COMPARACIÓN DEL EFECTO DE LOS EXTRACTOS ACUOSO Y ETANÓLICO DE PHYLLANTHUS NIRURI ANTE PHYTOPHTHORA INFESTANS

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1 COMPARACIÓN DEL EFECTO DE LOS EXTRACTOS ACUOSO Y ETANÓLICO DE PHYLLANTHUS NIRURI ANTE PHYTOPHTHORA INFESTANS D. Rodríguez, M. E. Sanabria, J. L. Rodríguez. Universidad Centroccidental Lisandro Alvarado, Postgrado de Fitopatología. Apartado de Correos 400, Barquisimeto, Venezuela. rdorian@ucla.edu.ve; rdorian7@yahoo.com RESUMEN Phytophthora infestans (Mont.) De Bary es el causante de la candelilla tardía en la papa, para cuyo control en Venezuela se utilizan grandes cantidades de fungicidas. En la búsqueda de alternativas ecológicas efectivas para el manejo, se evaluó el efecto in vitro del extracto acuoso y etanólico de Phyllanthus niruri Linn. Las hojas se secaron y molieron. Para la obtención del primero se colocaron 50 g/l de agua en la licuadora por 5 min. y se filtró. Para el segundo se maceró en etanol 96% por 7 días y el crudo se obtuvo por destilación en un rotaevaporador. Ambos se diluyeron en medio papadextrosa-agar en las concentraciones 0;10;25y 50% (v/v), se vertió en platos Petri, utilizando 4 repeticiones (platos) por tratamiento. En el centro de cada uno se colocó un disco de agar con micelio de 10 días de edad. Los platos se incubaron a 18ºC en oscuridad hasta que en el 0% la colonia alcanzara la orilla. Se midió el diámetro y se calculó el porcentaje de inhibición del crecimiento causado por cada tratamiento en comparación con el testigo. Se determinaron los metabolitos secundarios. Se logró el 100% de inhibición con el 10% del etanólico, mientras que con el acuoso se logró el 87% con 50%. En cuanto a los MS, en el acuoso estuvieron ausentes los alcaloides débilmente básicos y básicos, pero presentes en el ataólico lo cual podría explicar el mayor efecto inhibidor de éste sobre el patógeno. Palabras clave: Candelilla tardía, papa, metabolitos secundarios. INTRODUCCIÓN En Venezuela se siembran unas ha de papa al año, más del 50% de éstas se ubican en la región de Los Andes, donde las condiciones climáticas imperantes se caracterizan por alta humedad relativa y temperaturas medias anuales entre 10 y 20 ºC, lo que favorece el desarrollo de la Candelilla tardía. Para el control de la enfermedad, el productor venezolano hace uso de gran cantidad de fungicidas y con frecuencia se presentan casos de intoxicación humana y contaminación del aire y de las aguas superficiales, acarreando problemas de salud (UNEP, 2004). El Código Internacional de Conducta para la Distribución y Utilización de Plaguicidas (FAO, 2003) exhorta a los gobiernos a promover la investigación y el desarrollo de alternativas que entrañen riesgo reducido para los seres humanos y el ambiente, en ese sentido se inició la búsqueda de plantas cuyos extractos tengan un efecto controlador del patógeno P. infestans, causante de la candelilla tardía de la papa y el tomate. Estudios previos habían indicado la potencialidad del extracto etanólico de hojas de Phyllanthus niruri Linn. (Euphorbiaceae) en el control de Fusarium moniliforme, Alternaria solani, Sclerotium rolfsii y Fusarium oxysporum f.sp. cubense (Sanabria, Rodríguez y Rodríguez, 2003; Araujo, 2005). Esta planta silvestre es de amplia distribución en Venezuela y se ha utilizado con fines medicinales, por ello se escogió para realizar el presente trabajo.

2 Los extractos de las plantas pueden obtenerse de diversas maneras, dos de ellas son acuosa y a través del uso de un alcohol, comúnmente metanol o etanol (Marcano y Hasegawa, 2002). El primer método permite la extracción de metabolitos solubles en agua y puede ser fácilmente utilizado por los agricultores con un mínimo de requerimiento tecnológico. El segundo utiliza el alcohol como solvente de los metabolitos y requiere un equipo de separación de éste antes de utilizar el extracto. Sin embargo, la efectividad del extracto dependerá del metabolito obtenido y este a su vez del método utilizado. Como se desconoce cual de los procedimiento de extracción es el más efectivo en P. niruri contra P. infestans, se decidió evaluar ambos métodos. Como parte del programa de evaluación de los extractos, se planificó iniciar los estudios con el hongo bajo condiciones in vitro y una segunda fase del programa a través de la evaluación in vivo en fincas de agricultores. MATERIALES Y MÉTODOS Se colectaron plantas enteras de Phyllanthus niruri de municipio Veroes, estado Yaracuy, 220 msnm, se secaron a la sombra y se molieron en una licuadora Oster MR. Siguiendo la metodología de Marcano y Hasegawa (2002), para el extracto acuoso se colocaron 50 g/l de agua y licuó por 5 min, luego se filtró y se recogió el líquido. Para la preparación el extracto etanólico, el material molido se colocó en maceración con alcohol etílico al 96% por 2 a 7 días, luego se separó el alcohol en un Rotaevaporador Brinkmann y se obtuvo el extracto puro. Ambos extractos fueron diluidos en medio papa-dextrosaagar en las concentraciones 0; 10; 25 y 50% (v/v), inmediatamente después de la esterilización del medio en el autoclave y se vertió en platos Petri, utilizando 4 repeticiones (platos) por tratamiento. En el centro de cada plato se colocó un disco de agar con micelio del organismo de 10 días de edad. Los platos fueron incubados a 18 ºC en oscuridad hasta que en el de 0% la colonia alcanzara la orilla del plato, en ese momento se midió el diámetro de la colonia y se calculó el porcentaje de inhibición del crecimiento causado por cada tratamiento en comparación con el testigo (0%). Se realizó el análisis de varianza utilizando un diseño completamente aleatorizado y el ensayo fue repetido. Se determinó cualitativamente la presencia o no de los metabolitos secundarios (MS) en ambos extractos, utilizando la metodología recomendada por Marcano y Hasegawa (2002). Para la determinación de los alcaloides, el extracto se evaporó hasta la sequedad, procediendo a separar las tres fases del metabolito, utilizando un embudo de separación. Para la primera fase se agregó HCL (10%), cloroformo, se agitó y se separó la primera fase (inferior). La segunda fase (superior) se alcalinizó con NH 4 OH, se añadió cloroformo separando la tercera fase. Una gota de cada una de las tres fases sfueron colocadas en cromatofolio silica/gel y rociadas con los reactivos de Meyer y Dragendorff; una coloración marrón rojiza en la primera fase indicaba la presencia de alcaloides débilmente básicos; en la segunda fase, de alcaloides básicos; y en la tercera, de sales cuaternarias de amonio. La presencia de aceites esenciales se determinó por el olor característico que le confieren estos metabolitos al material vegetal fresco o al extracto. Para la determinar la presencia de polifenoles, el extracto evaporado y seco se retomó en agua, se filtró y se le agregó una solución de cloruro férrico al 1%; una coloración parda indicaba la presencia de compuestos fenólicos. La presencia de taninos fue detectada al formarse un precipitado con una solución de gelatina al 1%. La presencia de saponinas fue detectada cuando el extracto puro después de adicionarle agua, se agitaba y la espuma se mantenía por 20 min.

3 Para encontrar antraquinonas, el extracto puro, llevado hasta sequedad, fue extraído con KOH (0,5N), filtrado, se agregó ácido acético, benceno, agitó y alcalinizó con NH 4 OH; una coloración rojiza indicaba la presencia de estos compuestos. Para examinar la presencia de flavonoides, se dejó absorber una gota del extracto crudo sobre papel de filtro y se roció con una solución de AlCl (1%) en etanol. La aparición de una mancha fluorescente amarilla bajo la luz ultravioleta indicaba l presencia de estos metabolitos. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Se encontraron diferencias en la respuesta de P. infestans a los dos tipos de extracto, al observar una mayor efectividad del etanólico que el acuoso (Cuadro 1). En este último, se detectaron diferencias significativas entre las concentraciones; la efectividad aumentó a medida que se incrementaba la concentración, lográndose la inhibición total con la aplicación del 75% de extracto al medio. Es decir, el extracto acuoso, el cual puede ser fácilmente preparado por los agricultores, es también efectivo pero se necesitaría mayor cantidad para lograr resultados satisfactorios. Sin embargo, se puede observar que una concentración del 10% es capaz de reducir el 50% del crecimiento del hongo; asumiendo un efecto similar en campo, representaría la posibilidad de ocasionar una reducción del 50% en la enfermedad. Phyllanthus niruri ha sido igualmente efectiva contra otros hongos como Alternaria solani, Fusarium moniliforme y Sclerotium rolfsii (Sanabria, Rodríguez y Rodríguez, 2003), donde se obtuvieron reducciones de los hongos entre el 46 y el 63% con el 10% de extracto etanólico; y el 100% de reducción con el 25% del mismo. En otro trabajo, Rodríguez y Sanabria (2005) observaron el efecto controlador de P. niruri sobre los hongos Rhizoctonia solani y Bipolaris maydis y la disminución del 36% y 80%, respectivamente, de las enfermedades causadas por ellos en maíz. Estos resultados demuestran el potencial de esta planta para ser usada en el manejo de enfermedades en plantas. La identificación cualitativa de los MS indicó que el extracto acuoso carece de alcaloides básicos y débilmente básicos (Cuadro 2), induciendo a pensar que es la presencia de estos en el extracto etanólico lo que le podría estar dando la efectividad. Los alcaloides son compuestos orgánicos nitrogenados, derivados, comúnmente de los aminoácidos. Se encuentran localizados en los tejidos periféricos de los diferentes órganos de las plantas (Albornoz, 1980), lo que sugiere que cumplen una función protectora contra el ataque de insectos y patógenos. En efecto, en un trabajo realizado por Lee et al. (2001) se encontró que pipernonaline, un alcaloide piperidino aislado de frutos de pimientos largos, bajo condiciones in vivo, tenía una actividad antifúngica fuerte contra varios hongos fitopatógenos, entre ellos, P. infestans en tomate, en el cual lograron un control del 40%. Por otra parte, es curioso observar que los polifenoles y taninos no fueron detectados en el extracto etanólico de P. niruri, pero si en el acuoso (Cuadro 2), lo que podría deberse al tipo de glicósido que acompaña al fenol, cuya naturaleza afecta su hidrólisis (Marcano y Hasegawa, 2002). Normalmente son los fenoles los que están asociados con el efecto fungicida contra fitopatógenos (Albornoz, 1980; Swain, 1977); sin embargo, en este caso ese papel parece cumplirlo los alcaloides. CONCLUSIÓN El extracto etanólico de P. niruri fue mas efectivo contra el desarrollo micelial de P. infestans que el extracto acuoso. Este efecto parece estar asociado a los alcaloides básicos y débilmente básicos presentes en la planta. Actualmente se continúan los

4 estudios de fraccionamiento de dichos metabolitos para realizar pruebas específicas y comprobar tal aseveración. Así mismo, se realizan pruebas de campo para evaluar la efectividad de los extractos in vivo. BIBLIOGRAFÍA Araujo, D Efecto de Fungicidas y Extractos Vegetales sobre Fusarium oxysporum f.sp. cubense y el Mal de Panamá en Cambur Manzano. Tesis de Magíster Scientiarum, Universidad Centroccidental Lisandro Alvarado, Barquisimeto, Venezuela. 59 p. Albornoz, A Productos Naturales. Sustancias y Drogas Extraídas de las Plantas. Publicaciones de la Universidad Central de Venezuela. 616 p. Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO) Código Internacional de Conducta para la Distribución y Utilización de Plaguicidas. FAO, Roma, 36 p. Lee, S., B. Park, M. Kim, W. Choi, H. Kim, K. Cho, S. Lee, H. Lee. Fungicidal activity of pipernonaline, a piperidine alkaloid derived from long pepper, Piper longum L., against phytopathogenic fungi Crop Protection 20, Marcano, D., M. Hasegawa Fitoquímica orgánica. Universidad Central de Venezuela. 588 p. Rodríguez, D., M. Sanabria Efecto del extracto de tres plantas silvestres sobre la rizoctoniosis, la mancha sureña del maíz y los patógenos que las causan. INTERCIENCIA 30, Sanabria, M., D. Rodriguez, J. Rodríguez Contyrol in vitro de Fusarium moniliforme, Sclerotium rolfsii y Alternaria solani con extracto etanólico de Phyllanthus niruri. Resumen. Fitopatol. Venez. 16, Swain, T Secondary compounds as protective agents. Ann Rev. Plant Physiol. 28, United Nations Environment Program (UNEP) Childhood Pesticide Poisoning. Information for Advocacy and Action. UNEP Chemicals, International Environment House, Swittzerland. 36 p.

5 Cuadro 1.- Inhibición de crecimiento micelial de Phytophthora infestans (Mont.) De Bary con los extractos acuoso y etanólico de Phyllanthus niruri Linn. Concentraciones Inhibición del crecimiento micelial (%) (%) Extracto Acuoso Extracto Etanólico 10 49,9 d ,2 c ,4 b a 100 Nota: Valores medios de inhibición acompañados de letras distintas indican diferencias significativas entre tratamientos. Tukey (P = 0,05). Cuadro 2.- Metabolitos secundarios determinados en los extractos acuoso y etanólico de Phyllanthus niruri Linn. Presentes (+), ausentes (-). Extractos Alcaloides Antraquinona Saponina Flavonoides Polifenoles y Taninos Aceites Esenciales Acuoso Etanólico