INTERES CLINICO FUNDAMENTO DEL ENSAYO
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- Lidia Pérez Peña
- hace 5 años
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1 1 INTERES CLINICO La tiroides produce y segrega la hormona Tiroxina (T4), imprescindible para el desarrollo físico y mental normal desde los primeros momentos de la vida hasta una edad muy avanzada (1). La T4 se encuentra normalmente en el plasma y aproximadamente un 90 % del iodo circulante está presente en esta hormona. Se transporta unida principalmente a la globulina enlazante de la tiroxina (TBG), a la prealbúmina enlazante de la tiroxina (TBPA) y a la albúmina (TBA) (2). Su determinación en suero tiene una importancia esencial como indicador del estado funcional tiroideo y constituye un elemento de gran interés en el diagnóstico, tratamiento y seguimiento de las diferentes afecciones y enfermedades de la tiroides (3). Generalmente el Hipotiroidismo se acompaña de niveles bajos de T4, mientras que en el Hipertiroidismo estos niveles suelen estar elevados (4). FUNDAMENTO DEL ENSAYO EL UMELISA T4 es un ensayo inmunoezimático competitivo, donde el antígeno natural y el antígeno marcado con una enzima compiten por una cantidad limitada de sitios de unión al anticuerpo (5). En este ensayo se utiliza como fase sólida tiras de ultramicroelisa revestidas previamente con anticuerpos anti-t4, lo cual garantiza la especificidad del ensayo. Las muestras de suero se mezclan con el conjugado T4/Fosfatasa Alcalina (F.A.) y se depositan en los pocillos de las tiras de reacción. Se procede a la incubación de las mismas hasta lograr la formación del complejo anticuerpo-antígeno-enzima. La realización de un lavado posterior elimina los componentes no fijados y al añadir un sustrato fluorigénico (4-Metilumbeliferil fosfato) en los pocillos de las tiras, éste resultará hidrolizado por la enzima del conjugado. La intensidad de la fluorescencia emitida será inversamente proporcional a la concentración de T4 presente en la muestra.
2 2 CONTENIDO DEL ESTUCHE Y PREPARACIÓN DE LAS SOLUCIONES DE TRABAJO Código UM 2015 (288 pruebas) Contenido: Placa recubierta de 12 tiras x 8 pocillos 3 R1: Solución Tampón 2 x 25 ml R2: Suero Estándar 6 x Liofilizado R3: Suero Control 1 x Liofilizado R4: Conjugado 1 x 2,5 ml R5: Tampón Conjugado 2 x 25 ml R6: Sustrato 1 x 2 ml R7: Tampón Sustrato 1 x 18 ml El lote de las placas recubiertas se muestra en el borde de su envase primario, el cual está compuesto por cinco dígitos, los cuatro primeros representan la fecha de vencimiento de las placas y el quinto representa un indicador numérico interno del proceso de producción. Todos los reactivos contienen azida sódica (0,2 g/l) como preservante. Los Sueros Estándares y el Suero Control, fueron negativos a las pruebas de detección de anti-vih 1+2, HBsAg, anti-vhc y Sífilis. Preparación de las soluciones de trabajo: R1: Para una tira de reacción, diluya 1 ml de solución R1 hasta un volumen de 25 ml con agua destilada. Mezcle suavemente para evitar la formación excesiva de espuma. Prepare sólo lo necesario para el ensayo. R2: Reconstituya cada frasco con 0,5 ml de agua destilada. Permita su completa disolución y mezcle. R3: Reconstituya con 0,5 ml de agua destilada. Permita su completa disolución y mezcle. R4: Diluya 1:41 con R5 según el número de tiras a emplear. Cantidad necesaria por tira: 1 ml (0,025 ml de R4 + 1 ml de R5). Homogeneice cuidadosamente. R6: Diluya 1:10 con R7. Cantidad necesaria por tira: 0,5 ml (0,05 ml de R6 + 0,45 ml de R7). Prepare inmediatamente antes de usar y sólo lo necesario para el ensayo.
3 3 CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD Todos los reactivos deben mantenerse entre 2 y 8 ºC. En estas condiciones, serán estables en el envase original hasta la fecha de vencimiento. Después de utilizar parte del contenido de los reactivos, el resto es estable durante 40 días si se mantienen las mismas condiciones de almacenamiento y se evita la contaminación durante la ejecución de la prueba. Las tiras de reacción, no utilizadas, se mantienen estables durante 40 días entre 2 y 8 ºC en la bolsa suministrada, protegida con el desecante y herméticamente cerrada. MATERIALES NECESARIOS NO SUMINISTRADOS - Agua destilada. - Hipoclorito de Sodio. - Pipeta multicanal con puntas desechables para 10 µl. - Pipetas de precisión entre 10 y µl. - Probetas graduadas entre 10 y 250 ml. - Papel absorbente. PRECAUCIONES -Manipule las muestras, los Sueros Estándares y el Suero Control como potencialmente infecciosos. Utilice guantes desechables. Los materiales utilizados deben colocarse en soluciones desinfectantes (hipoclorito de sodio al 5 %) o esterilizarse en autoclave. -Considere a los equipos y accesorios que se han puesto en contacto directo con las muestras y reactivos como contaminados. Realice los procedimientos de limpieza indicados en los manuales de usuario correspondientes. -Antes de comenzar a trabajar verifique que todos los reactivos estén a temperatura ambiente y los Sueros Estándares y el Suero Control, una vez preparados según las instrucciones, se encuentren completamente disueltos.
4 4 -Utilice puntas limpias o nuevas para la reconstitución y trabajo con las soluciones o muestras. -Los sueros a utilizar deben ser preferentemente frescos, sin precipitados y debe evitarse la congelación y descongelación reiterada de los mismos. -Las tiras de reacción deben estar a la temperatura del laboratorio antes de retirarle la cubierta protectora. -Verifique que las tiras de reacción estén niveladas en el soporte. -Evite la exposición a la luz de los frascos que contienen el Sustrato y el Tampón Conjugado. -Verifique periódicamente la exactitud y precisión de las pipetas. -Cumpla las normas de manipulación de los equipos utilizados y verifique previamente su adecuado funcionamiento, tenga especial cuidado en la operaciones de pipeteo y lavado. -Si utiliza la multipipeta ERIZO para transferir los Sueros Estándares, el Suero Control y las muestras, debe lavar profusamente sus puntas para evitar la contaminación, al menos un lavado de cinco ciclos con solución de trabajo R1 y un lavado de cinco ciclos con agua destilada. Deseche la solución y el agua destilada después de cada lavado. -Evite posibles contaminaciones con materiales fluorescentes. -El juego de reactivos no debe emplearse después de la fecha de vencimiento. -Los reactivos del UMELISA T4 de lotes diferentes no se deben intercambiar. PROCEDIMIENTO TÉCNICO 1.- Preparación de los Sueros Estándares, el Suero Control y las muestras. Sueros Estándares y Suero Control: Los Sueros Estándares y el Suero Control, una vez reconstituidos tienen la concentración especificada en la etiqueta de los frascos. Diluya cada uno 1:21 con la solución de trabajo R4 (5 µl de suero µl de la solución), al menos 15 minutos antes de transferirlos a las tiras de reacción. Muestras: Diluya los sueros 1:21 con la solución de trabajo R4 (5 µl de suero µl de la solución), al menos 15 minutos antes de transferirlos a las tiras de reacción.
5 5 2.- Adición de los Sueros Estándares, el Suero Control y las muestras a las tiras de reacción. Añada 10 µl de las muestras, los Sueros Estándares (R2a-R2f) y el Suero Control (R3) previamente diluidos, en los pocillos de reacción según el siguiente esquema de distribución: A B C D E F G H R2a R2e R2a R2e R2b R2f R2b R2f R2c R R2c R R2d R2d Se recomienda evaluar las muestras por duplicado. De utilizarse con este fin el programa UMELISA T4 para la interpretación automática de los resultados, la distribución de las muestras debe realizarse manteniendo los esquemas descritos; en las posiciones 1 y 2 coloque la primera muestra, en las posiciones 3 y 4 la segunda y así sucesivamente. 3.-Incubación Incube las tiras de reacción dos horas a temperatura ambiente (20-25 ºC) en cámara húmeda.
6 6 4.-Lavado Utilice un lavador de la tecnología SUMA. Lave las tiras de reacción cuatro veces. Verifique el llenado total del pocillo con la solución R1 de trabajo. La solución debe permanecer como mínimo 30 segundos en los pocillos en cada lavado. Después de la última aspiración seque las tiras sobre papel absorbente. 5.-Adición del sustrato Coloque 10 µl de sustrato convenientemente diluido en cada pocillo de las tiras de reacción. 6.-Incubación del sustrato. Incube en cámara húmeda a temperatura ambiente (20-25 ºC). Normalmente se requiere una incubación de 30 minutos para alcanzar una señal fluorescente de 100 a 150 unidades para el Suero Estándar R2a, sin embargo, debido a las variaciones de temperatura puede resultar conveniente que cada laboratorio ajuste el tiempo de incubación para lograr estos niveles de fluorescencia. 7.- Lectura Realice la lectura de la intensidad de la fluorescencia emitida en cada determinación utilizando un lector de la serie SUMA. PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO Se determina el cociente entre la fluorescencia promedio (F) de los Sueros Estándares, el Suero Control y las muestras y la fluorescencia promedio del Suero Estándar R2a (FO), el resultado se expresa en porciento. En el caso del Suero Estándar R2a: F/FO (%) = 100. Los valores calculados de las muestras se interpolan en un gráfico F/FO (%) contra la concentración de T4 correspondiente a la Curva Estándar obteniéndose los valores de concentración en nmol/l
7 7 Curva Estándar F/F0 (%) T4 nm ol/l La validación, interpretación e impresión de los resultados son realizados automáticamente por el programa UMELISA T4 CONTROL DE CALIDAD I. La Curva Estándar debe cumplir la siguiente condición: La media de los dos valores de fluorescencia para cada Suero Estándar (a-f) deben proporcionar un decremento en fluorescencia proporcional a su concentración, siguiendo un patrón similar al ejemplificado, los valores discordantes son eliminados automáticamente por el programa II. El valor de concentración calculado para el suero control debe encontrarse en el intervalo establecido para el ensayo.
8 8 III.- Si las muestras son analizadas por duplicado deben cumplir la siguiente condición: La diferencia de los valores de fluorescencia de los duplicados de una muestra debe ser menor al 20 % con respecto a su valor medio. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS En un estudio realizado utilizando 300 sueros de niños sanos menores de tres años con un estado eutiroideo bien definido se determinó la concentración de T4 empleando el estuche de reactivos UMELISA T4. Utilizando el 20 percentil de la distribución el nivel de corte correspondió con 99,12 nmol de T4 /L de suero, las muestras que presentan una concentración igual o inferior son consideradas como bajas. Teniendo en cuenta los diferentes factores genéticos y ambientales que actúan sobre poblaciones de diferentes localizaciones geográficas la práctica internacional recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia. CARACTERÍSTICAS ESPECÍFICAS DEL ENSAYO 1.- PRECISIÓN Se calculó evaluando en el ensayo tres muestras de concentraciones comprendidas en tres rangos de valores: alto, medio y bajo (intraensayo), y el mismo fue repetido durante varios días (interensayo). Precisión del UMELISA T4 (nmol/l) Intraensayo (n=20) Interensayo (n=20) DE CV (%) DE CV (%) 24,9 1,9 7,7 2,3 9,2 101,7 3,9 3,8 5,1 5,0 202,8 6,2 3,0 7,0 3,4 DE: Desviación Estándar CV: Coeficiente de Variación
9 9 2.- EXACTITUD El porcentaje de recuperación obtenido al añadir diferentes cantidades de T4 a tres muestras de suero de concentración conocida fue superior al 95 %. Recuperación del UMELISA T4 Muestras Valor Esperado Valor Obtenido (nmol/l) (nmol/l) Recuperación (%) ,0 114, ,8 98, ,8 95,0 Se realizaron diluciones seriadas a muestras de pacientes con altos niveles de T4, mostrándose paralelas a la curva estándar. Las concentraciones calculadas después de la corrección con el factor de dilución fue de ± 10 % de la concentración original de la muestra pura
10 10 Paralelismo del UMELISA T4 Conc. estimada x factor de dilución (nmol/l) Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Muestra :8 1:4 1:2 1 Dilución de la muestra 3.- DETECTABILIDAD. La detectabilidad del UMELISA T4 es de 14 nmol/l. Se definió como la concentración calculada para la fluorescencia equivalente al Suero Estándar R2a - 2 D.E. 4.- ESPECIFICIDAD. Se evaluó la reactividad cruzada con otras sustancias relacionadas estructuralmente, en las condiciones normales del ensayo (L)-T4 100 % (D)-T4 26 % (L)-T3 1,2 % (D)-T3 1,9 % (L)-T2 < 0,08 % Ácido Tri-iodopropiónico 2,9 %
11 11 BIBLIOGRAFÍA 1.- Evered D.C. et al: Diseases of the thyrroid gland. Clinics in Endocrinology and Metabolism, vol 3, Jefferys P.M. et al: Thyroid-function tests in the elderly. Lancet, vol 2, Leslie J. degroot et al: Admission screening by thyroid function tests in an acute general care teaching hospital. The American Journal of Medicine, vol 93, Anthony B. et al: Clinical significance of mildly elevated thyrotropin levels with normal thyroxin levels. Southern Medical Journal, vol 82, No 6, González, R.R., Robaina, R., Rodriguez, M.E., Blanca, S.: An enzyme immunoassay for oftermining thyroxine in human serum using an ultramicroanalytical system. Clinical Chemistry Acta. 197: 59, Noviembre 10, 2004 UMELISA T4 Código UM Centro de Inmunoensayo. Calle 134 y Ave. 25, Apdo. Postal 6653, La Habana, CUBA. Teléfono: , Fax: (537)
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