Ejercicios de repaso curso bioquímica experimental.

Transcripción

1 Ejercicios de repaso curso bioquímica experimental.

2 Ejercicio 1. Métodos espectrofotométricos Completar la tabla con las características de los métodos de purificación de proteínas.

3 Lowry Bradford A 280 nm Aminoácidos o enlaces que reconoce Tirosina y triptófano, en menor grado cisteína e histidina Fenilalanina, Prolina, Arginina, Triptófano Presencia de compuestos aromáticos de proteínas en solución (tirosina, triptófano, fenilalanina) Sensibilidad Alta sensibilidad 1-2µg Muy sensible 1-15 µg Poco sensible µg Compuestos que interfieren Sulfato de amonio Glicerol Mercaptanos Tiempo de adición de reactivos Detergentes Tritón X-100 SDS (Dodecil Sulfato Sódico) Compuestos que absorben a la misma longitud de onda Destruye la muestra SI. Debido a la reacción con cobre SI. Debido a la precipitación de proteínas NO Compuestos empelados para la detección de la proteína. Cobre (Reacción de Biuret) Reactivo de Folin (Reducción) Azul de Coomassie Ninguno

4 Ventajas Aplicaciones Lowry Color estable Alta precisión/exactitud Muy usado Utilizado para proteínas de membrana Bradford Compatible con agentes reductores Alta precisión/exactitud Rápido Utilizado para medir muestras que contengan agentes reductores A 280 nm Simple y rápido No hay pérdida de muestra Extractos crudos, proteínas parcialmente purificadas

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6 Absorbancia Curva estándar BSA y = x R² = BSA (µg)

7 Muestra diluida 1.5 µl Abs μg µg/ µl Sin considerar la dilución

8 Pregunta 2 A) Respecto a los estándares de peso molecular, cual es la banda de alto peso molecular y cual la de bajo peso molecular? B) De acuerdo a lo que sabes de electroforesis el pi de la proteína estará por arriba o por debajo de 8.9. C) Calcula el peso molecular de la banda purificada.

9 PI debajo de 8.9

10 Distancia total recorrida por el frente del gel= 6.8 Distancia recorrida por la banda purificada= 2.6 Peso molecular Distancia recorrida 148 No detectada 2.17 Log peso molecular Rf

11 log PM Curva estándar de proteínas en PAGE-SDS y = x R² = Rf Log PM= (Rf) PM= (2.6/6.8) = PM=

12 PROBLEMA PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS En el lisado crudo (LC) hay una mezcla de 6 proteínas (1,2, 3, 4, 5, β-galactosidasa) y tienes como meta purificar a la β- galactosidasa. Comienzas la purificación con una precipitación con (NH 4 ) 2 SO 4 desde ahora llamado SA. Añades la concentración adecuada de SA a tu LC e incubas toda la noche para generar el sobrenadante (SA-S) y el botón (SA-B) Proteína [(NH 4 ) 2 SO 4 PM pi ] para pp (kda) 1 45 % % % % % β-galactosidasa 45 % Qué concentración de SA usas para pp a la β-galactosidasa? 45 % 2. Después de la adición de SA y la centrifugación, cuáles proteínas tienes en el sobrenadante? 2 y 3 3. Cuáles proteínas tienen en el botón? 1, 4, 5 y b-galactosidasa 4. Después de resuspender SA-B con amortiguador, cuál es el procedimiento que se debe realizar antes de continuar con los pasos cromatográficos DESALADO y porqué? PARA EVITAR LA INTERFERENCIA CON EL PROCESO DE UNIÓN Y/O ELUCIÓN DE LA PROTEÍNA 5. Se te ocurre continuar con la purificación de la β-galactosidasa basado en el peso molecular de la proteína, entonces que columna usarías con este fin? CROMATOGRAFÍA EN FILTRACIÓN EN GEL TAMBIÉN LLAMADA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR

13 Sefadex-G25 SI SOLO ESTÁ SOLO EL GEL DE SEPHADEX, SIN NINGÚN RADICAL ADICIONAL, SE USA EN LA CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR

14 Proteína [(NH 4 ) 2 SO 4 ] para pp PM (kda) pi 1 45 % % % % % β-galactosidasa 45 % Cuáles de las proteínas de la mezcla eluirían primero de la columna de exclusión molecular LAS DE ALTO PESO MOLECULAR 2. Te das cuenta de que no tienes ese tipo de columna, entonces se te ocurre usar cromatografía de intercambio iónico, hay de dos tipos cuál usarías, que carga deben tener las proteínas para que se una a esta columna 3. Qué ph usarías para que se produjera está carga 4. Cuáles proteínas se unirían a la columna 5. y cuáles saldrían de la columna 6. Necesitas algún paso adicional para purificar a tú proteína?, si es así recuerda que solo tienes columnas de intercambio iónico. Explica que harías

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16 Dietilaminoetil (DEAE)-celulosa

17 Carboximetil (CM)-sefadex G25

18 Carboximetil (CM)-sefadex G25 Dietilaminoetil (DEAE)-celulosa

19 5.- Ejercicio construcción de una tabla de purificación Paso Volumen (ml) Actividad total (U) Proteína total (mg) Actividad específica (U/mg) Enriquecimiento (%) EC (1) Veces de purificación SA (2) CII (3) FG (4) Pasos: 1) Extracto crudo 2) Fraccionamiento con sulfato de amonio 3) Cromatografía de intercambio iónico 4) Filtración en gel

20 Actividad (U ): Cantidad de enzima que cataliza la formación de 1 µmol de producto por minuto (μmol/minuto o mmol/minuto ). Unidades: μmol min -1 mg -1 o mmol min -1 mg -1 o U mg -1

21 Paso Volumen (ml) Actividad total (U) Proteína total (mg) Actividad específica (U/mg) Enriquecimiento (%) Veces de purificación EC (1) SA (2) CII (3) FG (4)

22 Rendimiento de la purificación: Porcentaje de la cantidad inicial de la proteína de interés que queda después de cada paso de purificación.

23 Paso Volumen (ml) Actividad total (U) Proteína total (mg) Actividad específica (U/mg) Enriquecimiento (%) Veces de purificación EC (1) SA (2) CII (3) FG (4)

24 Veces de purificación o valor del grado de pureza: Número de veces que se incrementa la actividad específica después de cada proceso de purificación

25 Paso Volumen (ml) Actividad total (U) Proteína total (mg) Actividad específica (U/mg) Enriquecimiento (%) Veces de purificación EC (1) SA (2) CII (3) FG (4)

26 Paso Volumen (ml) Actividad total (U) Proteína total (mg) Actividad específica (U/mg) Enriquecimiento (%) Veces de purificación EC (1) SA (2) CII (3) FG (4) Se obtiene la mayor purificación en el paso de filtración en gel, esto sucede debido a que conforme se van perdiendo proteínas contaminantes en cada uno de los pasos del proceso de purificación (Extracto crudo (1), Fraccionamiento con sulfato de amonio (2), Cromatografía de intercambio iónico (3) y Filtración en gel (4)) el grado de pureza va incrementándose.

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28 Se estudió la cinética de la reacción de la enzima lactato deshidrogenasa en ensayos de velocidad inicial en ausencia y presencia de un inhibidor. Los datos de velocidad inicial que se obtuvieron se dan en la siguiente tabla.

29 A) Gráfica la transformación lineal de la ecuación de Michaelis-Menten (Lineweaver-Burk o dobles recíprocos). 1/S Sin inhibidor Con inhibidor b m

30 1/V (min/mmol) Lineweaver-Burk Sin inhibidor Con inhibidor /S (mm^-1)

31 B) Determinar las constantes cinéticas Vmax, Km y Vmax/Km v max = = 5. 26x10 3 mmol min Sin inhibidor b= m= Km = x10 3 V max Km = min 1 = mm Con inhibidor b= m= v max = = 2. 85x10 3 mmol min Km = x10 3 = mm V max Km = 4. 32x10 3 min 1 EL INHIBIDOR Disminuye Vmax y aumenta Km

32 C) Determinar qué tipo de inhibidor es y por qué. inhibidor mixto INHIBICIÓN Vmax Km Competitivo No cambia Aumenta Acompetitivo Disminuye Disminuye No competitivo Disminuye No cambia Mixto Disminuye Aumenta

33 Ejercicios de cinética Un científico trabajando con un sistema de fermentación observo un tipo de inhibición de su enzima al convertir el sustrato en producto. El observo con cuidado las gráficas que se le produjeron en condiciones estándar e inhibidas (ver Figura). Responde lo siguiente y resuelve el misterio. Qué tipo de gráfico se está representando? Michaelis-Menten Dobles recíprocos Hanes Sigmoide Cuál de las dos curvas representa el efecto del inhibidor sobre la actividad de la enzima? La curva A La curva B Ambas curvas Ninguna El inhibidor presente en el fermentador produce una inhibición de tipo: Irreversible Competitivo No competitivo Mixto Cuál es el efecto del inhibidor sobre la Vmax de la reacción? Incrementarla Disminuirla Ninguno Datos insuficientes Cuál es el efecto del inhibidor sobre la Km de la reacción? Incrementarla Disminuirla Ninguno Datos insuficientes Cómo puede el investigador resolver su problema de inhibición en su fermentador? Disminuyendo la concentración de sustrato Manteniendo la concentración de sustrato Incrementando la concentración de sustrato Datos insuficientes

34 7.- Ejercicio de cinética enzimática Qué es la eficiencia catalítica? La eficiencia catalítica (ε) de una enzima es la relación de o. Cuanto mayor es el valor de ε, mas eficiente es la enzima.

35 Parámetros cinéticos kcat constante de la velocidad catalítica que caracteriza una reacción enzimática Vmax velocidad limite en la que toda la enzima esta formando el complejo enzima-sustrato o Km constante de disociación que caracteriza la unión de una enzima a un sustrato

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38 Un DNA recombinante es un DNA que es creado artificialmente, en donde DNA de dos o más fuentes es usado para crear una sola molécula distinta. Por ejemplo en el ejercicio que se te presenta en la figura, se tienen dos plásmidos que presentan entre otras características resistencia distinta a los antibióticos, una es resistente a ampicilina (pamp) y el otro es resistente a Kanamicina (pkan); sin embargo, ambos tienen secuencias de DNA que pueden ser reconocidas por las mismas enzimas de restricción BamHI y HindIII, hecho que facilitará la formación de un DNA a partir de estos dos plásmidos, aunque la posibilidad de que se forme el DNA deseado es de 1/10.

39 A) Explica porqué la probabilidad es baja, cuáles serán los otros productos? La probabilidad es baja debido a que se utilizan las mismas enzimas de restricción y las cuáles generan los mismos extremos y estos pueden interaccionar entre ellos formando diversos productos y entre ellos el plásmido deseado pkan /pamp

40 Al cortar con las enzimas de restricción se tienen los siguientes productos Si se ligan como una mezcla de los dos vectores podría ocurrir la ligación entre: Producto 1 con 2 = 2332 bp bp Producto 1 con 4 = 2332 bp bp Producto 3 con 2= 3755 bp bp Producto 3 con 4 = 3755 bp bp

41 Después de la transformación del producto de restricción y ligación se realiza la selección en el medio o medios apropiados, se extrae el DNA y se obtiene el gel que se te presenta. B) Cuál de las clonas tiene el plásmido que se muestra en C? fundamenta tú respuesta. Observando en el gel la clona 1 contiene únicamente las secuencias de los plásmidos de interés pkan y pamp con un peso molecular identificado en 3755 bp y 1875 bp Las otras clonas también cuentan también con las secuencias de interés pero no contienen la resistencia a los antibióticos.

42 Ejercicio 9. Conjugación.

43 Un laboratorio de investigación se dedica a la caracterización de cepas bacterianas; en este momento, están trabajando con dos cepas de Escherichia coli. Lo que han descubierto acerca de estas 2 cepas es que ambas son auxótrofas a arginina, leucina y alanina (arg- leu- ala-), que una de ellas es resistente a ampicilina (mientras que es sensible a otros antibióticos) y que la otra es resistente a estreptomicina (y sensible a otros antibióticos). Durante un experimento, accidentalmente mezclan a las dos cepas y para tratar de separarlas, primero las crecen en medio LB y después en medios selectivos (LB + Ampicilina y LB + Estreptomicina). Para la cepa A (AmpR) esperarían que no hubiera crecimiento en el medio LB + Estreptomicina, mientras que en el medio LB + Ampicilina sí. Para la cepa B (StrR) esperarían que no hubiera crecimiento en el medio LB + Ampicilina, LB + Estreptomicina sí.

44 Sin embargo, al realizar el aislamiento, se percatan de que las nuevas colonias son capaces de crecer en ambos medios selectivos! Cómo podrías explicar que las nuevas colonias obtenidas, son resistentes a ambos antibióticos? Cómo podrías demostrar cuál de las dos cepas actúa como donadora y cuál como receptora? Sí el fenómeno es mediado por plásmidos, Cómo determinarías si la cepa es Hfr ó F? NOTA: En el laboratorio han caracterizado diferentes cepas, algunas de ellas son: Cepa C, Escherichia coli F- leu+ Cepa D, Escherichia coli F ala+ Cepa E, Escherichia coli F+ arg- leu- ala-

45 Datos Cepa A Cepa B Auxótrofas arginina, leucina y alanina arginina, leucina y alanina Resistencia Ampicilina Estreptomicina Crecimiento esperado LB + Ampicilina LB + Estreptomicina

46 Cómo podrías explicar que las nuevas colonias obtenidas, son resistentes a ambos antibióticos? Transformación. Es una forma de recombinación (intercambio o transferencia de información genética entre organismos) que se efectúa en varias pero no en todas las especies bacterianas. En este proceso no se requiere contacto entre células ni mediación por cualquier vector Transducción. Tiene lugar cuando bacteriófagos llevan un segmento del cromosoma de una bacteria a otra. Conjugación. Transferencia de ADN de una célula donadora a una célula receptora a través de una conexión intercelular especializada o tubo de conjugación que se forma entre ellos

47 Transformación Transducción Conjugación Contacto NO NO SI Requerimiento de energía Ocurre naturalmente Células que lo desarrollan Si, por ser un proceso activo No Células competentes con factor de competencia No En presencia de bacteriofagos No Bacterias receptoras Con células donadoras y receptoras

48 Por CONJUGACIÓN, al suponer que alguna de las bacterias es donadora con la capacidad de trasferir los genes que codifican para la resistencia de alguno de los antibióticos Podría justificarse por TRANSFORMACIÓN, suponiendo que algunas bacterias se lisaron y dejaron su material genético en el medio de cultivo y pensando que las células receptoras tienen la capacidad de introducir el material genético. La TRANSDUCCIÓN solo podrá justificar este fenómenos si se encontrara evidencia de la presencia de Bacteriófagos dentro del medio de cultivo.

49 Cómo podrías demostrar cuál de las dos cepas actúa como donadora y cuál como receptora? Cepa C F- Leu (+) Mezcla Mezcla Cepa A Cepa B Siembra en medio LB + Ampicilina sin Leu Siembra en medio LB + Estreptomicina sin Leu En donde se observe crecimiento sabremos que es la cepa donadora, debido a que le pasó el plásmido de la resistencia a su antibiótico a la cepa C y al estar en un medio sin leucina la cepa original no crecerá.

50 Sí el fenómeno es mediado por plásmidos, Cómo determinarías si la cepa es Hfr ó F? Hfr. Bacteria que posee un plásmido F integrado a su cromosoma, tiene la capacidad de transferir porciones de su cromosoma por lo que confiere alta frecuencia de recombinación. No transfiere el plásmido F, por lo que al termino de la conjugación la célula receptora permanece como F- F. Célula bacteriana que posee un plásmido F extracromosómico, pero que antes estuvo integrado al cromosoma y que escindió llevándose genes bacterianos. Actúa como célula donadora en la conjugación y trasfiere el factor F junto con los genes bacterianos, trasformando a la célula receptora en una célula F la cual sería un diploide parcial o merocigoto (Tendrá dos copias de los genes bacterianos que están presentes en el plásmido F)

51 Por la propiedad de que la cepa F puede convertir a la célula receptora en F el medio en donde crecieron las células conjugadas se toman algunas colonias y se mezcla con células de la Cepa C (Leu+) y se siembran en medio de cultivo LB + el antibiótico al que son resistentes, si son células F la resistencia se trasmitirá a estas nuevas células y crecerán en el medio con antibiótico. Si son Hfr, no crecerán, debido a que estas células resultantes de la conjugación con Hfr no tienen la capacidad de trasferir la característica, en este caso la resistencia al antibiótico.

52 En caso de ser F Cepa conjugada En caso de ser Hfr Siembra en medio LB + Antibiótico sin Leu Mezcla con Cepa C Mezcla con Cepa C Siembra en medio LB + Antibiótico sin Leu Crecimiento. Debido a que la cepa F tiene la capacidad de transmitir su plásmido No se observa crecimiento. Debido a que la cepa Hfr no transmite el plásmido y la cepa resultante no puede trasmitir la resistencia

53 Problema #10

54 Por qué paso esto? La glucosa como fuente de carbono hace innecesaria la activación operón lac. Los altos niveles de glucosa disminuyen las concentraciones de camp, por lo que no se da el incremento de la afinidad de la RNAp por el promotor y la subsecuente transcripción de genes. CATABÓLICA Qué harías para solucionar el problema? COMPRAR MÁS MEDIO CON...LACTOSA

55 Tabla 1. Predicción de la expresión de los genes estructurales (Z,Y,A) para las cepas mutantes Cepa Genotipo β-galactosidasa (Z) Permesasa (Y) Transacetilasa (A) c/inductor s/inductor c/inductor s/inductor c/inductor s/inductor 1 I - P + O + Z + Y + A I + P + O + Z - Y + A I + P - O + Z + Y + A I d P + O + Z - Y + A I rc P + O + Z - Y + A La cepa I d es incapaz de que el represor se una al operador, por lo que la transcripción siempre esta activa, I d hace que la expresión de genes sea constitutiva.

56 Tabla 2. Predicción de la expresión de los genes estructurales para las cepas mutantes (complementadas con la cepa silvestre). Cepa Genotipo β-galactosidasa (Z) Permesasa (Y) Transacetilasa (A) c/ind s/ind c/ind s/ind c/ind s/ind 1 I - P + O + Z + Y + A + / I + P + O + Z + Y + A I + P + O + Z - Y + A + / I + P + O + Z + Y + A I + P - O + Z + Y + A + / I + P + O + Z + Y + A I d P + O + Z - Y + A + / I + P + O + Z + Y + A I rc P + O + Z - Y + A + / I + P + O + Z + Y + A

57 Bibliografía -»Bioquímica», F. Bennett Armstrong, Reverte, pag. -»Determinación de estructuras orgánicas», Daniel J. Pastl., Reverte pag. -»Química orgánica básica y aplicada: De la molécula a la industria» Vol2, Eduardo Primo Yúfera, Reverte pag. -. Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica, Mc Faddin, J. F., 3 edición, México, Ed. Panamericana, 2004