant - aquarium de 61 cm colocadas sobre la pared (2) y el techo (2); al frente se colocó plástico de invernadero para evitar corrientes de aire (Figura 2.) y tenía capacidad para mantener aproximadamente 300 frascos con una temperatura promedio entre 24 y 26ºC. Diseño experimental. Se llevó a cabo un experimento factorial para determinar el posible efecto de la especie (E. chiotilla, E. platyacanthus y M. pectinifera) y de la escarificación (Alcohol etílico absoluto/ 15 seg, agua caliente a 50 C/10 min y agua caliente a 50 C/15 min) en el porcentaje de germinación y en la velocidad de germinación. Para todos los tratamientos se usaron seis réplicas, cada una con 15 semillas. Por medio del método de flotación se determinó la posible viabilidad de las semillas (Cruz, 2011), se eliminaron las semillas del sobrenadante y de las restantes se seleccionaron aleatoriamente 60 para cada tratamiento. Antes de la siembra las semillas fueron colocadas en sacos de papel filtro (15 semillas en cada uno), posteriormente se sumergieron en hipoclorito de sodio al 15% (Cloralex) durante 15 minutos y después se sometieron a tres enjuagues con agua estéril. Con la finalidad de evaluar el posible efecto de la concentración de suplementos orgánicos en la producción de brotes, a las plántulas obtenidas del experimento de germinación se les eliminó la parte apical y basal. El resto de cada plántula fue segmentado en discos de cuatro milímetros de espesor y se subcultivaron 5 de ellos en medio MS a diferentes concentraciones (25%, 50% y 100%) y un testigo que no contenía suplementos orgánicos ni aminoácidos. Para cada tratamiento se usaron tres réplicas. Debido a la escasez de plántulas de M. pectinifera y E. chiotilla y al tamaño de las mismas, este experimento sólo se realizó para E. platyacanthus. Las semillas y los cortes de disco se colocaron en frascos de vidrio de 100 ml con tapa metálica que contenían 20 ml de medio MS a ph de 5.7 ± 0.1 adicionado con 20gr/l de sacarosa (Dolce Krista), 7gr/l de agar bacteriológico (BD Bioxón) como agente gelificante y 2gr/l de carbón activado (Hycel de México, S.A. de C.V.), este último no se agregó a los frascos de CTV. Antes de sembrar las semillas y subcultivar los cortes de las plántulas los frascos con - 6 -

7 Germinación de tres especies de cactáceas endémicas de méxico en condiciones asépticas medio de cultivo fueron esterilizados en autoclave a 121ºC/1.5kg/cm2 durante 20 minutos. Una vez realizada la siembra y el subcultivo se ubicaron en la CG haciendo una revisión diaria durante 75 días para registrar la germinación, considerada como la emergencia de la radícula, y el número de brotes que se produjeron en los cortes de las plántulas. En ambos experimentos los frascos se movían diariamente dentro de la cámara para minimizar el efecto de la posición del frasco en los resultados. Análisis estadístico. El índice de germinación (IG) se evaluó empleando el índice de Scott & Williams (1984) IG= (ni*ti)/n, donde ni es el número de semillas germinadas al día i, ti son los días transcurridos desde el inicio del experimento hasta el día i y N es el número total de semillas germinadas. De acuerdo con el índice, entre mayor es el valor calculado mayor será la velocidad a la que ocurre la germinación. Para determinar el efecto de la especie y la escarificación en el porcentaje de germinación se utilizó un modelo lineal generalizado para una distribución binomial con función de enlace logit, debido a que los datos no cumplieron los supuestos de normalidad y de homocedasticidad. Para los valores del índice de germinación se realizó una prueba de bondad del ajuste de Kolmogorov-Smirnof (d= 0.114, P>0.20) y posteriormente se utilizó el modelo lineal generalizado para una distribución normal con función de enlace log para detectar las posibles diferencias entre los factores. Los análisis se realizaron con el programa STATISTICA ver. 7. Para la evaluación del efecto de la concentración de suplementos orgánicos en la producción de brotes no fue posible realizar un análisis estadístico en virtud de que la respuesta a los tratamientos fue escasa y no se obtuvieron datos. RESULTADOS Se detectaron diferencias significativas en los porcentajes de germinación por efecto de la especie (X 2 =6.37; P= 0.041). La germinación promedio mayor ocurrió en las semillas de E. platyacanthus ( ) seguidas de las de M. pectinifera ( ), mientras que el menor valor se observó en E. chiotilla ( ). Los tratamientos no afectaron a esta variable ni la interacción de estos con la especie (X 2 =5.017; P= 0.17 y X 2 =1.065; P= respectivamente). Después de una semana de haber sembrado las semillas en todos los tratamientos se registró germinación. Los índices de germinación promedio más altos se observaron para las semillas de E. platyacanthus y M. pectinifera que se sometieron a los tratamientos de agua a 50ºC/10 min y agua a 50ºC/15 min ( ; respectivamente). Al comparar el testigo de cada especie con los tratamientos restantes se registró una mayor velocidad de germinación en E. platyacanthus ( ), seguida de M. pectinifera ( ) y finalmente E. chiotilla con ( ,94). (Figura 3.). El índice de germinación mostró variación por efecto de la especie (X 2 =28.013; P< 0.001) y de la interacción (X 2 =15.01; P=0.02), mientras que para los tratamientos no se detectaron efectos significativos en esta variable (X 2 =3.78; P= 0.285)

8 Villanueva et al. Las semillas de E. platyacanthus germinaron más rápidamente ( ), seguidas de las de M. pectinifera ( ). En contraste las de E. chiotilla necesitaron mayor tiempo para germinar ( ). La interacción especie tratamiento mostró que la inmersión de las semillas de E. platyacanthus en agua a 50ºC/10 min favorece la velocidad de germinación ( ), lo mismo sucede con las semillas de M. pectinifera ( ) al tratarlas con agua caliente pero durante 15 minutos comparado con el tiempo que tardan en germinar las semillas en el testigo ( y respectivamente). Para E. chiotilla los valores del índice oscilaron de a en los tratamientos de agua, el testigo mostró una velocidad ligeramente mayor ( ). Para las semillas de las tres especies que se trataron con alcohol se observó menor rapidez en la germinación. Las plántulas de E. platyacanthus se desarrollaron adecuadamente, presentaron espinas y la coloración verde oscura característica de la especie (Figura 4a.). En algunas plántulas de M. pectinifera se observó hinchazón, rompimiento de cutícula y formación de tejido abundante sin control, el resto de las plántulas presentaron la coloración típica de la especie (Figura 4b.). Algunas plántulas de E. chiotilla exhibieron vitrificación y murieron durante las primeras cinco semanas, la mayoría de los individuos obtenidos presentaron espinas y buena coloración durante su desarrollo (Figura 4c.) Cultivo de tejidos vegetales (CTV) La respuesta a los tratamientos fue escasa, sólo se obtuvieron brotes en los lotes testigo, 50% y 100% de suplementos orgánicos y aminoácidos. Se observó vitrificación de los tejidos (discos de E. platyacanthus) a los 30 días de iniciado el experimento (Figura 5.). DISCUSIÓN En E. chiotilla el porcentaje de contaminación en el cultivo (5.5%) fue ligeramente superior al observado (<5%) en semillas lavadas con blanqueador comercial (Cloralex) al 15% por 25 minutos, coincidiendo con lo observado por Retes-Pruneda et al. (2007). Respecto a E. platyacanthus, las semillas desinfectadas con etanol (70%) e hipoclorito de sodio registraron una contaminación de 10.5%, valor similar al registrado por Manzo-Rodríguez (2010). A partir de estos resultados se infiere que los procesos de preparación del material y esterilización son buenos debido que se aplicaron los lineamientos establecidos en el manual de Cabinas de Seguridad Biológica (Villamil, 2005). El material utilizado en la construcción de la CSB presentó buena calidad y resistencia para realizar cultivos vegetales y puede ser una opción de uso cuando no se dispone de recursos económicos suficientes para la adquisición de una campana de flujo laminar ni de una cámara de germinación, ya que sólo se invirtieron aproximadamente $ para su construcción, siendo una inversión baja si se compara con los costos de las campanas de flujo laminar comerciales. Un inconveniente observado fue el tamaño de la CSB debido a la limitada superficie de trabajo (50 x 60cm), que entorpecía la manipulación del material. El porcentaje de germinación observado en E. platyacanthus (76.11) se encuentra dentro del rango de valores observados ,4% por Rojas-Aréchiga (1995) y Rosas (2002) que se atribuyen a la existencia de variabilidad de distintas poblaciones de la especie, - 8 -

9 Germinación de tres especies de cactáceas endémicas de méxico en condiciones asépticas independientemente de los gradientes latitudinales en los que se encuentre. Además se ha sugerido que las semillas de esta especie presentan latencia fisiológica (De La Rosa-Ibarra & García, 1994; Rojas-Aréchiga et al., 1997; Rosas-López & Collazo-Ortega, 2004) por lo que se esperaría un incremento en la germinación de las semillas al aplicar tratamientos germinativos. En este estudio los tratamientos no mostraron ningún efecto en la germinación de las semillas de E. platyacanthus, posiblemente tratarlas con agua a 50 C/10 min y 50 C/15 min o alcohol no fue suficiente para inhibir la latencia pues se ha observado que cuando se tratan con ácido sulfúrico/5 min se promueve su capacidad germinativa (Navarro et al., 2013) en virtud de que si las semillas se colocan en condiciones apropiadas de germinación y rompimiento de la latencia, el crecimiento potencial del embrión se incrementa y la germinación ocurre (Baskin & Baskin, 2014). Los porcentajes y la velocidad de germinación se relacionan con las características de los individuos productores de las semillas y se ha observado que cuando proceden de plantas sanas que se encuentran en condiciones óptimas, la germinación se incrementa. En este estudio las semillas utilizadas fueron producidas por plantas de invernadero que se mantienen en condiciones óptimas, posiblemente este es un factor que favoreció la germinación además de otros, como la disponibilidad de nutrientes, agua en el medio de cultivo y mínimas impurezas en el agar (Vázquez et al., 1997; Martínez-Flores, 1999; Vinocur et al., 2000; Hernández- Aguilar, 2007; Manzo-Rodríguez, 2010). El agua a 50ºC/10 min y a 50ºC/15 min favorece la velocidad de germinación en las semillas de E. platyacanthus y de M. pectinifera (30.02 y 16.8 semillas/día respectivamente) lo que sugiere que en éste tratamiento la absorción de agua en las semillas ocurrió más rápidamente (Sánchez et al., 2006). También se ha observado que el tiempo de germinación, considerado como la velocidad a la que responden las semillas a las señales ambientales determina el éxito en el establecimiento (Vázquez-Yanes & Orozco-Segovia 1996). Por otra parte, la velocidad de germinación registrada en las semillas de E. platyacanthus y M. pectinifera sugiere una respuesta rápida a los factores ambientales y que sus plántulas son capaces de llegar a establecerse en su totalidad en virtud de que el 100% de las plántulas obtenidas en ambos tratamientos (agua a 50ºC/10 min y 50ºC/15 min) sobrevivieron después de un año de realizado el experimento. La germinación de E. Chiotilla fue escasa (17.5%) con una velocidad de germinación de semillas por día. Estos valores difieren de los observados en 15 días para semillas de mayor tamaño en las que se registra un valor de 94%. Si se considera que la capacidad y velocidad de germinación de las semillas dependen del tamaño y ejemplar que las produce (Tenango- Cabañas, 2005), posiblemente las semillas que se utilizaron en este estudio no presentaban un tamaño adecuado. Este podría ser un factor a considerarse en estudios posteriores. Por otro lado, se ha observado que la aplicación de ácido giberélico a 2.5 mg/l promueve la germinación hasta 71% (Martínez-Cárdenas et al., 2003). Esta información sugiere que la capacidad de germinación de las semillas puede tener una respuesta diferencial de acuerdo con la especie y método de escarificación empleado. A pesar de que el porcentaje de germinación obtenido en este estudio para M. pectinifera fue menor (35.55) al registrado en semillas que no se sometieron a escarificación (hasta 95%) (Navarro & Deméneghi, 2007), los tratamientos pregerminativos no afectaron esta variable, - 9 -

10 Villanueva et al. por lo tanto la escarificación con agentes químicos o agua caliente no es necesaria para favorecer la germinación de esta especie a diferencia de aquellas especies que presentan latencia física en las que se ha observado que la aplicación de agentes químicos aumenta la germinación de las semillas (Baskin & Baskin, 2014). Esto sugiere que las semillas de M. pectinifera no presentan este tipo de latencia. Las técnicas de cultivo in vitro para M. pectinifera generan cambios en el medio donde se produce la germinación, a diferencia de lo que ocurre con la propagación en sustratos de tierra de hoja, negra, peat-moss, cacahuatillo en distintas proporciones, ya que no permite ninguna variación respecto a la posición de la semilla, debido a la firmeza del gel, las concentraciones del medio de cultivo y la pureza del agar que pueden llegar a superar los requerimientos de la especie, lo que puede ocasionar una hiperhidricidad (Vinocur et al., 2000; González- Rodríguez, 2001; Flores et al., 2004), como ocurrió con las plántulas de esta especie en el presente trabajo. Se ha observado que las concentraciones de suplementos orgánicos u hormonas que se adicionen al medio de cultivo, tienen un efecto diferencial en las especies (Clayton et al., 1990). La escasa formación de brotes registrada para las diferentes concentraciones de suplementos orgánicos y aminoácidos, sugiere que posiblemente estos no sean necesarios o que las concentraciones utilizadas en el experimento no fueron adecuadas. La vitrificación en el material vegetal de E. platyacanthus durante el CTV ocurrió posiblemente debido al balance de nutrientes, humedad relativa y disponibilidad de agua en el medio (Debergh, 1983, Martín del Campo, 1997). CONCLUSIONES La Cabina de Seguridad Biológica es un sustituto adecuado de una campana de flujo laminar debido a que asegura la germinación de las semillas de las tres especies empleadas en este trabajo al evitar la contaminación del medio de cultivo. Respecto a los cortes de disco de las plántulas de Echinocactus platyacanthus también se mantuvieron en condiciones de asepsia. Otra ventaja de la CSB consiste en acortar el tiempo para la obtención de plántulas de Echinocactus platyacanthus y de M. pectinifera. Un beneficio adicional es el bajo costo de los materiales empleados y su fácil fabricación. La única desventaja encontrada en la CSB es la dificultad para manipular gran cantidad de material de manera simultánea. El porcentaje de germinación de las semillas mostró diferencias significativas entre las especies, con el valor más alto en E. platyacanthus. Por su parte, el índice de germinación fue afectado significativamente por la especie y por la interacción entre especie y tratamiento por lo que es factible obtener plántulas de E. platyacanthus cuando sus semillas son tratadas con agua a 50ºC/10 min y agua a 50ºC/15 min en cultivo in vitro. Las diferentes concentraciones de suplementos orgánicos producen brotes escasos a partir de los cortes de disco de las plántulas de Echinocactus platyacanthus

11 Germinación de tres especies de cactáceas endémicas de méxico en condiciones asépticas REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Arias, S., S. Gama-López, L.U. Guzmán-Cruz & B. Vázquez-Benítez Flora del Valle de Tehuacán-Cuicatlán. Fascículo 95. Instituto de Biología. Universidad Nacional Autónoma de México. México. Arredondo, G.A Propagación y mantenimiento de cactáceas. Folleto técnico No. 21. Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias. 31 pp. Bárcenas, R Comercio de cactáceas mexicanas y perspectivas para su conservación. Biodiversitas 68: Baskin, C. C. & Baskin M. J Seeds ecology, biogeography, and evolution of dormancy and germination. Edit. Academic Press. San Diego U.S.A. Bewley, D Seed germination and dormancy. The plant cell 9: Bravo-Hollis, H & H. Sánchez-Mejorada Las Cactáceas de México. Vol. I. Universidad Nacional Autónoma de México. México. Bravo-Hollis, H & H. Sánchez-Mejorada Las cactáceas de México. Universidad Nacional Autónoma de México. México. Campo, J. M Propagación de Astrophytum myriostigma (CACTACEA) mediante cultivo de tejidos vegetales. Tesis de licenciatura. Facultad de Ciencias Químicas Universidad Autónoma de San Luis Potosí, México. Cardoso, V. J. M Conceito e classificacao da dormencia em sementes. Oecology 13: Casas A. & G. Barbera Mesoamerican domestication and diffusion; Nobel, P. R (Ed.). In: Cacti: biology and Uses: ; Universidad de California, California. CITES Cactaceae checklist, (15 Nov. 2014). Clayton, P. Hubstenberger, J. & G. Phillips Micropropagation of members of the Cactaceae Subtribe Cactinae, Journal of the American Society for Horticultural Science 115 (2): Cruz, Z. S Evaluación de la germinación y viabilidad de semillas de la especie Cupressus guadalupensis S. Wats producida en el huerto semillero establecido en Chapingo. Tesis de licenciatura. México, D. F. 50 p. Cuéllar, L. Morales,M. & J. Treviño La germinación In vitro una alternativa paraobtener explántes en Cactáceas. Zonas Áridas (10): De la Rosa-Ibarra, M. & H. García Estimulación de la germinación de cinco especies de cactáceas consideradas en peligro de extinción. Phyton-International Journal of Experimental Botany 56: Debergh, P Effects of agar brand and concentration on the tissue culture medium. Physiologia Plantarum 59: Eguiarte, F. L. & C. Jiménez-Sierra Análisis de la distribución y estructura de las poblaciones de Echinocactus platyacanthus Link et Otto, en el Valle de Zapotitlán de las Salinas, Puebla. Instituto de Ecología. Universidad Nacional Autónoma de México Informe final SNIB-CONABIO proyecto No. L009. México D.F

12 Villanueva et al. Escobedo, L. García, H. Rojas, R. & F. Ramírez Propagación in vitro de Mammillaria luethyi G. S. HINTON. Memorias del III Congreso Mexicano y II Latinoamericano y del Caribe sobre cactáceas y otras plantas suculentas: Ffolliott, P. F. & J. L. Thames Collection, handling, storage and pre-treatment of Prosopis seeds in Latin America. FAO, Rome. Flores, J. & E. Jurado Germinación de especies de cactáceas en categoría de Riesgo del Desierto Chihuahuense. Revista Mexicana de Ciencias Forestales 2(8): Flores, J. & O. Briones Plant life form and germination in a Mexican inter-tropical desert: effects of soil water potential and temperature. Journal of Arid Enviroments 47: Flores, J., O. Briones, A. Flores & S. Sánchez Colón Effect of predation and solar exposure on the emergence and survival of desert seedlings of contrasting life-forms. Journal of Arid Enviroments 58(1): Flores-Martínez, A., M. G.I. Manzanero, M. Rojas-Aréchiga, M. C. Mandujano & J. Golubov Importancia de la latencia de las semillas para la conservación de una cactácea endémica de Oaxaca, México. Cactáceas y Suculentas Mexicanas 53: Franco, A. C. & P. S. Nobel Effect of nurse plants on the microhábitat and growth of cacti. Journal Ecology 77(3): González-Rodríguez, E Micropropagación de Mammillaria sp. Tesis de licenciatura Facultad de ciencias. Universidad Nacional Autónoma de México, México. Hernández A. & P.L. Mendaza Condiciones de trabajo en centros sanitarios. En Diario Oficial de las Comunidades Europeas; NTP 233: Cabinas de seguridad biológica: 2-9. Hernández, H. & H. Godínez Contribución al conocimiento de las cactáceas mexicanas amenazadas. Acta Botánica Mexicana (26): Hernández-Aguilar, C Germinación de 5 poblaciones de Echinocactus platyacanthus LINK & OTTO (CACTACEAE). Tesis de licenciatura. Facultad de Ciencias Universidad Nacional Autónoma de México. Distrito Federal, México. Hernández-Oria, J.G., Chávez-Martínez R.J. & E. Sánchez-Martínez Factores de riesgo en las Cactaceae amenazadas de una región semiárida en el sur del Desierto Chihuahuense, México. Interciencia 32(11): Jiménez-Sierra, C Las cactáceas mexicanas y los riesgos que enfrentan. Revista Digital Universitaria 12 (1): Jiménez-Sierra, C., Mandujano, M.C. & L.E. Eguiarte Are populations of the candy barrel cactus (Echinocactus platyacanthus) in the Desert of Tehuacán, México at risk? Population projection matrix and Life Table Response Analysis. Biological Conservation 135: Larrea-Alcázar, D.M. & R.P. López Seed germination of Corryocactus melanotrichus (K. Schum.) Britton & Rose (Cactaceae): an endemic columnar cactus of the Bolivian Andes. Ecología en Bolivia 43(2): Ley General de Vida Silvestre, Diario Oficial de la Federación Lista de especies prioritarias para la conservación en México

13 Germinación de tres especies de cactáceas endémicas de méxico en condiciones asépticas López-Gómez, R. Díaz-Pérez, J. & G. Flores-Martínez Vegetative propagation of three species of cacti: Piyata (Stenocereus griseus); Tunillo (Stenocereus stellatus) y Jiotilla (Escontria chiotilla), Agrociencias 34(3): Manzo-Rodríguez, S Propagación in vitro de Mammillaria coahuilensis var. coahuilensis (Boedeker) Moran y Echinocactus platyacanthus Link & Otto a partir de semilla para su conservación. Tesis de maestría. Colegio de Postgraduados, Edo de México, México. Martínez-Cárdenas, M. Carmona, A. Cabrera,M. & G. Valera Germination studies on Stenocereus griseus and Escontria chiotilla, Acta Horticulturae 598: Martín del Campo, M Propagación de Astrophytum myriostigma (CACTACEA) mediante cultivo de tejidos vegetales. Tesis de licenciatura, Facultad de Ciencias Químicas Universidad Autónoma de San Luis Potosí.San Luis Potosí, México. Martínez-Flores, L Propagación y micropropagación de Echinocactus platyacanthus Link & Otto. Tesis de licenciatura, División de ciencias biológicas y de la salud, Universidad Autónoma de México, Edo de México, México. Medrano-García J Germinación y propagación in vitro de Escontria chiotilla (Weber) Rose. Informe de servicio social. Universidad Autónoma Metropolitana, México. Mendoza, M.G Propagación in vitro de Astrophytum ornatum (De Candolle) Weber (Cactaceae), especie amenazada de extinción. Tesis de licenciatura. Licenciatura en Biología. Universidad Autónoma de Hidalgo, México. Molina, G., Suchini A. & H. Sagastume Conservación in vitro de cinco especies de cactáceas en peligro de extinción de Guatemala, distribuidas en los departamentos de El Progreso y Zacapa, Guatemala: ICTA: Mroginski, A. L. & M. W Roca, Establecimiento de cultivo de tejidos vegetales in vitro. En Roca, W. M. & A. L Mroginski (Eds), Cultivo de tejidos en la agricultura: fundamentos y aplicaciones Centro Internacional de Agricultura Tropical, Colombia Navarro, M. C. & A Deméneghi Germinación de semillas y efectos de hormonas en el crecimiento de Mammillaria pectinifera. Zonas Áridas 11(1): Navarro, M. C., Tzompa, R. & E. M. González Propagación de Echinocactus platiacanthus: efectos del sustrato, viabilidad y escarificación de semillas. Zonas Áridas 15(1): Norma Oficial Mexicana sobre la Protección ambiental-especies nativas de México de Flora y Fauna silvestres-categorías de riesgo y especificaciones para su inclusión, exclusión o cambio- Lista de especies en Riesgo, NOM-059-SEMARNAT-2010,(05 Mar. 2014). Ochoa-Alfaro, A. E., C.O. Silva-Ortega, A. Becerra-Flora, J. Flores-Rivas & J. F. Jiménez- Bremont Effect of salt stress, proline, and polyamines on seed germination of Opuntia streptacantha. Journal of Professional Association for Cactus Development 10: OPS, Biblioteca sede/ Organización Mundial de la Salud Cabinas de seguridad biológica, uso desinfección y mantenimiento, Pérez, E. Pérez, M. Villalobos, E. Meza, E. Morones, L. & H. Lizalde Micropropagation of 21 species of Mexican cacti by axillary proliferation, In Vitro Cellular & Developmental Biology Plant 34:

14 Villanueva et al. Portilla-Alonso, R.M Mammillaria pectinifera (Weber). Cactáceas y Suculentas Mexicanas 56(2):64. Ramírez-Padilla, C.A. & T. Valverde Germination responses of three congeneric cactus species (Neobuxbaumia) with differing degrees of rarity. Journal of Arid Enviroment 61: Retes-Pruneda, J. L., Valadez-Aguilar M. L., Pérez-Reyes M. E. & E. Molphe-Balch Propagación in vitro de especies de Echinocereus, Escontria, Mammillaria, Melocactus y Polaskia (Cactaceae). Boletín de la Sociedad Botánica de México 81: Rojas-Aréchiga, M. & C. Vázquez-Yanes Cactus seed germination: a review, Journal of Arid Environmets 44: Rojas-Aréchiga, M. & A. Batis Las semillas de cactáceas forman bancos en el suelo?. Cactáceas y Suculentas Mexicanas 46: Rojas-Aréchiga, M Estudios sobre la germinación de cactáceas del Valle de Zapotitlán de las salinas, Puebla. Tesis de Maestría en Ciencias (Biología) Universidad Nacional Autónoma de México. Facultad de Ciencias. México D.F. Rojas-Aréchiga, M., A. Orozco-Segovia & C. Vázquez-Yanes Effect of light on germination of seven species of cacti from the Zapotitlán Valley in Puebla, México. Journal of Arid Environments 36: Rosas, L. Y. U Anatomía fisiológica de plántulas de cactáceas bajo estrés hídrico. Tesis de licenciatura. Facultad de Ciencias. Universidad Autónoma de México. México. Rosas-López, U. & M. Collazo-Ortega Conditions for the germination and the early growth of seedlings of Polaskia chichipe (Goss) Backeberg and Echinocactus platyacanthus Link and Otto fa. Grandis (Rose) Bravo-Hollis (Cactaceae). Fyton. 73: Sánchez-Salas, J., J. Flores & E. Martínez-García Efecto del tamaño de semilla en la germinación de Astrophytum myriostigma. Lemaire. (Cactaceae), especie amenazada de extinción. Interciencia 31(5): Scott, S. Jones, R. & W. Williams Review of data analysis methods for Seed Germination, Crop Science 24: Tenango-Cabañas, E Germinación de Escontria chiotilla (Rose) Cactaceae.Tesis de licenciatura. Ciencias Biológicas y de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana. Iztapalapa, México. Vázquez, C., Orozco, A. Rojas-Aréchiga, M. & C. Sánchez - Virgina La reproducción de las plantas: Semillas y Meristemos; Fondo de la cultura económica; México. Vázquez-Yanes, C & Orozco-Segovia A Physiological ecology of seed dormancy and longevity, páginas En S. S. Mulkey, R. L. Chazdon & A. P. Smith (eds.) Tropical Forest Plant Ecophysiology. Chapman & Hall. New York. Villamil, J Cabinas de seguridad biológica: uso, desinfección y mantenimiento; Organización Panamericana de la Salud; Washington, D.C. Vinocur, B. Carmi, T. Altman, A. & M. Ziv Enhanced bud regeneration in aspen (Populus tremula) roots cultured in liquid media. Plant Cell Reports (19):

15 Germinación de tres especies de cactáceas endémicas de méxico en condiciones asépticas FIGURAS Figura 1. Cabina de seguridad biológica (CSB): cuarto establecido para la CBS (a), vista lateral y frontal de la CSB (b y c). Figura 2. Cámara de germinación (CG) utilizada para el establecimiento de cultivos asépticos. Ubicación de las lámparas (a), vista frontal (b)

16 Villanueva et al Testigo Agua 50 C/10 min Agua 50 C/15 min Alcohol 30 Índice de Germinación Escontria chiotilla Mammillaria pectinifera Especie Echinocactus platyacanthus Figura 3. Índices de germinación promedio observados para la interacción especie*tratamiento registrados para las semillas de Echinocactus platyacanthus, Escontria chiotilla y Mammillaria pectinifera después de aplicar diferentes tratamientos de escarificación. (Media + E.E.). Figura 4. Aspectos generales del desarrollo in vitro a los 73 días después de la siembra (a) E. platyacanthus, (b) M.pectinifera y (c) E.chiotilla. Figura 5. Brotes obtenidos en cortes de disco de plántulas de E. platyacanthus para 50% (a) y 100% (b) de concentración de suplementos orgánicos y aminoácidos