Evaluación de contaminación fúngica en un depósito de libros. Caracterización fisiológica de los aislados.

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1 Evaluación de contaminación fúngica en un depósito de libros. Caracterización fisiológica de los aislados. Leandro Fernández García y Eddy Alfonso Maquiera Resumen. En la Universidad de la Habana, en el depósito de libros raros de la Biblioteca Central se atesoran ejemplares únicos, de valor histórico, científico y cultural, que están expuestos al biodeterioro. Con el fin de evaluar la contaminación fúngica del local y caracterizar fisiológicamente los aislados de mayor densidad relativa se utilizó un biocolector de hendidura y Sabouraud-Glucosa como medio de cultivo. La concentración fúngica detectada osciló entre 287 y 494 UFC.m -3 de aire, lo que permitió clasificar este local con una contaminación intermedia y con riesgo para sustratos. Se obtuvo un total de 24 aislados, de los cuales los géneros Penicillium y Aspergillus fueron los de mayor densidad relativa. El 31% de las cepas crecieron a 37 ºC, la producción de fosfolipasas y hemolisinas fue 38 % y 62 % respectivamente. La producción de ácidos, pigmentos y degradación de celulosa fue 54 %, 54 % y 62 % respectivamente. Palabras Claves: Aspergillus, atributos patogénicos, biodeterioro, contaminación fúngica, Penicillium. I. INTRODUCCIÓN Los hongos son organismos cosmopolitas que pueden desarrollarse en los sustratos más variados, en todos los climas de la tierra e incluso en condiciones extremas. [1] Esta diversidad ecológica y algunas características fisiológicas hacen de los hongos potentes contaminantes ambientales. Estas capacidades tienen doble consecuencia: riesgo para los sustratos y el patrimonio en general, y para la salud humana. La calidad ambiental en el interior de los edificios es por tanto uno de los factores básicos en el confort de un local. [2], [3]. La Biblioteca Central de la Universidad de La Habana Rubén Martínez Villena, posee un depósito de libros raros y valiosos que muestra evidencias de deterioro. Este local atesora más títulos y más de ejemplares entre revistas, libros, folletos, fotos, documentos históricos, manuscritos, entre otros, que aseguran y salvaguardan el conocimiento literario, científico, social y político de diferentes épocas y lugares del mundo. A partir de la importancia que tiene el patrimonio que aquí se guarda se realizó la presente investigación con el objetivo de evaluar la contaminación fúngica en un ambiente interior de depósito de libros mediante el empleo del método de captación volumétrica por hendidura; así como determinar la presencia de atributos patogénicos y de biodeterioro en los aislados de mayor densidad relativa. II. MATERIALES Y MÉTODOS A. Toma de muestra El local fue muestreado a las 11:30 a.m. Del 10 de noviembre de 2011, según lo recomendado por Rojas et al. [4] Se siguió un diseño en diagonal (figura 1)y se examinaron tres puntos en el interior y uno en el exterior. Figura 1. Esquema del diseño utilizado en los muestreos. Criterio de FEDECAI-01, 2007 Para la captura del aire se empleó un biocolector Aeroscopio Chirana (Rejilla # 2), utilizando como medio de cultivo Agar Saboraud Dextrosa (Biolife, Italia). Cada punto estaba separado 1 m de la pared y el suelo. Se emplearon tres placas Petri de 9 cm por cada punto. Luego del muestro, las placas fueron incubadas a temperatura ambiente por 15 días. Las unidades formadoras de colonia (UFC) por metro cúbico (UFC.m-3) fueron calculadas según la expresión: UFC.m-3 = * # colonias/flujo de aire. B. Temperatura y humedad relativa La evaluación de la temperatura y la humedad relativa se realizó mediante un Psicrómetro digital, registrándose los valores máximos y mínimos en cada punto. C. Identificación de los aislados Se procedió al estudio de las colonias, identificando a nivel de género de acuerdo con Barnett y Hunter. [5] Para las cepas más promisorias de los géneros más abundantes se siguieron los criterios de identificación de Klich y Pitt. [6] D. Caracterización fisiológica Una vez identificados, los cultivos puros fueron triplicados y conservados en el cepario de la institución. Para el inóculo de las pruebas fisiológicas se preparó una suspensión de esporas en agar detergente semisólido. Los atributos patogénicos evaluados fueron: el crecimiento a 37 C en medio Czapek según Rojas [7]; producción de 22

2 enzimas fosfolipasas en medio con yema de huevo según Pérez et al.; [8] y producción de hemolisinas en medio con sangre de carnero según Bogomolova y Kirtsideli. [9] En todos los casos se realizaron tres réplicas para cada cepa. Los atributos de biodeterioro evaluados fueron: producción de ácidos orgánicos en medio líquido, utilizando como control positivo la cepa de Aspergillus niger (LBMFB-O 5 ) del cepario de la institución referida como productora de ácido cítrico; la producción de pigmentos en medio Czapek; y la producción de celulasas en papel de filtro (medio líquido) como única fuente de carbono y en carboximetilcelulosa (medio sólido), para evaluar las capacidades del degradar el polímero completo o parte del mismo respectivamente, empleándose como control positivo la cepa Chaetomium globosum (LMAFB-101) procedente de la colección de cultivo de hongos del Laboratorio de Micología Ambiental, Facultad de Biología, referida como productora de celulasas. En todos los casos se siguió la metodología de Rojas [7] realizándose tres réplicas para cada cepa. III. RESULTADOS Y DISCUSIONES A. Temperatura y humedad relativa Los valores de temperatura y humedad relativa se muestran en la tabla 1. TABLA 1. VALORES DE TEMPERATURA Y HR EN EL INTERIOR Y EL EXTERIOR DEL LOCAL. C. Identificación de los aislados Se aisló un total de 24 cepas, todas en el grupo de hongos filamentosos. Fueron identificadas a partir de los cultivos puros por taxonomía convencional, representándose en los géneros Penicillium, Aspergillus, Fusarium, Cladosporium, Tritiriachium, Syncephalastrum y 4 no pudieron ser identificados por esta metodología. Los géneros Penicillium y Aspergillus fueron los más abundantes, representando 29 y 25 % del total. Estos resultados son consistentes con lo informado en otros aislamientos de interiores [1], [2], [4]. D. Atributos patogénicos Los mecanismos que poseen o han desarrollado los microorganismos para causar enfermedad se denominan factores de virulencia o atributos patogénicos. Estos son diversos, variando el grupo, género y la especie en cuestión [13]. E. Crecimiento a 37 C El crecimiento a 37 C constituye un factor necesario e imprescindible para declarar a un hongo como patógeno. Esta es la temperatura corporal del hombre y otros animales de sangre caliente. Además influye en la fisiología del microorganismo en la producción y expresión de otros factores [13]. Los resultados obtenidos para el crecimiento a esta temperatura se muestran en la figura 2. La HR resultó el doble en el interior del local que la que existía en el exterior. Esta es una condición muy importante para el crecimiento y esporulación de fúngicos. También la temperatura fue menor en el interior que la del exterior, los valores oscilaban entre C, los cuales son óptimos para el desempeño de organismos mesófilos como muchos hongos filamentosos. [4], [10] B. Concentración fúngica La concentración fúngica detectada osciló entre 287 y 494 UFC.m -3 en el interior del local. En el exterior se obtuvo un valor medio de 930 UFC.m -3. Estos resultados son cuantitativamente diferentes y los aislados cualitativamente diferentes en un 50 %. Estas diferencias permiten calificar al local según Ohge et al. [11] con riesgos para sustratos; y según Wanner et al. [12] en una categoría de contaminación intermedia. Figura 2. Crecimiento de los aislados a 37 C. Las barras representan la media de 3 determinaciones ± desviación estándar. Las cepas Penicillium sp. (B4), Aspergillus sp. (B5), Penicillium sp. (B8) y Aspergillus sp. (B15) mostraron gran desarrollo de micelio, mientras que los aislados Penicillium sp. (B21) y Aspergillus sp. (B23) exhibieron un crecimiento medio. Estas cepas serían las de mayor potencialidad como patógeno animal y humano. F. Producción de hemolisinas El 62 % de las cepas mostró hemolisis en el medio con sangre. Los resultados para cada aislado se muestran en la tabla 2. 23

3 TABLA 2. RESULTADOS DE LAS PRUEBAS FISIOLÓGICAS REALIZADAS A LOS AISLADOS DE MAYOR DENSIDAD RELATIVA Aislado Crec. 37 C Fosfolipasa Hemolisina Ácidos Pigmento Crec. Papel Carboximetilcelulosa Penicillium sp. B2 N P N P P P P Penicillium sp. B4 P N P N N N P Aspergillus sp.b5 P N N N N P P Aspergillus sp. B7 N P N N N P P Penicillium sp. B8 P N N P N N P Penicillium sp. B9 N P P P P P P Aspergillus sp. B12 N P P N P N P Aspergillus sp. B15 P N P N N P P Penicillium sp. B18 N N P P P N P Penicillium sp. B20 N N P P N P P Penicillium sp. B21 P N P P P N P Aspergillus sp. B23 P P P P P P P Aspergillus sp. B24 N N N N P P P P: Indica resultado positivo; N indica resultado negativo Las hemolisinas son proteínas de bajo peso molecular que ocasionan la ruptura de eritrocitos y producen por tanto anemia y anoxia. Consecuencias que son devastadoras para el hospedero. [9] G. Producción de fosfolipasas Las cepas productoras de fosfolipasas se muestran en la tabla 2, estas representan el 38 % del total. Las fosfolipasas producen la disfunción y/o disrupción física de las membranas biológicas. También son necesarias para la infección pulmonar. [8] H. Combinación de atributos patogénicos Realizando un compendio de los atributos patogénicos evaluados, se obtuvo que tres aislados Aspergillus sp. (B23), Aspergillus sp. (B15) y Aspergillus sp. (B5) (figura 3) tienen importantes atributos patogénicos reunidos. Dada esta importancia se identificaron hasta nivel específico como Aspergillus clavatus Dezm. (B23), Aspergillus flavus Link. (B5) y Aspergillus fumigatus Fres. (B15). Figura 3. Combinación de atributos patogénicos probados en las cepas. He, hemolisinas; Cre, crecimiento a 37 C; Li, lipasas. El número que aparece después de las siglas significa la cantidad de cepas que presentaron esa capacidad. I. Biodeterioro El crecimiento de hongos en diferentes soportes puede condicionar el deterioro de los mismos. Las manchas de distintos colores son atribuidas a pigmentos y/o decoloraciones debidas a la excreción de ácidos como parte de su metabolismo y al propio micelio. [14] Los hongos están considerados los organismos de mayor importancia como agentes biodeteriorantes de la materia orgánica, pues además de producir enzimas extracelulares, presentan estructuras somáticas llamadas hifas que ejercen presión mecánica sobre el soporte produciéndole debilitamiento. [14] J. Producción de ácidos orgánicos Los ácidos orgánicos son metabolitos secundarios que se excretan al medio. Tienen una implicación directa en la degradación y transformación química de los sustratos sobre los que crece el hongo. [15, 16] La actividad acidolítica de las cepas resultó positiva para 7 aislados, representando 54 % del total. El resultado de esta prueba se muestra en la tabla 2. Estas cepas fueron capaces de cambiar la coloración del medio, lo que está directamente asociado a la disminución del ph en el medio de cultivo. Esta actividad destaca por ser potencialmente peligrosa para la conservación de los libros y demás materiales que se encuentran en el archivo. 24

4 K. Producción de pigmentos Los pigmentos son sustancias químicas que imparten color a otros materiales por el efecto óptico de la refracción de la luz. Los pigmentos producidos y excretados por los hongos ocasionan manchas sobre los sustratos cuya eliminación es muy difícil. Resultando esta consecuencia uno de los problemas más graves que origina la contaminación microbiológica. [17] Del total de cepas, siete produjeron pigmentos difusibles que cambiaron la coloración del medio. Los resultados para cada cepa se muestran en la tabla 2. Los colores de los pigmentos que se evidenciaron fueron amarillos, ocres y rojos. Las manchas indeseables y perdurables disminuyen y afectan la calidad del patrimonio en general. L. Producción de enzimas celulolíticas Un libro está elaborado de numerosos materiales entre los que se encuentran: tinta, cartón, pegamento, hilo y papel, que es su principal componente. El papel, es un material muy higroscópico, que gana o pierde agua en función del grado de humedad relativa de la atmósfera. Las dimensiones de su superficie varían según la humedad residual de sus fibras. Por lo tanto, si la fibra de celulosa se deshidrata desaparecerán parte de los puentes de hidrógeno de la molécula de celulosa que lo constituye y la fibra se contraerá. Cuando la fibra está, en cambio, bien hidratada se expande. El exceso de agua reblandecerá la fibra hasta desmenuzarla. Estas alteraciones en la estructura físicomecánica del papel favorecen el crecimiento de microorganismos heterótrofos que encuentran en sus componentes químicos estructuralmente alterados una fuente asequible de carbono para su nutrición y desarrollo. [14] Los valores de humedad relativa y temperatura del local, así como las condiciones sanitarias y la antigüedad de los libros almacenados favorecen la acumulación de esporas ambientales y la colonización de hongos en algunos de los materiales de lectura. [18] Los ensayos de actividad celulolítica de las cepas utilizando como única fuente de carbono una cinta de papel de filtro, revelaron que: del total de cepas evaluadas, 8 fueron positivas a esta prueba, representando un 62 % del total. Los resultados de esta prueba se muestran en la tabla 2. Estas cepas fueron capaces de crecer y provocar ruptura del papel. Esto indica que estos hongos pueden vivir de manera óptima utilizando la celulosa como única fuente de carbono. [7] La actividad celulolítica evaluada adicionando al medio carboximetil celulosa, un oligosacárido soluble en agua, fue positiva para el 100 % de las cepas. [7, 14] Esto confirma el resultado obtenido en la prueba anterior e indica que los que no crecieron con la celulosa como única fuente de carbono son capaces de utilizar oligosacáridos como fuentes carbonadas. Los resultados para cada aislado se muestran en la tabla 2. Los hongos que no pudieron degradar el papel directamente pueden presentar ausencia o afectación de la enzima β 1,4 endoglucanasa, enzima cuyo sustrato es la celulosa amorfa y que genera oligosacáridos variables con extremos no reductores al escindir los enlaces β 1,4. El resto de las enzimas del complejo celulolítico si están presentes y de manera activa en estos hongos. Las actividades de la β 1,4 celobiohidrolasa y de la celobiasa se manifestaron al crecer el hongo en un medio donde la única fuente de carbono fue la carboximetil celulosa. M. Combinación de atributos de biodeterioro A diferencia de los atributos de patogenicidad en que se necesita de la presencia de varios para declarar a un hongo patógeno, la presencia de algún atributo de biodeterioro hace peligroso al organismo para el sustrato. En la figura 4 se muestran las actividades que constituyen atributos de biodeterioro que fueron probadas a las cepas. Figura 4. Combinación de atributos de biodeterioro probados en las cepas. Ac, ácidos orgánicos; Pi, pigmentos; Ce, enzimas celulolíticas. El número que aparece después de las siglas, significa la cantidad de cepas que presentaron esa capacidad. La mayoría de las cepas resultaron positivas al menos a una de las pruebas, lo que indica que estos hongos constituyen un riesgo potencial para los libros almacenados en el depósito. Del total de cepas evaluadas, los aislados B2 y B9 del género Penicillium y B23 del género Aspergillus fueron positivos a las tres pruebas, lo que demuestra que estos hongos representan un serio peligro para todo el material. IV. CONCLUSIONES La evaluación de la concentración fúngica del aire del local permitió determinar que existe riesgo para la salud del personal y biodeterioro para los sustratos. Además, el estudio de las capacidades fisiológicas de los aislados permitió detectar cepas con atributos patogénicos y biodeteriorantes. 25

5 RECONOCIMIENTOS Los autores desean agradecer a la doctora Teresa Rojas Flores, al master Michel Almaguer Chávez y a la licenciada Marianela Pérez Colina del laboratorio de Micología del Departamento de Microbiología y Virología de la Facultad de Biología de la Universidad de la Habana, por ejercer como tutores de la investigación. También la máster. Yanelis Acebo Guerrero por toda la cooperación y asesoramiento en el desempeño experimental así como a la profesora doctora Marcia Rojas por su ayuda, ambas de la misma institución. Así mismo a la dirección de la Biblioteca Central de la Universidad de La Habana. REFERENCIAS [1] Calizaya, C.; Salazar, G.; Silva, J. Evaluación de hongos ambientales en mercados de abastos de la ciudad de Tacna Perú. Revista Mexicana de Micología. vol. 31, pp , [2] Rojas, T.; Martínez, E. Monitoreo microbiano del aire interior. Criterios metodológicos. Contribución a la educación y a la protección ambiental. vol. I, pp , [3] Programa de certificación de calidad ambiental en interiores. FEDECAI- 01, [4] Rojas, T; Martínez, E.; Almaguer, M. Aeromicota de ambientes internos: comparación de métodos de muestreo. Boletín Micológico, vol. 23, pp , [5] Barnett, H.; Hunter, B. Illustrated Genera of Imperfect Fungi, Fourth Edition, APS Press. The American Phytopathological Society. USA, [6] Klich, M. A.; Pitt, J. I. A Laboratory Guide to Common Aspergillus Species and their Teleomorphs. Comm. Sc. and Industrial R. Org., [7] Rojas, T. Contaminación fúngica en ambientes interiores y exteriores de la Ciudad de La Habana, Tesis en Opción al grado científico de Doctor en Ciencias Biológicas. Facultad de Biología de la Universidad de La Habana, [8] Pérez, G.; Gonzalez, G.; Díaz, M. C. Actividad de fosfolipasa y susceptibilidad in vitro a fluconazol en aislamientos clínicos y aviarios de Cryptococcus neoforman. Boletín Micológico, vol. 23, pp , [9] Bogomolova, E. ; Kirtsideli, I. Airborne Fungi in Four Stations of the St. Petersburg Underground Railway System. International Biodeterioration & Biodegradation, vol. 63, pp , [10] Madigan, M.; Martinko, J.; Parker, J. Brock Biología de los microorganismos, Pearson Prentice Hall. Cap. 26, [11] Ohgke, H.; Geers, A.; Beckert, J. Normal Range Criteria for Indoor air Bacteria and Fungal Spores in Subartic Climate. Indoor Air. vol. 2, pp , [12] Wanner et al. (1993). Citado por T. Rojas, Contaminación fúngica en ambientes interiores y exteriores de la Ciudad de La Habana, Tesis en Opción al grado científico de Doctor en Ciencias Biológicas. Facultad de Biología de la Universidad de La Habana, [13] Llop, A.; Valdés-Dapena, M.; Zuazo, J. Microbiología y Parasitología médicas, Editorial Ciencias Médicas, La Habana, Caps. 14 y 41, [14] Martínez, H. Caracterización de la microbiota contaminante del depósito de fondos de la biblioteca del Museo Nacional de la Música. Trabajo de Diploma. Facultad de Biología, Universidad de Universidad, [15] Zuluaga, A. et al., Production of Citric Acid with Aspergillus niger NRRL 2270 from Milk Whey. DYNA, Revista de la Facultad de Mina. Universidad Nacional de Colombia, [16] Velázquez, J. A. et al., Obtaining of Citric Acid trough Fermentation with Aspergillus niger Using Substratum of Ripe Dominico Harton Plantain ( musa aab simmonds ), Revista Tumbaga. vol. 5, pp , [17] Mendez - Zavala, A. et al., Fungal Production of the Red Pigment Using a Xerophilic Strain Penicillium purpurogenum GH-2, Revista Mexicana de Ingeniería Química, vol. 6, pp , [18] Castrillón et al., Isolation of Cellulolytic Fungi Causing Biodeterioration of the Central Library of the Universidad del Valle (Cali Colombia), Revista Universidad del Valle. vol. 4, pp , Leandro Fernández García (Autor principal) Estudiante de Microbiología y Virología, Facultad de Biología de la Universidad de la Habana. danaygarcia@infomed.sld.cu Eddy Alfonso Maqueira Estudiante de Microbiología y Virología, Facultad de Biología de la Universidad de la Habana. ealfonso@estudiantes.fbio.uh.cu Dra. Teresa Rojas Flores. (Tutor principal) Jefe de Laboratorio de de Biología de la Universidad de la Habana. trojas@fbio.uh.cu MsC. Michel Almaguer Chávez. Profesor de Micología. Laboratorio de de Biología de la Universidad de la Habana. michelalm@fbio.uh.cu Lic. Marianela Pérez Colina. Profesor de Micología. Laboratorio de de Biología de la Universidad de la Habana. mperez@fbio.uh.cu 26