UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE LA MIXTECA
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- Salvador Moya Martínez
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1 UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE LA MIXTECA EJERCICIOS CROMATOGRAFIA, ELECTROFORESIS Maestría en Ciencias: Productos Naturales y Alimentos Dra. Beatriz Hernández Carlos Análisis Químico Cuantitativo
2 Cromatograma típico t R = tiempo de retención t R = tiempo de retención para el pico no retenido t R = t R - t M = tiempo de retención ajustado w h = ancho del pico a ½ de la altura del pico W b = ancho del pico determinado en la base
3 w b = ancho del pico en la base (w b = 4s) w h = ancho del pico medido al 50% de la altura total del pico w i = ancho del pico medido en el punto de inflexión ej 60.7 % de la altura total del pico
4 Calidad del pico Desviación estándar relativa = s/t R porque la forma del pico ó s depende del flujo N = n = (t R /s) 2 Número de platos teoricos = eficiencia de la columna N = a (t R /w) 2 Método a w b 16 w h 5.54 w i 4
5 Desviación estándar relativa = s / t R N = n = (t R /s) 2 = 16 (t R /w b ) 2 = (t R /w h ) 2 h = L/n altura equivalente para un plato teórico L = longitud de la columna (mm)
6 Ejemplo Se tienen dos columnas de 25 cm x 2.6 mm DI en las cuales el mismo soluto es analizado. En la columna A, el tiempo de retención s, w h = 1.7 mm ó 10.2 s En la columna B, el tiempo de retención es s y w h = 13.2 s Prediga cuál es la columna más eficiente Respuesta n A = 9241; h A = mm n B = 7369; h B = mm
7 Factor de capacidad (factor de retención): k = t R/t M = (t R t M )/t M Factor de separación (describe la posición relativa de dos picos) = t R(B)/t R(A) = k B /k A Resolución Rs = Dt/(wb1 + wb2)1/2 = 2Dt/ wb1 + wb2
8 Problema 1. han descrito los siguientes datos, correspondientes al análisis en GC de p-xileno y metilisobutilcetona (MIBC) en una columna capilar Modo de inyección Compuesto Tr (min) Área pico Ancho pico (min) Con divisor p-xileno , metilisobutilcetona , Sin divisor p-xileno ,396, metilisobutilcetona ,493, Explique la diferencia entre los tiempos de retención, las áreas de los picos y la anchura de los picos cuando se utiliza la inyección sin divisor en lugar de la inyección con divisor
9 Problema2. Haddad y colaboradores encontraron los siguientes factores de capacidad para la separación en fase reversa de salicilamida (k r sal) y cafeína (k caf) % v/v metanol K sal K caf Explique los cambios del factor de capacidad Qué ventajas tienen el uso de una fase móvil con menor porcentaje de metanol? Existe algún inconveniente?
10 Tiempo de retención, t R ajustado t M tiempo muerto Volumen de retención Constante de distribución Cs concentración en la fase estacionaria Factor de retención Retención relativa
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13 Problema 3 En un conjunto de alcanos normales, se obtuvieron los datos siguientes usando una fase estacionaria de Carbowax 20 M Alcano t r Pentano 0.79 Hexano 1.99 Heptano 4.47 Octano Nonano Cuál será el índice de retención de un compuesto cuyo tiempo de retención ajustado sea de 9.36 minutos?
14 Problema 4. Suponga que tiene que separar una mezcla de ácido benzoico, aspartame y cafeína en un refresco de soda dietético. Dispone de la información siguiente: Compuesto t r en fase móvil acuosa tamponada a un ph de Ácido benzoico Aspartame cafeína Explique el cambio del tiempo de retención de cada compuesto Represente el tiempo de retención en relación con el ph de cada componente en una misma gráfica e identifique el ph con el que se logrará una separación aceptable
15 t R separacion en buffer Ácido benzoico Aspartame cafeína ph
16 Problema 5. Un conjunto de patrones de polivinilpirrolidona con distintos pesos moleculares se analizó mediante cromatografía de exclusión por tamaño, dándolos siguientes resultados Peso fórmula Volumen de retención (ml) 600, , , , Al analizar una preparación de polivinilpirrolidona de peso fórmula desconocido, se encontró un volumen de retención de 8.45 ml. Calcule el peso fórmula medio de la preparación.
17 Cromatografía de exclusión Vr = Vi + Vo Vr= volumen de retención Vi= volumen de la fase móvil que ocupa el espacio de los poros del material empaquetado Vo = Volumen de la fase móvil en el resto de la columna Límite de inclusión: soluto más pequeño que puede separarse de otros solutos Límite de exclusión= el soluto más grande que puede separarse de otros solutos
18 Log peso formula Peso mol y = x Volumen de retención
19 TSK =Polimero de vinilo hidrofilico
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21 Problema 6. La concentración de residuos de plaguicidas en productos agrícolas como, por ejemplo, en las naranjas, puede determinarse con GC-EM. Los residuos de plaguicidas se extraen de la muestra usando cloruro de metileno y los extractos se concentran hasta un volumen muy pequeño. La calibración se hace usando antraceno como patrón interno. En un estudio para determinar las ppb de heptaclor epóxido en naranjas, se trituro una muestra de 50 g de corteza de naranja y se extrajo con 50 ml de diclorometano. Tras eliminar los materiales insolubles, se redujo el volumen y se adicionó el patrón interno, finalmente se diluyo a 10 ml. El análisis de la muestra demostró una relación pico área (Aanal/Aint) de Un conjunto de patrones de claibración, todos con la misma cantidad de antraceno que la muestra, dio el siguiente resultado. Ppb epóxido de heptaclor Aanal/Aint Indique la concentración de epóxido de heptaclor (en nanogramos/gramo) en las naranjas
22 ppb Ppb epóxido de heptaclor y = x R² = ppb mg/1000 g ng/g Aanal/Aint
23 INDICE DE RETENCIÓN DE KOVAT Índice de retención- Normalización de los tiempos de retención mediante comparación del tiempo de retención de un soluto con los alcanos normales El Ir Kovat para un alcano normal es 100 veces su número de carbonos, es decir I propano = 100 x 3 = 300 I butano= 100 x 4 = 400 Si se tienen los sig. datos: Compuesto Propano Isobutano 5.71 butano 6.17 Tiempo de retención (t r) 2.23 min Índice de Kovat I cpt = 100 log t r cpt (log t r x log t r x+1 (log t r x + I x cpt = Índice de retención del compuesto, x = alcano normal que eluye antes del compuesto X+1 = alcano normal que eluye despues del compuesto
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25 INDICE DE POLARIDAD (P ) El índice de polaridad de una fase binaria AB será: P AB = ɸ A P A + ɸ B P B ɸ fracciones de volumen Ejemplo Cuál es el índice de polaridad de una mezcla de 60% de agua y 40% de metanol?
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27 Movilidad electroforética Medida de la capacidad de un soluto para desplazarse en el seno de un medio conductor como respuesta a la aplicación de un campo eléctrico (m ef ) La velocidad a la que los solutos se mueven en respuesta al campo eléctrico es la velocidad electroforética (Vef ) v ef = m ef E donde E = magnitud del campo eléctrico aplicado E = V/L Longitud del tubo capilar, V= voltaje aplicado m ef = q/6πηr donde q= carga del soluto; η = viscosidad; r= radio del soluto
28 Tiempo de migración (t m ) La velocidad de un soluto viene dada por V tot = l/t m donde l = es la distancia que el soluto viaja desde el punto de inyección hasta el detector v tot = v ef + V feo = (m ef E + m feo E) = E (m ef + m feo ) Y el t m será: t m = 1 μ ef + μ feo E Mientras que E = V/L, V = potencial aplicado; L = longitud del tubo capilar Eficacia N = μ ef + μ feo V 2D Donde D es el coeficiente de difusión del soluto
29 Velocidad del flujo electroosmótico Velocidad a la que se mueve el soluto a través del capilar por efecto del flujo electroosmótico (m feo ) V feo = m feo E m feo = ξζ/4πη donde ξ = constante dieléctrica de la disolución tampón ζ = potencial zeta η = viscosidad de la solución tampón Potencial zeta = Cambio de potencial a través de una doble capa Inyección hidrodinámica Se emplea presión para inyectar la muestra en la columna capilar V iny = Pd4 π t 128ηL 103 DP = Diferencia de presión a través del capilar medida en pascales; d = diámetro interno del capilar en metros; t = tiempo de aplicación de la presión en segundos; η = viscosidad de la disolución tampón en kg/ms; L = longitud del tubo capilar en metros
30 Selectividad α = μ ef 1 μ ef 2 Resolución R = μ ef2 μ ef1 μ md μ feo V 1 2 D Movilidad electroforética media de los dos solutos
31 Ejercicio. Se hace una inyección hidrodinámica aplicando una diferencia de presión de 2.5 x 10 3 Pa (aprox 0.02 atm) durante 2 segundos en un tubo capilar de 75 cm, con un diámetro interno de 50 mm. Admitiendo que la viscosidad de la disolución tampón es 10-3 kg/ms Cuál es el volumen de muestra aplicado?
32 Solución V iny = Pa ( m 4 (3.14 (2s 128(0.001 kgm 1 s m 10 3 = L = 1 nl
33 Ejercicio McKillop y colaboradores examinaron la separación electroforérica de las alquilpiridinas mediante EZC. Las separaciones se efectuaron usando capilares de 50 o 75 mm de diámetro interno, con una longitud total de 57 cm y una distancia entre el punto de inyección y el detector de 50 cm. El tampón usado fue fosfato de litio a ph 2.5. Las separaciones se efectuaron aplicando 15 kv de voltaje. La velocidad del flujo electroosmótico, medida con un marcador neutro, fue de x 10-5 cm 2 V -1, s -1. El coeficiente de difusión, D de las alquilpiridinas es de 1 x 10-5 cm 2, s -1. a. Calcule la movilidad electroforética de la 2-etilpiridina teniendo en cuenta que su tiempo de elución es de 8.20 minutos b. Cuántos platos teóricos hay para la 2-etilpiridina? c. Las movilidades electroforéticas para 2-etilpiridina 2,4-dietilpiridina son x 10-4 y x 10-4 cm 2 V -1 s -1 respectivamente. Cuál es la resolución previsible entre las dos alquilpiridinas? d. Explique las tendencias de la movilidad electroforética que se muestran en el cuadro siguiente Alquilpiridina μ ef cm 2 V s 2-etilpiridina x etilpiridina x etilpiridina x 10-4
34 f) El pka de la piridina es A un ph de 2.5 la movilidad electroforética de la piridina es x 10-4 cm2 es de 7.5? V s Cuál será la movilidad electroforética previsible si el ph del tampón
35 v tot = μ ef + μ feo E v l 50 cm tot= t = m 492 s = cm s E = V L = V 57 cm = V cm v tot = μ ef + μ feo E = cm s cm2 = μ ef V s μ ef = cm2 V s V cm
36 Platos teóricos N = = cm 2 V s cm V s cm2 s V
37 Resolución R = μ ef2 μ ef1 V 1/2 μ md μ feo D 4 cm2 Donde μ ef2 = y μ V s ef1 = cm2 V s Mientras que R = μ md = cm2 V s cm2 cm V s V s cm2 V s cm2 V s V 1/2 cm s = 1
38 Se efectuó un análisis mediante CEZ del NO 3-1 presente en el agua de un acuario, usando IO 4- como patrón interno. Una disolución patrón de 15 ppm de nitratos y 10 ppm de yodato dio alturas de picos de 95 y 100.1, respectivamente (unidades arbitrarias). Una muestra de agua del acuario se diluyo 1:100 y se añadió suficiente patrón interno para alcanzar una concentración de 10 ppm. El análisis produjo señales de 29.2 para nitrato y para yodato. Informe las ppm de nitratos en la muestra de agua del acuario.
39 Usando una curva de calibración normal, se puede determinar la cantidad de cafeína de un comprimido analgésico mediante análisis en HPLC. Las disoluciones patrón de cafeína se preparan y analizan usando un bucle de 10 microlitros de volumen fijo. Los resultados de los patrones se resumen en el cuadro siguiente: Concentración patrones ppm Señal (unidades arbitrarias) La muestra se prepara colocando un único comprimido en un vaso pequeño y añadiendo 10 ml de metanol. Una vez disuelta la muestra, el contenido del vaso, incluido el captador insoluble se transfiere a un matraz volumétrico de 25 ml y se afora con metanol. El análisis de HPLC produce una señal de para la cafeína. Indique los miligramos de cafeína en el comprimido analgésico.
40 En un conjunto de alcanos normales, se obtuvieron los datos siguientes usando una fase estacionaria de carbowax 20 M: Alcano t r (min) Pentano 0.79 Hexano 1.99 Heptano 4.47 Octano Nonano Cuál será el índice de retención de Kovat de un compuesto cuyo tiempo de retención ajustado sea de 9.36 minutos?
41 R= 765
42 Las sustancias de la tabla siguiente se separaron por cromatografía usando una columna de filtración por gel. Estimar la masa molecular del compuesto desconocido Compuesto Vr(mL) Masa molecular Daltons Azul de dextrano x 10 6 Aldolasa Catalasa Ferritina Tiroglobulina Desconocido 30.3?
43 R = ( ) y = x
44 Un procedimiento cromatográfico separa 4 mg de una mezcla desconocida en una columna de 40 cm de longitud y cm de diámetro a) Que tamaño debe tener una columna para separar 100 mg de la misma mezcla? b) Si el caudal es de 0.22 ml/min en la columna pequeña, Qué caudal se debe usar en la columna grande? c) Si la fase móvil ocupa el 35 % del volumen de la columna, calcule la velocidad lineal de flujo en la columna pequeña y en la columna grande El caudal
45 Velocidad de flujo lineal: centímetros/min que recorre el disolvente dentro de la columna Ejemplo: Datos: Flujo de 0.3 ml/min Diámetro de la columna: 0.60 cm (radio 0.30 cm) La fase móvil ocupa el 20 % de la columna Cálculos: Volumen de la columna por cm de longitud = π r 2 x longitud = x (0.30 cm) 2 (1 cm) = cm 3 = ml Volumen de la fase móvil = x 0.2 = ml Un centímetro de columna contiene ml de fase móvil, entonces 0.30 ml ocupan 0.30 ml x ml/cm = 5.3 cm de columna, por lo que la velocidad lineal es 5.3 cm/min
46 Escalado Masa mayor Masa menor = radio mayor columna radio menor de la columna 2 Reglas: Mantener constante la longitud de la columna El área de la sección transversal de la columna es proporcional a la masa del analito Mantener constante la velocidad lineal de flujo Volumen de muestra aplicada a la columna es proporcional a la masa del analito El caudal debe incrementarse el número de veces que se incrementa el volumen de la columna
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48 a) 40 cm de longitud, 4.25 cm de diámetro b) 5.5 ml/min c) 1.11cm/min para los dos
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