PROJECT ALFA III: RED BIOFARMA
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- Yolanda María Rosario Villanueva Cuenca
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1 SOP perfusion intestinal de paso simple Página 1 de 7 PROJECT ALFA III: RED BIOFARMA PROCEDIMIENTOS OPERATIVOS PARA PERMEABILIDAD INTESTINAL POR PERFUSION INTESTINAL DE PASO SIMPLE
2 SOP perfusion intestinal de paso simple Página 2 de 7 TABLA DE CONTENIDOS I. INTRODUCCION... 3 II. PROPOSITO... 3 III. LIMITACIONES... 3 IV. ESQUEMA DEL METODO... 4 V. DEFINICION DE LAS ABREVIACIONES... 5 VII. MATERIAlES... 5 VIII. MÉTODOS... 6 A. PREPARACION DE LA SOLUCIÓN DE PERFUSIÓN... 6 B. ANALISIS DE LOS DATOS... 6
3 SOP perfusion intestinal de paso simple Página 3 de 7 I. INTRODUCCION Luego de la administración, los fármacos deben estar disponibles y alcanzar la circulación sistémica para poder ejercer su efecto terapéutico. Para los principios activos de medicamos que están formulados para administración oral, en formas farmacéuticas tales como comprimidos o cápsulas, hay dos procesos distintivos durante su absorción: la disolución de las partículas sólidas de fármaco en el fluido gastrointestinal y la permeación de las moléculas del fármaco a través de la membrana intestinal. Dependiendo de la magnitud relativa de las velocidades de estos dos procesos, uno de ellos puede ser limitante de la velocidad global de absorción del principio activo. Sobre la base de estos parámetros, los fármacos se pueden clasificar en cuatro categorías, de acuerdo al Sistema de Clasificación Biofarmacéutico (BSC) propuesto por Amidon y colaboradores. Para clasificar un fármaco, de acuerdo al BSC, se deben tener en cua la solubilidad, la dosis y la permeabilidad del mismo. La disponibilidad de datos confiables sobre estos tres parámetros es muy importante para evitar clasificaciones erróneas y el desperdicio de recursos para realizar estudios en seres humanos innecesarios para establecer bioequivalencia II. PROPOSITO Se ha obtenido buenas correlaciones re la fracción de dosis absorbida de los fármacos con los valores de permeabilidad efectiva (Peff) obtenidos por el método de perfusión intestinal de paso simple (PIPS), lo cual posibilita usar este modelo para hacer predicciones de permeabilidad intestinal en humanos. Este método está oriado al estudio del transporte de drogas que atraviesan la pared intestinal en forma pasiva como a través de un sistema transportador. III. LIMITACIONES Para determinar el valor de Peff de un compuesto es necesario corregir el valor de la concración del mismo en el líquido perfundido obtenido a la salida del segmo intestinal aislado de la rata por el flujo de agua, por lo cual es necesario agregar un marcador no 3
4 SOP perfusion intestinal de paso simple Página 4 de 7 absorbible en la solución de perfusión. Para establecer la reproducibilidad del método también es necesario añadir en la solución de perfusión dos marcadores de permeabilidad, uno de alta y otro de baja permeabilidad. IV. ESQUEMA DEL METODO Antes del experimo, las ratas serán privadas de alimo durante las 18 h previas al mismo y con libre acceso al agua. Las ratas serán anestesiadas [ketamina (55 mg/kg)/xilazina (11 mg/kg)] y se sitúan en decúbito supino sobre la zona de cirugía. El animal puede mantenerse calie con ayuda de una lámpara. Se realizará una incisión de 3-4 cm en el abdomen de las mismas cortando y desbridando ligerame primero la piel y después cortando la capa muscular a lo largo de la línea alba procurando que la hemorragia causada sea la mínima. Serán aislados distintos segmos del intestino de aproximadame 10 cm cada uno, los cuales serán canalizados en sus dos extremos con tubos flexibles de PVC. Las cánulas de PVC se introducen por ambos extremos del segmo intestinal tras realizar un pequeño corte en bisel y se fijan con un hilo de sutura que previame se ha introducido debajo del segmo con cuidado de no romper ningún capilar sanguíneo. Estos segmos serán lavados con una solución salina de fosfato a 37 ºC. La solución de perfusión estará compuesta por Na 2 HPO 4. 12H 2 O 20,1 mm, KH 2 PO 4 47,0 mm, NaCl 101,0 mm ph 6,4 y el marcador no absorbible, rojo de fenol, para medir el flujo neto de agua (35 mm) y dos compuestos estándares de referencia, de alta y baja permeabilidad. Una vez limpio el segmo intestinal y perfectame canulado se reintroduce con cuidado en la cavidad abdominal que se cubre con una torunda de algodón empapada en suero salino atemperado a 37 ºC para evitar la desecación y el enfriamio de la cavidad peritoneal. La solución de ensayo atemperada a 37 ºC será perfundida con una bomba de perfusión a una velocidad de flujo de 0,2 ml/min. Se debe esperar un periodo de 15 min para alcanzar el estado estacionario en el segmo intestinal y a partir de ese momo puede iniciarse la toma de muestras. Las soluciones en la salida de los segmos intestinales serán recolectadas cada 5 min. Al final de los experimos, el animal será sacrificado por una inyección intravenosa letal del anestésico y se medirá la longitud de cada segmo intestinal perfundido. La concración de los analitos en las muestras obtenidas luego de los experimos de perfusión intestinal será determinada por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). 4
5 SOP perfusion intestinal de paso simple Página 5 de 7 V. DEFINICION DE LAS ABREVIACIONES C grados Celsius min minutos mmol millimoles RT Temperatura ambie mm milimolar P eff permeabilidad efectiva VII. MATERIALES Ratas Se utilizarán por cada experimo 6 ratas Wistar de g Equipamio técnico Bomba de perfusión Lámpara de calor Microcrífuga phmétro Mezclador Vortex Pipetas automáticas Balanza analítica Balanza granataria HPLC Nevera-Congelador Reactivos y otros materiales fungibles Rojo de Fenol Na 2 HPO 4. 12H 2 O 5
6 SOP perfusion intestinal de paso simple Página 6 de 7 KH 2 PO 4 NaCl VIII. MÉTODOS A. PREPARACION DE LA SOLUCIÓN DE PERFUSIÓN La solución de perfusión estará compuesta por una disolución acuosa de Na 2 HPO 4. 12H 2 O 20,1 mm, KH 2 PO 4 47,0 mm, NaCl 101,0 mm ph 6,4) y el marcador no absorbible, rojo de fenol (35 mm), para medir el flujo neto de agua, más los marcadores de alta y baja permeabilidad. B. ANALISIS DE LOS DATOS El coeficie de permeabilidad efectivo (P eff ) será calculado luego de corregir la concración de los compuestos en estudio, a la salida del segmo intestinal, por el flujo de agua neto (FAN) de acuerdo en la siguie ecuación: RojoFenol sal RojoFenol Q FAN 1 / L Donde, FAN es el flujo de agua neto, RojoFenol sal y RojoFenol son las concraciones del rojo de fenol en la solución de perfusión en la salidad y en la rada del segmo intestinal, respectivame, Q es la velocidad de flujo (0,2 ml/min) y L la longjtud del segmo intestinal medido al finalizar el experimo. La concraciones de los analitos en las muestras recolectadas a la salida del segmo intestinal son corregidas de acuerdo a la siguie ecuación: C C sal( corr) sal FAN Q Donde C sal(corr) es la concración correjida por el flujo de agua, C sal es la cocración del analito a la salida del segmo intestinal y Q es la velocidad de perfusión. La P eff será calculada de acuerdo a la siguie ecuación: 6
7 SOP perfusion intestinal de paso simple Página 7 de 7 P eff Q ln Csal ( corr ) / C 2rL Donde, C y C sal(corr) son las concraciones del compuesto en estudio en la solución de perfusión en la rada y en la salida del segmo intestinal corregida por el FNA, respectivame. 2rL es el área del segmo intestinal. Se validarán los procedimios analíticos que permitan cuantificar estos compuestos en las soluciones obtenidas a la salida de los segmos intestinales aislados. 7
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