CINETICA ENZIMATICA LA CINÉTICA QUÍMICA ESTUDIA LA VELOCIDAD DE LAS REACCIONES BIOQUÍMICAS

Transcripción

1 CINETICA ENZIMATICA LA CINÉTICA QUÍMICA ESTUDIA LA VELOCIDAD DE LAS REACCIONES BIOQUÍMICAS

2 Realizar ensayos en el laboratorio en diferentes condiciones experimentales para estudiar la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas aporta información sobre aspectos como la afinidad de la enzima por el sustrato o la eficiencia con la que se transforma ese sustrato en el producto de la reacción. También pueden proporcionar información sobre ciertos detalles del mecanismo químico por el que transcurre la reacción catalizada. Estos datos ayudan a predecir su comportamiento en el ambiente celular o su respuesta ante cualquier variación de las condiciones habituales.

3 Cinética de las reacciones de un solo sustrato Los estudios de la velocidad de las reacciones enzimáticas de un solo sustrato se realizan mezclando una concentración conocida de enzima con una concentración concreta de sustrato, y midiendo la desaparición de sustrato o la aparición de producto a lo largo del tiempo. Se observa una desaparición progresiva de sustrato y una aparición de producto hata llegar al equilibrio. Para una reacción reversible, en el equilibrio no hay cambio neto en las concentraciones de sustrato y producto.

4 Es la medida de la formación de producto o la desapariciónde sustrato por unidad de tiempo. E S P

5 Representación gráfica de este tipo de ensayo, se obtiene la siguiente curva de progreso Curso de una reacción catalizada con una concentración de enzima constante. La concentración de producto va aumentando de forma lineal hasta que el sustrato va desapareciendo en el transcurso del tiempo y la reacción alcanza el equilibrio. La velocidad inicial Vo se determina como la pendiente de la recta en el inicio de la reacción. La velocidad a cualquier tiempo t se representa como Vt. En la primer etapa la reacción sigue una cinética de primer orden hasta que la desaparición de sustrato es suficientemente elevada, (a partir de 10%) para que esta relación deje de ser lineal. Por este motivo las medidas de velocidad se toman en esta primer etapa lineal, se denominan velocidades iniciales Vo y se determinan como la pendiente de la curva al principio de la reacción.

6 Velocidad de una reacción se muestra a través de la construcción de un gráfico perfil de velocidad expresando la concentración de producto y el tiempo transcurrido La velocidad inicial Vo de una reacción catalizada por una enzima va a depender de la concentración de sustrato [S] Si la cantidad de enzima permanece constante, a medida que aumenta la [S], Vo aumenta hasta que la enzima libre se agota, llegando a saturarse por el sustrato. La pendiente de las tangentes a la curva que representa el perfil de velocidad, proporciona la velocidad de la reacción en ese punto, Vt, la velocidad cambia constantemente.

7 Un repaso de los mecanismos químicos de las reacciones.

8 La velocidad en cada punto es la pendiente de la recta tangente La velocidad de la reacción S P Se expresa: -δ [S] = δ [P] = k [S] n δt δt v = k [S] n La ecuación de velocidad indica que la velocidad inicial de una reacción va a depender de la concentración inicial de reactivos [S] elevada a la potencia n, multiplicada por una constante k o constante de velocidad.

9 Esta información se puede llevar a otro tipo de gráfica que representa Vo frente a una concentración de sustrato. Para representar Vo se toma el valor de la pendiente de la gráfica siguiente: Curva de progreso para una serie de reacciones con diferentes concentraciones iniciales de sustrato. La Vo (pendientes de las rectas) aumenta a medida que lo hace [S]

10 Para La mayoria de las reacciones catalizadas por enzimas, los datos experimentales proporcionan graficas en las que se identifican 3 zonas claramente diferenciadas: Primera etapa lineal, a bajas [S], la reacción se comporta como de 1 orden Segunda etapa curvilínea, [S] intermedias, disminución de respuesta al aumento [S] Ultima etapa elevadas [S]. La velocidad no varía al aumentar [S]. Reacción orden 0 Cada punto es un valor de Vo de la Ez obtenido en un tubo de ensayo, con [Ez] cte y [S] crecientes. Se obtiene un valor aproximado de Vmax

11 La actividad enzimática se determina cuantitativamente observando el efecto catalítico que produce la enzima. Para lo cual es necesario conocer: 1- la ecuación global de la reacción catalítica 2- un procedimiento analítico sencillo para determinar la desaparición del sustrato o la aparición de los productos de reacción 3- si la enzima necesita de cofactores 4- el valor de Km para el sustrato 5- su ph óptimo 6- la zona de temperatura en la que muestra actividad elevada y es estable

12 Los datos cinéticos obtenidos en el laboratorio permiten conocer aspectos sobre el mecanismo de la reacción enzimática estudiada. A elevadas [S] la velocidad de la reacción no aumenta cuando lo hace la [S] debido a un efecto de saturación de la enzima por el sustrato. El comportamiento cinético de aquellas reacciones en las que hay formación rápida del complejo ES, seguidas de una etapa posterior más lenta en la que se produce y libera el producto de la reacción se explica mediante la ecuación de Michaelis- Menten

13 Ecuación de Michaelis Menten La hipérbola característica de la curva de saturación de la enzima por el sustrato. Se expresa matemáticamente por la ecuación: v = V max [S] K m + [S] k 1 k 2 E + S ES E + P K m concentración de sustrato a la cual la velocidad de reacción es ½ de su velocidad máxima k -1 K m = k -1 + k 2 k 1 [Ez] permanece constante y [S] es muy superior a la de la Ez.

14 Km es el valor de la concentración de sustrato necesario para alcanzar la mitad de la velocidad máxima En las reacciones enzimáticas en que participan más de un sustrato, cada uno de ellos posee su propia Km La Km representa una medida inversa de la afinidad de la enzima por el sustrato. Un valor bajo de Km se relaciona con una gran estabilidad del complejo ES o sea elevada afinidad de la Ez por el S. Cuanto mayor es el valor de Km menor será la afinidad de la enzima por el sustrato. Se expresa en unidades de concentración

15 El valor de Km varía de una enzima a otra y para la misma enzima difiere según los distintos sustratos.

16 La forma lineal de la ecuación de Michaelis-Menten se conoce como gráfica de los dobles recíprocos o de Lineweaver-Burk y se utiliza para el cálculo de los parámetros cinéticos Km y Vmáx. v 0 = V max [S] K m + [S] 1 = v 0 K m + [S] V max [S] 1 = v 0 K m V max [S] [S] + Vmax [S] 1 = v 0 K m V max 1 1 [S] + Vmax Ecuación de Lineweaver-Burk

17 Factores externos que alteran la actividad enzimática: Concentración de la enzima Las enzimas proteicas se aíslan de su fuente biológica (bacterias, hongos, tejidos animales y vegetales) mediante procesos habituales de aislamiento y purificación de proteínas, por lo que la pureza no es absoluta Unidad de actividad enzimática (U): es la cantidad de enzima capaz de transformar 1,0 umol de sustrato por minuto a 25 C en condiciones óptimas. Actividad específica: es el número de unidades enzimáticas por mg de proteína purificada. Constituye una medida de pureza.

18 Actividad y actividad específica Se han representado como bolas de distintos colores las moléculasd e cualquier proteína aislada, y como bolas rojas, las unidades que tienen actividad. En ambos casos el número de unidades de actividad es el mismo pero el tubo de la derecha tiene una mayor actividad específica debido a que las bolas rojas constituyen una mayor fracción del total del preparado.

19 Temperatura El aumento de temperatura conduce a un aumento en la velocidad de la reacción, que tiene un límite cuando se sobrepasa la temperatura de desnaturalización de la enzima Aumenta la energía cinética. Algunas son termoestables Debajo 45 ºC aumento de la velocidad con la temperatura Encima 45 ºC desnaturalización térmica de la enzima

20 ph Los cambios en el ph del medio pueden alterar el estado de ionización de las cadenas laterales de los Aa ácidos y básicos. Estos cambios afectan la afinidad de la enzima por el sustrato y la formación del complejo ES A ph extremos la proteína se desnaturaliza y la actividad biológica decae

21 INHIBIDORES Compuestos que pueden ralentizar o detener de forma específica la actividad enzimática. Resultan muy eficaces en la búsqueda y elaboración de fármacos. Su resultado puede ser reversible o irreversible Inhibidores irreversibles Se unen a la enzima a traves de un enlace covalente Inhibidores reversibles Se unen a la enzima a traves de interacciones no covalentes Alteran parámetros cinéticos Inhibidors reversibles Inhibidores competitivos Inhibidores no competitivos Inhibidores acompetitivos

22 Inhibición competitiva El inhibidor se une al mismo sitio que el sustrato, impidiendo la formación del complejo ES y del producto. El inhibidor y el sustrato compiten por el mismo centro activo de la Ez. Similitud estructural con el sustrato. En condiciones de [S] elevadas con respecto a la [ I ] es muy poco probable que el I se una a la enzima: la reacción muestra V máx = V máxi Al aumentar la concentración de sustrato se desplaza al inhibidor: K m K mi

23 La velocidad máxima permanece constante El valor de Km aumenta

24 El etanol, un inhibidor competitivo para evitar la ceguera por intoxicación por metanol. Las intoxicaciones con metanol pueden causar ceguera porque este alcohol es transformado en el hígado por la enzima alcohol deshidrogenasa en formaldehído, una sustancia que afecta gravemente al ojo. La administración de etanol por vía venosa revierte esta situación. El etanol actúa como inhibidor competitivo porque también es sustrato de la Ez alcohol deshidrogenasa. La diferencia es que el etanol da acetaldehído que no afecta los tejidos.

25 Inhibición no competitiva Ks E + S ES + + I I E + P Ki Ki EI + S Ks ESI El inhibidor muestra afinidad tanto por la enzima libre como por el complejo ES. El inhibidor se une en un lugar distinto del centro activo de la Ez. En ninguno de los casos se obtiene producto. Su efecto no puede evitarse aumentando la [S]. La Vmáx disminuye en presencia de inhibidor.

26 Los inhibidores no competitivos disminuyen la Vmax de la reacción Km permanece constante

27 Ej. El ácido iodoacético inhibe la transformación de glucosa en ácido láctico a nivel muscular porque compite con la enzima gliceraldehído fosfato deshidrogenasa

28 Inhibición acompetitiva El inhibidor se une exclusivamente al complejo ES en un lugar diferente al centro activo. Disminución de Vmáx i y de Km i

29 El inhibidor se une a ES, aumenta la afinidad de la Ez por el S, Kmi disminuye. El sustrato No compite con el inhibidor, no podrá desplazarlo de su sitio de unión, ni siquiera aumentando la concentración de sustrato. Vmáx i también disminuye.

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31 Inhibidores irreversibles Son moléculas que se suelen unir a la enzima mediante enlaces covalentes con los residuos imprescindibles para la catálisis, impidiendo su función. Este tipo de inhibidores no tienen un comportamiento cinético de Michaelis Menten Su utilidad principal es la creación de fármacos: compuestos utilizados en la quimioterapia anticancerosa. Ejemplos de algunos medicamentos y su mecanismo de acción.

32 REGULACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Regulación de la concentración de la enzima por inhibición del producto final: Retroinhibición o feedback. Retroalimentación negativa en una ruta metabólica. El producto final Z de una ruta metabólica es el modulador negativo de la enzima de la primer etapa.

33 Regulación alostérica Una enzima alostérica heterotrópica muestra un sitio de unión para el modulador diferente del centro activo. Heterotrópica: el ligando es una sustancia diferente al sustrato. Modulación positivas o negativas. La unión del modulador produce un cambio de conformación que hace que la enzima tenga mayor afinidad por el sustrato (modulador positivo) El cambio de conformación de la primera subunidad se transmite a la segunda, que también presentará mayor afinidad por el sustrato.

34 Regulación genética Se impide el pasaje de ADN ARN (transcripción) se impide la síntesis de la enzima