Selección de detectores en cromatografía de líquido masas. Manuel Gayo Responsable de Ventas Easy Choice
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- Julia Juárez Aguirre
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1 Selección de detectores en cromatografía de líquido masas Manuel Gayo Responsable de Ventas Easy Choice
2 ACOPLAMIENTO DE DETECTORES DE ESPECTROMETRIA DE MASAS
3 Intensidad LC/MS proporciona : Selectividad / Información Estructural La identificación se basa en Selectividad & M Tiempo de Retención Full Scan CID MS/MS of m/z 359 using Ramped CID Voltage Peso Molecular (nominal o exacto ) Inform. Estructural Información Estructural MS/MS n : Relación específica entre Precursor y Fragmentos (proporciona excelente información estructural) Las Técnicas de Ionización API suelen proporcionar poca Fragmentación [M-B] [M-A] [MH] Triolein (C18:1,[cis]-9) MW C57H104O6 Abundance m/z--> Intens. 4 x MS/MS(359), min (#151-#171) m/z <- [MNH ] B A Tiempo
4 2.- Técnicas de ionización en LC/MS:
5 Peso Molecular Aplicabilidad relativa de las técnicas de ionización LC/MS 100,000 10, APPI APCI GC/MS no polar API- Electrospray Polaridad del analito/ Solubilidad en Agua Las interfases LC/MS tipo API (Electrospray /APCI) son hoy en día las más utilizadas muy polar API-Electrospray: La técnica de ionización más suave. Ideal también para compuestos lábiles. Interfase con mayor sensibilidad y aplicabilidad. Válida para compuestos de baja-media a muy alta polaridad que se puedan ionizar en solución. Mediante la formación de iones con múltiples cargas, permite el análisis de compuestos de muy elevado peso molecular. APCI: Válida para compuestos de baja a alta polaridad; no se requiere que estén ionizados en solución. Requiere compuestos con una cierta volatilidad. Buena sensibilidad para compuestos de polaridad y peso molecular intermedios. Técnica que complementa a API - Electrospray para el análisis de analitos poco polares. APPI: Válida para compuestos de muy baja a alta polaridad; no requiere que estén ionizados en solución. Requiere compuestos con una cierta volatilidad. Posibilita el análisis de compuestos apolares.
6 Fuente de ionización API Electrospray N 2 HPLC Nebulizador Skimmers Capilar Octopolo Dínodo de Alta Energía (HED) Gas de secado N 2 N 2 Cámara de Nebulización a Presión Atmosférica ESI Zona NEBULIZACION E IONIZACION Zona de FRAGMENTACION (CID) Zona FOCALIZACION Lentes Zonas Zona SEPARACION IONES Cuadrupolo Electromultiplicador (EM) Zona DETECCION
7 Diseño Ortogonal de la Fuente de Iones API Electrospray NEBULIZADOR ORTOGONAL La punta del nebulizador está en un angulo de 90º con respecto a la entrada del capilar Ejemplo con Polaridad Gas de Nebulización (N 2 ) Mesh Assembly: V (atraerá cargas a la superficie de la gota) Disolvente Nebulizado Entrada Capilar Dieléctrico Iones Desolvatados HPLC Iones en solución 0 V (nebulizador conectado a tierra) muy conveniente para CE/MS V (End Plate) p.e. V cap : -5,000 V (típico ) Gas de secado (nitrógeno calentado) Evaporación Límite Rayleig Alcanzado Explosión Coulomb Evaporación Iónes Analito Desolvatado N 2 SECADO La presencia de sales no volátiles dificultara considerablemente la eficiencia del proceso de desolvatación Para óptima sensibilidad los analitos deben estar totalmente ionizados al ph del eluyente
8 Proceso APCI (Ionización Química)
9 Proceso APPI (Fotoionización) Entrada HPLC Nebulizador Aerosol que contiene al analito Evaporación Vapor Fotones ionizan al analito (con P.I.<10eV) hv hv Vaporizador (calentador) Lámpara Kripton hv Iones de Analito APPI Gas de Secado Capilar Capilar MS Se fotoioniza a un Agente Dopante y éste actúa como gas reactivo
10 Si se ionizan No se ionizan Valores de Energía de Fotoionización Lámpara PhotoMate Kripton emite e - de 10.0 ev y 10.6 ev Potenciales de Ionización (PI) 2,4,6 Trinitrotolueno ev Potenciales de Ionización de Disolventes (PI) Agua Acetonitrilo Metanol ev ev ev Energia lámpara Kripton 10.0 ev, 10.6 ev 4-Nitrotolueno 9.5 ev Cafeina Fluoranteno 7.8 ev Antraceno 8.0 ev 7.4 ev Acetona Tolueno 9.70 ev 8.82 ev
11 Fuentes APCI y APPI para el LC/MSD APCI APPI Entrada HPLC Nebulizador Entrada HPLC Nebulizador Vaporizador (calentador) Gas de Secado Vaporizador (calentador) h Gas de Secado Aguja Corona Capilar Lámpara UV Capilar
12 Doble Fuente con detección SIMULTÁNEA (real) ESIAPCI. Agilent Technologies Fuente ESI Violeta Cristal Fuente APCI Vitamina D3 Fuente Multimodo Fuente ESI Fuente APCI Violeta Cristal Fuente Multimodo Vitamina D3
13 Fuente Multimodo HPLC inlet Nebulizer ESI Zone APCI Zone Corona needle IR emitters Charging electrode Reversing electrode Thermal container APCI counterelectrode Capillary Drying gas Sensor for vapor temperature En la zona ESI se crea un aerosol cargado cuya dirección es ortogonal a la entrada del capilar MS El aerosol es secado por lámparas de IR (no contracorriente de N2) produciendo los iones ESI El aerosol y los iones pasan con el gas de nebulización de la zona ESI a la zona APCI Las lámparas IR vaporizan de modo completo a analito y disolvente en la zona APCI APCI corona se produce entre la aguja y el contraelectrodo y el disolvente se ioniza El disolvente ionizado transfiere carga al analito vaporizado produciendo iones de analito Los iones ESI pasan al lado contrario del separador y son apartados de la zona de APCI corona Un sensor controla la temperatura del vapor de forma que las lámparas IR mantienen la temperatura constante Finalmente los iones ESI y APCI entran simultáneamente al capilar y al MS (US patent 6,646,257)
14 2.- Técnicas de Filtrado de Masas y Detección en LC/MS: Q? QqQ???? TOF-TOF? Qq-TOF? TRAP? TOF? Sector Magnético?
15 PERO QUÉ DETECTOR?. MUESTRA CUANTITATIVO CUALITATIVO MATRIZ SUCIA? SI Sabemos lo que Buscamos? No Necesitamos masa exacta SI TOF No No Menor de 5 pg En columna? SI QQQ >1 ng en columna No SI SI Necesitamos Qualifiers Ions/Spectrum? No o Multi ion SIM Aceptable %RSD: >8% No Q No SI Si-spectrum or MS/MS qualifiers SI Trampa CONCENTRACIÓN? Q TOF QQQ Trampa SI Necesitamos MS/MS? Bbaja concentración $$$> $$> $ No QQQ Q TOF
16 Modelo Conceptual de un Espectrómetro de Masas con Cuadrupolo Fuente de Ionización Externa Emulación CUADRUPOLO Resolución Espectral: baja Filtro de Masas del Cuadrupolo Detector
17 Modelo Conceptual de Espectrómetros de Masas/Masas basados en Triple Cuadrupolos Modalidad MRM ideal para Cuantificación de Trazas de Compuestos Diana en matrices sucias Emulación CUADRUPOLO MS/MS en el espacio 2 modalidades de trabajo: - Product SCAN: universal pero menos sensible. (Cinta en movimiento continuo). - SRM/MRM: muy sensible pero sólo detecta unas pocas masas. (Cinta fija )
18 Modelo Conceptual de un Espectrómetro de Masas con Trampa de Iones Externa Iones de todas las m/z son almacenados hasta el momento de la detección Emulación TRAMPA Ionización Externa Analizador de Masas de Trampa de Iones Resolución Espectral: media Paso 2 - Eyección de los Iones Paso 1 - Almacenamiento de Iones Obtención Espectro de MS 1
19 Modelo Conceptual de un Espectrómetro de Masas de Tiempo de Vuelo (TOF) Detección Iones Emulación TIEMPO DE VUELO (TOF) Técnica Pulsante Analizador de Masas de Tiempo de Vuelo (TOF) Tubo de vuelo del TOF: Zona libre de campo eléctrico. Opcional: Reflectron (espejo de iones) Resolución Espectral: alta Ionización Externa 0 V Campo Eléctrico Pulsante
20 % Abundancia Relativa Comparación Resolución Espectral: TOF vs Trap & Quads Tiempo de Vuelo (TOF) [M4H] 4 Δ=0.25 Intens x Resolución Espectral: TOF > Trap > Q & QQQ 0.4 Cuadrupolo (Q & QQQ) Δ= [M2H] 2 Δ= [M4H] m/z 1 amu 1 amu Iones con 4 cargas: Δm/z = 0.25 Iones con 2 cargas: Δm/z = Δ=0.26 Δ= Trampa Iones (Trap) (modo máxima resolución) Δ=0.5 [M2H] 2 Δ= amu m/z
21 ( - ) FILTRO MASAS ALTAS Analizador-Filtro de Masas: Cuadrupolo ( ) FILTR0 MASAS BAJAS ELECTRODOS POSITIVOS FRECUENCIA RF - 0 DC AMPLITUD AMPLITUD RF Los voltajes aplicados en ambos pares de electrodos son iguales en magnitud pero de signo opuesto. La magnitud del potencial DC controla la masa seleccionada 2 pares de electrodos Hiperbólicos ("rods") a los que se aplica una componente de corriente alterna y otra de continua de igual magnitud pero de signo opuesto 0 - ELECTRODOS NEGATIVOS -DC AMPLITUD AMPLITUD RF
22 Adquisición SCAN versus SIM 25 pg de 3 sulfamidas (250 pg de sulfaclorpiridazina) - CUADRUPOLO MSD1 TIC, Scan 250 pg de compuesto INESPERADO Adquisición SCAN: Proporciona información sobre componentes inexperados de la muestra, pero NO proporciona el mismo nivel de sensibilidad que el modo SIM MSD2 TIC, SIM Adquisición SIM: Proporciona un nivel muy elevado de sensibilidad, pero NO da información sobre componentes inesperados de la muestra. 25 pg 25 pg 25 pg La sensibilidad mejorará en SCAN con la reducción del rango de masas seleccionado y en SIM con la reducción del nº de iones monitorizado La pérdida de sensibilidad en modo SIM, por dedicar el 50% del tiempo del ciclo a adquirir en modo SCAN, es solamente del 30% min
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24 Triple Cuadrupolo: Barrido Completo MS/MS (MS 2 ) DIsociación (CID) en Celda Colisión Menos Sensible en modo Barrido que las Trampas y QqTOF parent ions enter collision cell - collide with argon gas and dissociate Detector API Source /- ions and neutrals formed in API source ion guide transports /- ions to Q1 Q1 is parked allowing only parent ions of a single m/z to pass to the collision cell Q3 is scanned passing full scan product ion spectra to the detector MS/MS en el espacio
25 Triple Cuadrupolo (QqQ): ejemplo modalidad SRM (MRM sucesivos cambios en los iones producto seleccionados en Q3) Ideal para la Cuantificación de Trazas de Compuestos Diana en matrices sucias (coeluciones) Parent Ions Enter Collision Cell - Collide with Ar Gas and Dissociates Detector API Source /- Ions and Neutrals Formed in API Source Ion Guide Transports /- Ions to Q1 Q1 is Parked Allowing Only Parent Ions of a Single m/z to Pass to the Collision Cell Q3 is Parked Passing Only Product Ions of a Single m/z to the Detector Energía de Fragmentación No Selectivaº MS/MS en el espacio
26 MRM (Multiple Reaction Monitoring) para Cuantificar con Máxima Sensibilidad y Selectividad Filtro Masa: Cuadrupolo 1 (Q1) Celda Colisión Cuadrupolo 3 (Q3) Espectro con iones del fondo (API: ESI, APCI, ) Iones de varios compuestos coeluyentes Q1 sólo deja pasar el ión precursor 210 pass 210 Celda Colisión rompe el ión 210 (y sus productos) Modo SCAN Q3 monitoriza sólo los fragmentos 158 y 191 característicos del ión 210 para cuantificar y cualificar con máx. sensibilidad 158 Modo MRM sin fondo químico
27 Trampas de Iones: Obtención Espectro MS n 1-Acumulación 1 2-Aislamiento Ión Precursor Excitación 4 La energía de Fragmentación se aplica selectivamente. Sólo la recibe el Ión Precursor o rango de iones que interese fragmentar 4-Fragmentación He (C.I.D.: Disociación Inducida por Colisión (con helio) del ión precursor) He En una Trampa el proceso de transmisión de Iones de Fuente a Detector es un proceso discontinuo Acumulación Detección: MS Acumulación de Fragmentos 6 6-Detección Espectro MS n MS/MSMS/ Espectro de Masas n (n=1-11)
28 Agilent 1100 LC/MSD-Trap Diagrama 3D de MS 4 de un Péptido, M 384 g/mol MS MS 2 MS 3 MS 4 MS 3 (385/352) MS 4 (385/352/241) MS 2 (385) MS 1 MS 4 (385/352/241)
29 Fundamentos del TOF ó Tiempo de Vuelo ( Time-of-Flight ) Fuente Iones Zona libre de campo eléctrico. Opcional: Reflectron (espejo de iones) Detector 30 kv 0 V 1 E = - m v 2 2 v = 2E m t = Long. Acelerar con la misma energía a los iones procedentes de la fuente Los iones de distinta masa adquieran distintas velocidades y lleguen al detector con distintos tiempos de vuelo 2E m (menor masa mayor velocidad) = Tiempo 1.0 = 91 µsec 2(30000) Técnica pulsante con un intervalo típico de generación de pulsos de 100 µseg. ( pulsos/s) Tiempos Vuelo típicos (vuelo 2m): m/z - µseg.: 118 = 20µs. 622 = 46µs =100µs. Resoluciones en el rango de ppm s requerirán la medición del tiempo de vuelo con una precisión mejor de 1 nanosegundo
30 Masa Exacta Requiere una Elevada Resolución Espectral Intensity, counts 1.30e4 1.20e4 1.10e4 1.00e Resolución Espectral: > a masas bajas > a partir de masas medias Resolución = M/ΔM 922/0.087 = m/z = 922 m/z = 118 R=4.700 m/z m/z = R= m/z, amu La elevada resolución espectral proporcionada por los TOF s (superior a Trampas y Cuadrupolos) permitirá obtener masa exacta mediante la adición en continuo de algunos compuestos como referencia interna para m/z. m/z
31 Nº Posibles Fórmulas Empíricas La Importancia de disponer de Masa Exacta para centrar la búsqueda: Al aumentar la Exactitud de la masa analizada se reducen muy considerablemente el nº de posibles composiciones elementales que pueden dar la masa en cuestión P.M ,1 0,05 0,01 0,005 0,001 0,0005 0,0001 QUADs TOFs Exactitud Masa (u.m.a) En moléculas pequeñas el poder determinar el peso molecular con la tercera cifra decimal permite típicamente definir una fórmula empírica inequívoca.
32 RESUMEN: Ventajas del acoplamiento LCMS Operación robusta Identificación y confirmación Sensibilidad y Especificidad Facilidad de Uso Tecnología asequible
33 Si hubiera tenido un LCMS hubiera sabido lo que era esto antes de tomármelo
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