METABOLISMO Y NUTRICIÓN

Transcripción

1 METABOLISMO Y NUTRICIÓN MANUAL DE PRÁCTICAS Alejandra Gámez Cristina Grande 1

2 PRÁCTICA I: DETECCIÓN DE METABOLOPATÍAS POR CAPA FINA INTRODUCCIÓN Las enfermedades metabólicas hereditarias son trastornos bioquímicos de origen genético debidos a un defecto específico en la estructura o función s moléculas de proteínas. El origen es siempre una modificación en el gen que codifica la síntesis de una determinada proteína. La proteína deficiente puede afectar el funcionamiento de una vía metabólica cualquiera, produciéndose un aumento de los metabolitos anteriores a dicho bloqueo, que dependiendo de su toxicidad afectarán en mayor o menor grado a la severidad enfermedad. Estos metabolitos acumulados en fluidos biológicos (sangre y orina principalmente), sirven en la mayoría de los casos para el diagnóstico enfermedad. La cromatografía en capa fina es uno de los métodos más utilizados para el diagnóstico s enfermedades metabólicas dada su versatilidad en la identificación de metabolitos tales como aminoácidos, azúcares, nucleótidos, ácidos grasos etc. La cromatografía en capa fina es un caso particular de cromatografía de reparto, don fase estacionaria (agua) se adsorbe en el soporte sólido que constituye la capa fina y que podrá ser cualquier material que pueda reducirse a polvo y formar una capa uniforme (por ejemplo celulosa). La fase móvil (disolvente orgánico saturado en agua) fluye a través fase estacionaria. Los componentes mezcla se separarán si los coeficientes de reparto (K) entre los disolventes son lo suficientemente distintos, denominándose a la movilidad de un compuesto respecto a la del disolvente Rf. Estos valores dependen naturaleza del compuesto, del soporte del disolvente y temperatura. Una s aplicaciones más extendida, es su utilización como método de selección masiva de fenilcetonuria, así como de cualquier aminoacidopatía. La detección de aminoácidos se puede realizar tanto en orina como en sangre o suero impregnado en papel. Entre los errores hereditarios del metabolismo que se pueden diagnosticar se encuentran: la Hiperglicinemia, Metioninemia, Sindrome de Fanconi, Tirosinemia y Jarabe de Arce entre otros. También es posible la detección de algunas acidurias orgánicas que impliquen la elevación de forma secundaria de algún aminoácido. Este es el caso Acidemia Propiónica en la cual los pacientes presentan niveles elevados de Gly en orina. Otra aplicación técnica es el control bioquímico del tratamiento de los fenilcetonúricos mediante medida fenilalanina en sangre impregnada en papel. En este caso se utilizan patrones con diferentes concentraciones de fenilalanina. En esta práctica se procederá a detectar las siguientes enfermedades metabólicas: - Fenilcetonuria - Tirosinemia - Jarabe de arce - Acidemia propiónica 2

3 1. Fenilcetonuria. La fenilcetonuria (PKU) es una enfermedad genética humana causada por un defecto en la proteína fenilalanina hidroxilasa; que cataliza la hidroxilación de fenilalanina a tirosina. Los individuos presentan niveles elevados de fenilalanina en sangre, superiores a 2 mg/dl, y si la enfermedad no es tratada produce un severo retraso mental. Con el fin de detectar la PKU en los primeros días de vida, antes de que se produzca el daño neurológico, se realiza la detección de esta enfermedad en todos los recién nacidos, midiendo la fenilalanina en sangre impregnada en papel mediante cromatografía en capa fina. Una vez diagnosticados se ponen en tratamiento dietético (dieta baja en fenilalanina) para mantener unos niveles de fenilalanina entre 2 y 8 mg/dl. La valoración implantación correcta dieta se realiza mediante cuantificación periódica de este aminoácido. 3

4 2. Tirosinemia. Los errores congénitos del metabolismo causantes de una elevación de tirosina en sangre están producidos por defectos en, al menos, dos proteínas implicadas en el catabolismo de tirosina. Estos defectos provocan las enfermedades llamadas Tirosinemia tipo I y Tirosinemia tipo II debidas a mutaciones en los genes que codifican para las proteínas Fumarilacetoacetico hidrolasa y Tirosina aminotransferasa respectivamente. El diagnóstico de ambos defectos se realiza mediante cuantificación en cromatografía de de los metabolitos específicos. 4

5 3. Maple Syrup Urine Disease, MSUD (Jarabe de Arce). El Jarabe de Arce es debido a un defecto en la degradación de los aminoácidos ramificados (leucina, valina e isoleucina) catalizada por el complejo multienzimático mitocondrial Deshidrogenasa de -cetoácidos de cadena ramificada. Bioquímicamente estos pacientes se detectan por aumento de los niveles en sangre y orina de los correspondientes -cetoácidos y también de los tres aminoácidos citados debido a la reversibilidad transaminación. Su nombre proviene del olor característico orina de estos pacientes que es similar al miel producida con la savia de unos árboles característicos de Canadá llamada Maple syrup. Los pacientes de MSUD requieren una dieta especial libre de aminoácidos ramificados. Si la enfermedad no se trata, el daño neurológico puede ser mortal y aun en tratamiento, pueden ocurrir episodios de acidosis durante los cuales puede sobrevenir la muerte. 1. Deshidrogenasa de -cetoácidos de cadena ramificada 10. PropionilCoA carboxilasa 5

6 4. Acidemia propiónica. La acidemia propiónica es debida a un defecto en la proteína mitocondrial PropionilCoA carboxilasa cuya coenzima es la biotina, provocando la acumulación de ácido propiónico. El ácido propiónico en exceso inhibe el transporte mitocondrial de glicina, lo que origina la acumulación de este aminoácido en fluidos biológicos. El tratamiento incluye una dieta restringida en proteínas y suplemento de glicina, carnitina o biotina aunque el pronóstico no es bueno. Isoleucina, valina, metionina y treonina Acidos grasos de cadena impar Cadena lateral de colesterol COOH CH 3 -CH 2 -C-SCoA O Propionil-CoA COOH HCO 3 ATP Mg 2+ Biotina ADP Propionil-CoA Carboxilasa CH-CH 3 C-SCoA O D-Metilmalonil-Co CH 2 -CH 2 C-SCoA O Succinil-CoA Ciclo de Krebs COOH Adenosilcobalamina CH 3 -CH C-SCoA Metilmalonil-CoA Mutasa O L-Metilmalonil-Co 6

7 OBJETIVOS Detección de aminoacidopatías y acidurias orgánicas. Se estudiaran pacientes con: Fenilcetonuria, Tirosinemia, Jarabe de Arce y Acidemia Propiónica. Se diagnosticará la enfermedad mediante identificación semicuantitativa de los diferentes aminoácidos utilizando como patrones los aminoácidos fenilalanina, tirosina, leucina, isoleucina, valina y glicina. MATERIALES Y REACTIVOS - Muestras - Aminoácidos patrón (Fenilalanina, Tirosina, Leucina, Isoleucina, Glicina y Valina) - Cubetas cromatográficas. - Estufa de 120ºC - Cromatografía: n-butanol: acetona: acido acético: agua (35:35:10:20) - Muestras problema (sangre y orina) - Solución de tinción: 200 mg ninhidrina en 100 ml etanol 70%. MÉTODO EMPLEAR GUANTES DURANTE TODA LA PRÁCTICA Aplicación s muestras Sobre una cromatoplaca de celulosa aplicar 2 l s disoluciones patrón de aminoácidos, así como s muestras problema. Todas las muestras deben ser aplicadas a 2 cm del borde inferior cromatoplaca y distantes entre sí aproximadamente 2 cm. Cada mesa (cuatro parejas) aplicará todos los patrones y todas las muestras problema. Desarrollo cromatográfico: - Se introduce la placa en el eluyente que constituye la fase móvil (n-butanol, acetona, acido acético, agua, 35:35:10:20) y se deja correr de forma ascendente hasta que el frente llegue al borde superior placa (dos veces consecutivas es recomendable para una mejor separación cromatográfica dejando secar la placa entre ambos desarrollos). - Para obtener Rf reproducibles es imprescindible tener la atmósfera del tanque saturada con la fase móvil, ya que en caso contrario puede evaporarse disolvente capa fina, aumentando los Rf. Revelado: - Terminado el desarrollo se seca la placa con aire frío hasta la eliminación total de los disolventes. - Se tiñe por inmersión placa en la solución de ninhidrina durante 1 minuto aproximadamente y se seca en una estufa a 120 C hasta la aparición s zonas teñidas (aproximadamente 5 min). RESULTADOS Una vez visualizadas las manchas cada mesa procederá a la identificación del defecto metabólico de cada muestra problema de forma cualitativa. 7

8 PRACTICA II: ANÁLISIS DE LA ADAPTACIÓN DEL METABOLISMO GLUCÍDICO HEPÁTICO EN RESPUESTA AL AYUNO/REALIMENTACIÓN Y DIABETES INTRODUCCIÓN Las principales rutas del metabolismo glucídico empiezan o terminan en la glucosa (fig. 1). Fig.1. Rutas del metabolismo glucídico. La glucosa es un compuesto orgánico muy abundante en la naturaleza que es utilizado por el organismo como fuente de energía. Además de energía, el metabolismo glucosa proporciona productos intermedios para otras vías metabólicas. Por tanto, un aporte de glucosa constante es esencial para el mantenimiento s funciones específicas de los distintos órganos y vendrá determinado por el volumen y la composición ingesta así como por la capacidad de almacenamiento y regulación de algunos tejidos. En este sentido el hígado tiene un papel regulador esencial ya que es el órgano que recibe y procesa las sustancias nutritivas procedentes ingesta y que, junto con el tejido adiposo, es capaz de almacenar sustancias de reserva en forma de triglicéridos y glucógeno. La coordinación s funciones de estos órganos se lleva a cabo mediante finos sistemas de regulación hormonal. Todos estos mecanismos, en su conjunto, permiten una adecuación del organismo a las distintas condiciones metabólicas. La glucosa puede seguir en el hígado tres caminos principales: 1.- Síntesis de glucógeno cuya función será proveer una reserva de carbohidratos para mantener los niveles plasmáticos de glucosa cuando sea necesario. 2.- Glucolisis, que tiene una doble función: provisión de piruvato para su oxidación en la mitocondria y obtención de energía y formación de precursores para procesos biosintéticos (lipogénesis). 3.- Ciclo s pentosas fosfato para la generación de poder reductor en forma de NADPH, necesario para la síntesis de ácidos grasos y esteroides, así como pentosas fosfato para la síntesis de ácidos nucleicos. Por tanto, tras la ingesta: - se elevan los niveles de glucosa en sangre - se sintetiza glucógeno - se favorece la síntesis de ácidos grasos, acumulándose en forma de triglicéridos en el tejido adiposo Todos estos procesos están dirigidos por una razón Insulina/Glucagón elevada que actúa directamente favoreciendo la glucogenosíntesis y la lipogénesis. En situaciones de ayuno más o menos prolongado: - se movilizan las reservas de glucosa acumuladas en forma de glucógeno tanto en hígado como en músculo. 8

9 - se degradan los triglicéridos almacenados en el tejido adiposo que darán lugar a ácidos grasos que a su vez actuarán como sustratos energéticos alternativos - se sintetiza glucosa por glucogénesis a partir de metabolitos intermediarios. La escasez de glucosa característica de este estado provoca una inversión razón Insulina/Glucagón que dispara la cascada de reajustes metabólicos. Todos estos procesos están regulados hormonalmente por las siguientes hormonas: insulina y glucagón. La insulina actúa favoreciendo la glucogenogénesis y la lipogénesis. Por su parte, el glucagón estimula el efecto contrario es decir, la producción de glucosa a partir de glucógeno. Al producirse la realimentación en un organismo ayunado vuelve a elevarse la razón insulina/glucagón con lo que se reestablecen los parámetros metabólicos originales. Finalmente, hay situaciones en las que la razón insulina/glucagón está alterada en situaciones patológicas como es el caso Diabetes Mellitus cuyo origen es la deficiencia de Insulina. En una situación de diabetes, los bajos niveles de insulina originan una disminución en la síntesis de enzimas claves para la glucólisis y por tanto disminuye la glucólisis. Entonces, en situaciones de diabetes: - aumentan los niveles plasmáticos de glucosa. - se moviliza el glucógeno para la provisión de glucosa al interior célula. - se activa la gluconeogénesis con el mismo fin. - se movilizan las reservas lipídicas para dar lugar a ácidos grasos que actúen como sustratos energéticos ante la imposibilidad de utilización glucosa. - se producirá proteolisis cuando se agoten las reservas lipídicas. OBJETIVOS Analizar el efecto dieta y carencia de insulina sobre varios parámetros metabólicos en rata. En concreto se van a utilizar 4 grupos de ratas (control, sometidas a ayuno, sometidas a ayuno y posteriormente realimentadas y diabéticas). Los parámetros metabólicos que vamos a utilizar son: 1) actividad glucosa-6 P deshidrogenasa en hígado (G6PDH) 2) actividad fosfoenol piruvato carboxiquinasa en hígado (PEPCK) 3) glucógeno hepático 4) glucosa sanguínea 9

10 MATERIAL Se utilizan ratas macho ( g) que tienen en todo momento libre acceso a la bebida. Estos animales de dividen en 4 grupos: 1) CONTROLES (C): disfrutan de libre acceso a una dieta comercial estándar rica en hidrato de carbono. 2) AYUNADAS (A): 48 horas antes del sacrificio se les retira el alimento. 3) AYUNADAS y REALIMENTADAS (AR): se les retira el alimento durante 48 horas. Posteriormente se les alimenta durante 24 horas con su dieta normal y un suplemento en el agua de glucosa 20mM. 4) DIABÉTICAS (D): La diabetes se induce mediante la inyección por vía intraperitoneal de estreptozotocina a una dosis de 65 mg/kg/peso. La estreptozotocina destruye selectivamente las células ß del páncreas, encargadas producción de insulina. Los animales tienen en todo momento acceso a la comida. Contamos con muestras de PLASMA, FRACCIÓN CITOSÓLICA DE HÍGADO y GLUCÓGENO de todos estos grupos de animales. METODOLOGÍA MANTENER TODAS LAS MUESTRAS EN HIELO DURANTE LA PRÁCTICA 1.-DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD G6PDH EN EXTRACTO HEPÁTICO La glucosa-6-p deshidrogenasa (G6PDH) es la enzima que cataliza una s reacciones vía s pentosas fosfato. Como se ha indicado anteriormente en este guión, el ciclo s pentosas fosfato genera poder reductor en forma de NADPH necesario para la síntesis de ácidos grasos y esteroides, así como pentosas fosfato para la síntesis de ácidos nucleicos. Cuando hay síntesis de ácidos grasos hay niveles altos de G6PDH y por tanto de NADPH. La determinación actividad G6PDH se realizará mediante la medida espectrofotométrica aparición de NADPH a 340 nm (el NADP+ no absorbe a 340 nm, mientras que el NADPH sí lo hace). Por tanto la actividad G6PDH viene dada por los nmoles de NADPH/min formados. Protocolo: 1.- preparar 2 cubetas de espectrofotómetro: una para el blanco y otra para la muestra. 2.- añadir 2,8 ml de TAMPÓN A (0,1 M Trietanolamina ph 7,4, 2,5 mm MgCl2, 0,26 mm NADP) a cada cubeta. 3.- añadir 0,2 ml de extracto fracción citosólica muestra problema a cada cubeta. 4.- añadir a la cubeta blanco 0,1 ml de H 2 O, ajustar el espectrofotómetro (este va a ser el tiempo cero, t=0). Mantener los tubos en incubación en baño a 37º C y realizar una medida cada minuto durante 10 minutos añadir a la segunda cubeta 0,1 ml de glucosa-6p (66mM) y agitar (tapar la cubeta con parafilm). Medir la absorbancia a t=0. Mantener los tubos a 37º C y realizar una medida cada minuto durante 10 minutos. (t=1, t=2,,t=10). 5.- calcular la actividad enzimática de G6PDH de cada muestra. 10

11 Tampón A Extracto H 2O glucosa- 6P Absorbancia Tubo ml ml ml ml t=0 t=1 t=2 t=3 t=4 t=5 t=6 t=7 t=8 t=9 t=10 DO/min muestra C 2,8 0,2 Muestra C 2,8 0,2 0 0,1 muestra A 2,8 0,2 Muestra A 2,8 0,2 0 0,1 muestra AR 2,8 0,2 Muestra AR 2,8 0,2 0 0,1 muestra D 2,8 0,2 muestra D 2,8 0,2 0 0,1 La actividad enzimática es universalmente representada por las Unidades Internacionales. 1.0 Unidad de enzima se define como la cantidad de enzima que transforma 1 mol de sustrato por minuto a 25 ºC. Así el término actividad se refiere a las unidades totales de enzima en solución. Cuando la actividad se refiere a la cantidad de proteína o gramo de tejido se denomina actividad específica. La actividad específica es el número de unidades de enzima por miligramo de proteína total, siendo una medida pureza proteína. Las unidades en las que se expresa la actividad específica de una enzima son: mol de sustrato transformado min -1 mg -1 de proteína a una temperatura y ph determinado. Pero también puede reflejarse como cambio de incremento DO por minuto para expresar una actividad relativa. Cálculo actividad enzimática: - Representar en una gráfica Abs frente a tiempo (min) las rectas muestra blanco y problema. - Determinar la pendiente de ambas rectas. - Sustraer a la pendiente recta problema, la pendiente recta blanco que ha medido el NADPH endógeno que corresponde a D /t (min). (creación inespecífica). DO/min específica = DO/min total(problema) - DO/min inespecífica (blanco) Teniendo en cuenta la ecuación: DO=c x x l donde: c= concentración = coeficiente de extinción molar (el NADPH tiene un a 340 nm de 6.22 x 10 6 cm 2 mol -1 ) l longitud del paso de luz (1 cm) y teniendo en cuenta el tiempo c/ t = (DO/ t)/ x l donde DO/t corresponde a la pendiente ecuación recta obtenemos la actividad en mol/ml min 11

12 2.-DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD PEPCK EN EXTRACTO HEPÁTICO El fosfoenolpiruvato (PEP) está implicado en la gluconeogénesis, es decir, en la producción de glucosa a partir de fuentes no hidrocarbonadas. Como se ha explicado anteriormente, durante un periodo de ayuno, la glucosa tiene que formarse a partir de sustratos alternativos con lo que se consigue mantener su concentración en la sangre. En esta práctica se va a utilizar un sistema enzimático en el que la PEPCK endógena se acopla a la enzima Malato deshidrogenasa exógena. La mezcla de reacción (tampón B) contiene IDP, CO 3 H, NADH y MDH en exceso de tal forma que la reacción total está únicamente limitada por la actividad PEPCK. La actividad PEPCK se determina en base a la velocidad de desaparición de NADH medida espectrofotométricamente a 340nm. Protocolo: 1.- preparar 2 cubetas de espectrofotómetro: una para el blanco y otra para la muestra. 2.- ajustar a cero el espectrofotómetro con una muestra de agua y NO volver a ajustarlo 3.- añadir 2,8 ml de TAMPÓN B (36 mm Tris-ClH ph 7,4, 1,18 mm MnCl2, 17,85 mm Na CO3H, 1,1 mm glutation reducido 1,18 mm IDP, 0,14 mm NADH) a cada cubeta. 4.- añadir 0,1 ml de extracto fracción citosólica muestra problema a cada cubeta. 5.- añadir 0,1ml de enzima MDH (1600U/litro). 6.- añadir a la cubeta blanco 0,2 ml de H 2 O (este va a ser tiempo cero, t=0), ANOTAR LA DO (debe estar en torno a ; NO AJUSTAR A CERO). Mantener los tubos a 37º C.y medir la absorbancia cada minuto durante un periodo de 10 minutos (t=1, t=2,,t=10). 7.- añadir a la segunda cubeta 0,2 ml de PEP (16,5 mm). Medir la absorbancia a t=0 y cada minuto durante un periodo de 10 minutos (t=1, t=2,,t=10). 8.- calcular la actividad enzimática de PEPCK de cada muestra. 12

13 Tampón B Extracto MDH H 2 O PEP Absorbancia Tubo ml ml ml ml ml t=0 t=1 t=2 t=3 t=4 t=5 t=6 t=7 t=8 t=9 t=10 DO/min muestra C 2,8 0,1,2 0 Muestra C 2,8 0,1 0,2 muestra A 2,8 0,1,2 0 Muestra A 2,8 0,1 0,2 muestra AR 2,8 0,1,2 0 Muestra AR 2,8 0,1 0,2 muestra D 2,8 0,1,2 0 muestra D 2,8 0,1 0,2 Cálculo actividad enzimática: - Representar en una gráfica Abs frente a tiempo (min) la recta muestra blanco y la muestra problema. - Determinar la pendiente de ambas rectas - Sustraer a la pendiente recta problema la pendiente recta control que corresponde a OD/t (min) DO/min específica = DO/min total(problema) - DO/min inespecífica (blanco) Teniendo en cuenta la ecuación: DO=c x x l donde: c= concentración = coeficiente de extinción molar (El NADH tiene un a 340 nm de 6.22 x 10 6 cm 2 mol -1 ) l longitud del paso de luz (1 cm) y teniendo en cuenta el tiempo c/ t = (DO/ t)/ x l donde DO/t corresponde a la pendiente ecuación recta obtenemos la actividad en mol/ml min. 13

14 3.-DETERMINACIÓN DEL GLUCÓGENO HEPÁTICO [preparado por los profesores] El glucógeno se determina midiendo la cantidad de glucosa total hepática obtenida después de una hidrólisis con amiloglucosidasa que degrada totalmente el glucógeno hasta convertirlo en glucosa y sustrayendo a esta medida el valor obtenido para la glucosa hepática libre. Protocolo: 1.- tomar 1 ml del sobrenadante s muestras hepáticas desnaturalizadas con ácido perclórico y ponerlo en tubos graduados debidamente rotulados. 2.- añadir una gota de indicador de ph y neutralizar todos los tubos con KOH al 5%. 3.- anotar los volúmenes de cada tubo y dejar los tubos en hielo 5 minutos para que precipite el perclorato potásico. 4.- Centrifugar los tubos 5 min en la microcentrífuga (1,5 ml) 5.- separar una alícuota de 0,2 ml de cada muestra para la hidrólisis del glucógeno 6.- guardar el resto para determinar la glucosa libre (congelado a 20 ºC). 7.-realizar la hidrólisis de glucógeno con las alícuotas de 0,2 ml del paso 5: para hacer la hidrólisis hay que añadir a cada alícuota 3ml de acetato sódico 0,1 M ph 4, 75 y 0,2 ml de amiloglucosidasa (25 mg/ml) acetato sódico Extracto amiloglucosidasa (alícuotas del paso 5) Tubo ml ml ml Muestra 1 3,0 0,2 0,2 Muestra 2 3,0 0,2 0,2 Muestra 3 3,0 0,2 0,2 Muestra 4 3,0 0,2 0,2 8.- Incubar la reacción a 40º C durante una hora en un baño con agitación. 9.- Parar las reacciones añadiendo 1,8 ml de ClO 4 H al 2%. Transcurridos 10 min neutralizar las muestras con KOH al 10% en presencia de indicador de ph anotar el volumen final de cada tubo, dejar en hielo durante 10 min y centrifugar las muestras 5 min en la microcentrífuga (1,5 ml es suficiente). Tomar 1,5 ml de los sobrenadantes en tubos eppendorf debidamente rotulados y congelar a 20º C para determinar glucosa total hepática. 4.-DETERMINACIÓN DE GLUCOSA La cantidad de glucosa se determinará utilizando el ensayo enzimático glucosa oxidasaperoxidasa. La glucosa oxidasa cataliza la siguiente reacción: El peróxido de hidrógeno formado se descompone mediante la acción peroxidasa y el oxígeno liberado oxida a la orto-dianisidina reducida (D). La orto-dianisidina oxidada tiene un pico de absorción a 440 nm. El coeficiente de extinción molar de esta sustancia varía con las condiciones del ensayo por lo cual siempre hay que utilizar una curva de glucosa patrón de concentración conocida. 14

15 Para esta práctica se usará la siguiente mezcla de reacción: tampón fosfato 0,5 M Tris 0,1 M ph 7,3, 1 U/ml glucosa oxidasa (0.062 mg7ml), 3,5 U/ml peroxidasa (0,02 mg/ml), 0,5 ml de ortodianisidina (1% p/v en etanol al 96%) en 150 ml de mezcla de reacción. Protocolo: 1.- Preparar los siguientes tubos, incubar a 37º C durante 1 hora y medir la absorbancia a 440 nm. Añadir la mezcla de reacción al mismo tiempo a todas las muestras: Inicio reacción. Tubo Glucosa 0,4 mm (ml) Agua (ml) Muestra (ml) Blanco --- 1, ,0 1 0,125 0, ,0 2 0,250 0, ,0 3 0,325 0, ,0 4 0,500 0, ,0 5 1, ,0 Plasma 1/40 muestra ,250 0, muestra ,250 0,750 4,0 muestra ,250 0,750 4,0 muestra ,250 0,750 4,0 GluLibre* 1/3 muestra ,250 0,750 4,0 muestra ,250 0,750 4,0 muestra ,250 0,750 4,0 muestra ,250 0,750 4,0 GluTotal** 1/6 muestra ,250 0,750 4,0 muestra ,250 0,750 4,0 muestra ,250 0,750 4,0 muestra ,250 0,750 4,0 Mezcla Reacción (ml) DO 440 nm GluLibre*: Para calcular la glucosa libre se usará el extracto del paso 6 del apartado DETERMINACIÓN DEL GLUCÓGENO HEPÁTICO GluTotal**: Para calcular la glucosa total se usará el extracto del paso 10 del apartado DETERMINACIÓN DEL GLUCÓGENO HEPÁTICO 2.- Con la ayuda curva de calibración, calcular los mg/ml de glucosa presente en plasma e hígado (como glucosa total y glucosa libre). Tomar en cuenta las diluciones efectuadas en cada caso. Cálculo concentración de glucosa: - Representar en una gráfica Abs frente a concentración (mm) de glucosa patrón (OJO! es concentración de glucosa, no volumen añadido de glucosa 0,4 mm) - Determinar la pendiente recta - Interpolar los valores de DO s muestras problema para obtener su concentración. - Esta concentración corresponde a 750 L de muestra, que en 1 ml deben multiplicarse por 6,66 (5mL/0.75 ml) y a su vez multiplicarse por el correspondiente factor de dilución de muestras empleado (en el plasma, muestra de Glu libre y Glu total): Ver cuadro. - La cantidad de glucosa procedente degradación del glucógeno se obtiene restando al dato de glucosa total la glucosa libre. Obtener los datos de todos los tipos de muestra poniendo a punto resultados con el resto de parejas de cada mesa. 15