Alimentación funcional

Transcripción

1 APLICACIONES A LA SALUD HUMANA Alimentación funcional un alimento puede considerarse funcional si se demuestra satisfactoriamente que, además de sus efectos nutritivos, afecta beneficiosamente a una o más funciones del organismo de modo que mejora el estado de salud o bienestar o reduce el riesgo de enfermedad

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3 Ingredientes funcionales de naturaleza proteica

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5 TABLA: Productos farmacéuticos aplicados a la salud humana y que provienen de organismos genéticamente modificados Sistema de producción Indicación terapeutica Factor VIII Cultivo de células de mamífero Hemofilia A Factor IX Cultivo de células de mamífero Hemofilia B Factor VIIa Cultivo de células de mamífero Ciertas formas de hemofilia Activador del plasminógeno tisular Cultivo de células de mamífero Infarto de miocardio Activador del plasminógeno tisular E. coli Infarto de miocardio Hirudina Levaduras Trombocitopenia y prevención de trombosis Producto Factores de coagulación Anticoagulantes

6 Hormonas Insulina Levaduras Diabetes mellitus E. coli Hormona de crecimiento E. coli Deficiencia de la hormona en niños, acromegalia, síndrome de Turner Folículo-estimulante Cultivo de células de mamífero Infertilidad, anovulación y superovulación Paratiróidea E. coli Osteoporosis Gonadotrofina coriónica Cultivo de células de mamífero Reproducción asistida Tirotrofina Cultivo de células de mamífero Detección /tratamiento de cáncer de tiroides Luteinizante Cultivo de células de mamífero Ciertas formas de infertilidad Calcitonina E. coli Enfermedad de Paget Glucagon Levaduras Hipoglucemia

7 Anticuerpos monoclonales recombinantes Fuente: Nature Biotechnology, 2003, vol. 21 Nº8 Anti-IgE (recombinante) Cultivo de células de mamífero Asma Anti-TNF (recombinante) Cultivo de células de mamífero Arthritis reumatoidea Anti-IL2 Cultivo de células de mamífero Prevención del rechazo agudo de transplante de riñón Proteína morfogénica del hueso-2 Cultivo de células de mamífero Fractura de tibia Galactosidasa Cultivo de células de mamífero Enfermedad de Fabry (deficiencia en alfa-galactosidasa) Iaronidasa Cultivo de células de mamífero Mucopolisacaridosis Proteína C Cultivo de células de mamífero Sepsis severa Beta-glucocerebrosidasa E. coli Enfermedad de Gaucher DNAsa Cultivo de células de mamífero Fibrosis quística Otros productos recombinantes

8 Factores hematopoyéticos Eritropoyetina (EPO) Cultivo de células de mamífero Anemia Factor estimulante de colonias de granulocitos/macrófagos (GM-CSF) E. coli Netropenia, transplante autólogo de médula Interferón alfa (IFN alfa) E. coli Hepatitis B y C, distintos tipos de cáncer Interferón beta (IFN beta) Cultivo de células de mamífero Esclerosis múltiple Interferón gamma (IFN gamma 1b) E. coli Enfermedad granulomatosa crónica Interleuquina 2 (IL-2) E. coli Cáncer de riñón Interferón e interleuquinas Vacunas Anti-hepatitis B Levaduras Inmunización contra la hepatitis B Anti-hepatitis A Levaduras Inmunización contra la hepatitis A Anti-enfermedad de Lyme E. coli Inmunización contra la enfermedad de Fuente: Nature Biotechnology, 2003, vol. 21 Lyme

9 VACUNAS origen siglo XVIII, exposición voluntaria a agente infeccioso era beneficiosa. Generaba Protección a reinfección Inmunidad: respuesta del sistema inmunológico memoria inmunológica Edward Jenner (médico británico) inventó en 1796 la primera vacuna contra la viruela. El experimento consistió en inyectar a un niño de 8 años la vacuna procedente de una pústula del brazo de una ordeñadora (contagiada x VACA) a través de dos cortes superficiales en el brazo, consiguiendo inmunizar al niño ante la viruela humana.

10 Cronograma de aparición de las principales vacunas de uso humano: : Vacunación contra la viruela : Vacuna contra la rabia : Toxoide diftérico, Toxoide tetánico y tos combulsa : Vacuna contra la fiebre amarilla : Vacuna contra influenza : Vacuna inactivada contra virus de la polio : Vacuna viva atenuada contra virus de la polio : Vacuna contra el sarampión : Vacuna contra la rubeóla : Vacuna contra hepatitis B : Viruela erradicada : Primera vacuna recombinante (hepatitis B) : Vacuna conjugada contra H. influenzae B

11 Inmunogénica: molécula capaz de despertar una respuesta en el sistema inmune y producir memoria inmunológica Inmunización: procedimiento para generar inmunidad Antígeno: molécula Inmunogénica, se aisla del agente patógeno identificar antígenos responsables y eliminar componentes patogénicos Objetivo: PREVENCIÓN

12 Que tipos de vacunas existen?

13 Clasificación de las vacunas: Preparados de antígenos que introducidos en el organismos son capaces de estimular el sistema inmunitario e inducir una respuesta protectora Atenuadas : Utilizan microorganismos relacionados a los patógenos pero modificados para que no puedan generar la enfermedad. Inactivadas: Utilizan los microorganismos patógenos pero muertos. Subunidades: No utilizan los microorganismos patógenos sino que sólo alguno de sus componentes. Recombinantes: Se utiliza la manipulación genética para producir alguno de los componentes del patógeno en un organismo inofensivo. ADN: El gen que codifica para el antígeno es introducido en el organismo a ser vacunado y él mismo produce el antígeno a partir de ese gen

14 Respuesta inmune en la vacunación contra polio

15 Clasificación de Vacunas, Criterios Microbiológicos: VACUNAS Atenuadas o Vivas: Microorganismos vivos que multiplican con reducida patogenicidad (infección leve, BCG, fiebre tifoidea oral, colérica oral) VACUNAS Inactivas o Muertas: Microorganismos enteros muertos no multiplican tratados por medios físicos o químicos para eliminar su infectividad, manteniendo su capacidad inmunogénica pertussis, fiebre tifoidea parenteral CONSTITUIDAS POR ANTÍGENOS PURIFICADOS TOXOIDES: toxinas inactivadas (tetánica, difterica) POLISACARIDOS DE LA CAPSULA (neumococo) POLISACARIDOS CAPSULARES CONJUGADOS CON PROTEÍNAS ANTIGÉNICAS (meningococo, neumococo) FRACCIONES BACTERIANAS (tos ferina)

16 Los nuevos procedimientos de fermentación y purificación que han permitido la producción de vacunas a base de subunidades purificadas como son, entre otras, las vacunas de: Pertusis acelular, subcomponentes proteicos purificados, Salmonella typhi, polisacárido capsular Vi, N. meningitidis grupos A y C, polisacáridos capsulares, Streptococcus pneumoniae (23-valente), polisacáridos capsulares, Haemophilus influenzae tipo b conjugada, N. meningitidis grupos A y C conjugadas

17 Vacunas antitifoideas (Salmonella typhi y S. paratyphi) provocan cuadros sépticos

18 Yersinia pestis vector de la peste bubónica : la pulga Pulex irritans células enteras inactivadas de Y. pestis (vacuna Greer) personas que por su trabajo están en contacto directo y continuado con roedores infectados como son biólogos

19 No hay signos propagación de la peste que mató a un científico en EE.UU

20 Monovalentes: una única especie un antigeno Polivalentes: única especie de distintos antígenos Combinadas: varias especies Doble bacteriana (dt): difteria + tétanos. Triple bacteriana celular y acelular (DTP/Pa): difteria + tétanos +pertussis. Cuádruple celular y acelular (DTP/Pa + Hib): difteria + tétanos + pertussis + Haemophilus influenzae b. Quíntuple celular y acelular (cuádruple + IPV): DTP/Pa + Hib + poliomelitis inactivada. Quíntuple celular (cuádruple + HB): DTP + Hib + hepatitis B.

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22 1. Investigación pre-clínica se prueban la pureza y su seguridad en animales 2. Estudios clínicos en humanos: Fase I: pequeño grupo de voluntarios que habitan fuera del área endémica. evalua la seguridad y potencia de la vacuna. Fase II: análisis de la respuesta inmune de los voluntarios. Fase III: son pruebas de campo, se realizan con comunidades que habitan en áreas endémicas. Seguimiento clínico de los individuos vacunados. 3. Período de licencia procedimientos legales y administrativos apartir de los resultados obtenidos en las etapas anteriores para la aprobación (licencia) y registro de la vacuna. 4. Relevamiento post-licencia evalua la vacuna durante algunos años. Se estudian los cambios en la incidencia de la enfermedad y en la transmisión y se registran los casos de reacciones indeseables. Sólo después de esta etapa se considera o no la inclusión de la vacuna en los planes de vacunación de la región.

23 Bondades de una vacuna ideal Precio competitivo. Inocuidad. Estabilidad física y genética. Posible inmunización simultánea contra múltiples componentes protectores de diversos patógenos. Protección de larga duración con 1 sola dosis VO. Inducción de inmunidad mucosal en máximo 2 semanas. Estimulación de respuesta inmune humoral y celular a nivel sistémico.

24 El papel de la biotecnología en el desarrollo de vacunas Problemas i) no todos los agentes infecciosos son fáciles de crecer en las condiciones normales de cultivo ii) el trabajar con los agentes infecciosos requiere de medidas de seguridad muy elevadas iii) no todas las enfermedades infecciosas son prevenibles por este tipo de vacunas; iv) los agentes infecciosos usados en la producción de la vacuna pueden estar insuficientemente atenuados o muertos y por lo tanto pueden introducir la virulencia a la vacuna; v) componentes tóxicos de los agentes pueden no estar completamente inactivados y mantener la toxicidad en la vacuna final

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26 El papel de la biotecnología en el desarrollo de vacunas Soluciones a) identificar genes de virulencia y por lo tanto facilitar su deleción en los agentes infecciosos creando clones avirulentos pero que mantienen su habilidad de estimular la respuesta inmune; b) crear sistemas vivos no-patogénicos que acarreen los determinantes antigénicos de un patógeno específico o de varios; c) para aquellos agentes de difícil crecimiento, se pueden aislar los genes de las proteínas que contienen los determinantes antigénicos críticos para la inmunidad y expresarlos en otro huésped de mas fácil crecimiento (bacteria)

27 VACUNAS COMERCIALIZADAS Las vacunas recombinantes de tipo I (subunidad) producto del gen expresado en bacteria, es cosechado, purificado y administrado como una vacuna Ej: lipoproteína superficie externa OspA de Borrelia burgdorferi para enfermedad de Lyme (fiebre recurrente) transmitida por la picadura de una garrapata Recombitek Lyme-Merial, LYMErix, de GlaxoSmithKline; ImuLyme, de Aventis Pasteur

28 Las vacunas recombinantes de tipo II (de gen deletado) vacunas con genes deletados asociados con la virulencia o patogenicidad de una bacteria patógeno; Ej: ensayos clínicos vacuna de cepas estables del agente del cólera (Vibrio cholerae).

29 Las vacunas recombinantes de tipo III (vectoriales) consisten de organismos no patogénicos o de gen deletado en el que se inserta un material genético específico de otro patógeno Ej: Salmonella, Mycobacterium La Salmonella viva entérica atenuada es útil como portadora de antígenos heterólogos para la vacunación, la eficacia de estas fue demostrada con experimentos de vacunación usando antígenos protectores de Lysteria Monocytogenes.

30 Cumplir normativa sobre ecotoxicidad (Directiva 2001/82/CE y 2001/18/EC -Annex II- ): Estudio de virulencia en situaciones de riesgo en diferentes especies (tanto diana como no diana). Estudio de posible transmisión horizontal y recombinación potencial del vector vacunal o de parte de él. Estudio de especificidad de especie diana. Estudio de la posible instalación en el ambiente. Método validado para poder distinguir entre vacuna y microorganismo salvaje, especialmente en situaciones de planes de control y erradicación de la enfermedad. Utilización de datos obtenidos de ensayos realizados con el mismo vector pero acompañado de otras secuencias.

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32 Lo que viene inyectado directamente en las células, in vivo, donde luego es traducido y expresado induciendo la respuesta inmune

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35 Gene-gun para Vacunas a ADN Inmunización transcutánea

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37 Existen riesgos asociados: Integración potencial del plásmido en el genoma de las células hospedadoras. Inducción potencial de anticuerpos contra ADN del plásmido inyectado. Problema de conformación no nativa de proteinas bacterianas en vacunas con ADN inoculadas en animales. Liberación accidental de las construcciones de ADN desnudo pueden favorecer transferencia horizontal de genes

38 Existen beneficios asociados: Efectivas en modelos animales sin necesidad de adyuvantes o sistemas de administración. Solo expresan genes que inducen inmunidad. Las produce el mismo animal, siguiendo las instrucciones del gen insertado en el plásmido de expresión. Menor dependencia de la cadena de frío que las vacunas con proteínas.

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42 VACUNAS COMESTIBLES Vacunas orales Vehículos: células enteras LAB o esporas Bacillus sobrevivir aparato gastrointestinal retención de 2 a 3 días Vehículo de baja inmunogenicidad Protección contra efecto propiedades adyuvantes mortal de toxina del tétanos con cepas produciendo Sistemas genéticos (Food-Grade) dosis más alta del antígeno No necesita aislamiento y purificación del vivas antígeno y con bacterias recombinantes de producción IgA Lactobacillus plantarum Infect 2001 Mar;69(3): administración fácil, evita usoimmun. agujas

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44 DIAGNOSTICO Enfermedades infecciosas: Técnicas basadas en ADN PCR, microarray No requiere aislar el patógeno

45 Evaluación de la transcripción en la escala genómica con microarrays de DNA que son placas de vidrio o membranas que contienen un mosaico ordenado del genoma entero como colección de oligonucleotidos (oligonucleotide microarrays) o productos de PCR de genes individuales (referidos comúnmente como microarrays del cdna).

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47 DIAGNOSTICO PHAGE TYPING Tipificación a nivel de especie de patógenos Salmonella y Staphylococcus aureus, Shiga toxin-producing E. coli, Listeria monocytogenes Formulaciones de bacterias lácticas en iniciadores o straters para industria lactea y ensilados

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49 Diagnóstico

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51 APLICACIONES Fagos en biocontrol: Ventajas del empleo Historia segura: distribuidos en la naturaleza en múltiples ecosistemas Comensales naturales de humanos y animales Extensamente usados clínicamente en Europa oriental Genética simple: versátiles Altamente activos y específicos: No presentan efectos secundarios en la microbiota intestinal. Inocuos para células de mamíferos. Autoreplicativos. Activos contra biofilms. Herramientas útiles para biopreservación y phage therapy Fuente de potentes antimicrobianos: Endolisisnas y otras enzimas que hidrolizan Peptidoglicano Phage Therapy (bacteriófagos) (i) Efectivo contra multidrug-resistant pathogenic bacteria; (ii) sustitución de la microflora normal no ocurre pues fago mata solo su blanco específico (iii) Menores costos de desarrollo y producción (iv) Sin efectos secundarios

52 En Agosto 2006, la Food and Drug Administration (FDA) aprobo el uso de fagos para el tratamiento de ready-to-eat meat: una combinación de seis viruses diseñados como spray para erradicar cepas de Listeria monocytogenes

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55 DIAGNOSTICO Biosensores dispositivo de análisis que utiliza un ser vivo o un producto derivado de éste modificar específicamente una sustancia contenida en una mezcla aparición de color o fluorescencia, luz, generación de calor o por producción de algún compuesto fácil de analizar

56 Biosensor glucosa para diabéticos basado en glucosa oxidasa (hongos) membrana selectiva señal electrónica que puede ser procesada por el detector.

57 Ensayos para detectar presencia de contaminantes

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59 Ensayos para detectar presencia de contaminantes Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) Control con Naftaleno Control con Naftaleno

60 Monitoreo con Bacterias sustancias genotóxicas son mutágenos, correlación positiva entre agentes genotóxicos y carcinogénicos Mutaciones (daño a DNA) fácil detección (cambio en requerimiento nutricional, activación transcripcional) Detección de sustancias genotóxicas Biosensores de toxicidad aguda y presencia de contaminantes Ventajas Empleo de Bacterias: ensayos a corto plazo, ciclos de vida cortos fácil mantenimiento con bajo costo económico cada ensayo expone un número grande de células poblaciones muy homogéneas Desventajas: problema de la extrapolación de los resultados a eucarióticos pluricelulares. Aplicación: No deben ser empleados de forma aislada, sino varios conjuntamente, evaluación más fiable de la capacidad tóxica de compuestos o muestras ambientales.

61 Ensayos para detectar toxicidad aguda Ensayos basados en la reducción de la intensidad luminosa: El principal ensayo de este tipo es el ensayo Microtox Sustancia tóxica que reduzca respiración producirá un decremento de la luminiscencia. Porcentaje de perdida de intensidad luminosa respecto al control indica grado de toxicidad. Base de datos de valores Microtox EC50 (en mg/l) Vibrio fischeri NRRL B "The Use of Luminescent Bacteria for Determining Toxicity in Aquatic Environments"

62 Ensayos para detectar toxicidad aguda Ensayos basados en la inhibición del crecimiento y de la viabilidad de las bacterias. Criterios de determinación de un efecto tóxico son variados: El más empleado es la inhibición del crecimiento bacteriano que se puede valorar mediante técnicas de recuento en placa [Liu, Tox. Assess., 2: 463 (1987)] La medida de la turbidez de un cultivo [Dutka y Kwan, Environ. Pollut. Ser A, 29: 125 (1982)]. También son muy empleados los ensayos respirométricos basados en la determinación del consumo de oxígeno por parte de un cultivo bacteriano o en la reducción de colorantes de tetrazolio asociada a la cadena respiratoria microbiana [Pérez-García y cols., Bull. Environ. Contam. Toxicol., 50: 703 (1993)]..

63 Ensayos para detectar toxicidad aguda

64 REVERTANTES

65 Ensayos bacterianos para la detección de sustancias genotóxicas Ensayos de reversión o retromutación Test de Ames Salmonella typhimurium auxotrofas para histidina son expuestas a sustancias mutagénicas, se producirá una reversión a la prototrofia de las mismas, que puede ser evaluada mediante recuento en un medio mínimo deficiente en histidina. Con un mutágeno químico la tasa de reversión a His + estará altamente aumentada. Número limitado de divisiones celulares, necesario para la mutagénesis. Dado que la reversión es desde la mutación a la prototrofía que presenta un fenotipo fácilmente observable por crecimiento en medio mínimo, es posible distinguir los revertantes directamente sin necesidad de realizar un rastreo de mutaciones por replica plating. Resultados en 48hs [Maron y Ames, Mutat. Res., 113, 173 (1983)].

66 his His- no sintetiza histidina, ΔuvrB UvrB- no posee sistema de excisión-reparación de ADN, Δbio Bio- requiere biotina, rfa LPS- perdida de lipopolisacarido y aumento permeabilidad, factor R (pkm101) porta muca,mucb Tipos de mutaciones: transiciones/transversiones (crosslinking Mitomicina C); cambio marco lectura (intercalantes Acridina, Bromuro Etidio); sustitución de par de bases (alquilantes o analogos de base)

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69 Dos variantes del método son posibles. 1) Una versión simple es el Spot Test para reversiones que sirve como método previo de rastreo de potenciales mutágenos. Un resultado positivo en el spot test requerirá un análisis más profundo con la determinación de curvas de dosis-respuesta (concentración vs. revertantes) por el método de incorporación en placa.

70 El ensayo de incorporación en placa permite realizar pruebas a distintas concentraciones de compuesto que se encuentra incluido en el agar.

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72 Ensayos bacterianos para la detección de sustancias genotóxicas Test de Ames. Muchos compuestos químicos no son carcinogénicos (o mutagénicos) a menos que sean metabolizados a sustancias activas. En las personas o animales estas conversiones metabólicas a carcinógenos activos ocurren principalmente en el hígado. Es por eso, que para aumentar la conversión de potenciales mutágenos o carcinógenos químicos a sus formas activas, los agentes que se testan en el test de Ames son tratados con un homogenato de hígado de rata (fracción microsomal S9) antes de su adición al medio de cultivo

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74 Ensayos bacterianos para la detección de sustancias genotóxicas

75 Ensayos bacterianos para la detección de sustancias genotóxicas

76 Ensayos bacterianos para la detección de sustancias genotóxicas Ensayos de mutagenicidad basados en inducción transcripcional de gen reporter Ensayos de genotoxicidad basados en el sistema SOS de reparación de daños genéticos. La expresión de un gen del sistema SOS (dind, reca, sfi) puede ser medida directamente por medio de su fusión con el gen lacz, el gen estructural de la ß-galactosidasa en Escherichia coli. Mutaciones adicionales: uvra: no repara por excision y prolonga la respuesta SOS rfa: LPS defectivo aumenta permeabilidad de moléculas Resultados en 2 horas [Llagostera et al., Environ. Mutag. 8, 571 (1986)].

77 Sistema SOS RecA coproteolisis LexA-LexA Olex LexA ss DNA Olex RecA Olex UvrA Olex UmuDC OTROS GENES RecF RecBCD, Sfib, CI(λ ) RECOMBINACION

78 Ensayos bacterianos para la detección de sustancias genotóxicas Ensayo SOS Chromotest, las cepas de E. coli se mezclan con las sustancias a ensayar, determinándose tras un periodo de incubación de 2 horas los niveles de ßgalactosidasa. Enzima se mide con sustrato cromogénico Color amarillo Abs 420 nm sustancias son genotóxicas ocasionan un aumento en los niveles de ß-galactosidasa respecto a los controles, pues se inducen los genes de mecanismo SOS

79 Ensayos bacterianos para la detección de sustancias genotóxicas Ensayos de mutagenicidad basados en inducción transcripcional de gen reporter Ensayos de genotoxicidad basados en el sistema SOS de reparación de daños genéticos. La expresión de un gen del sistema SOS (reca, uvra) puede ser medida directamente por medio de su fusión con luxcdabe, operon de la luciferasa bacteriana. Mutaciones adicionales: uvrb: no repara por excision y prolonga la respuesta SOS rfa: LPS defectivo aumenta permeabilidad de moléculas tolc: previene efflux de químicos [Van Dyk et al., Appl Environ Microbiol. 60: (1994);63: (1997)].

80 Ensayos bacterianos para la detección de sustancias genotóxicas Ensayo Vitotox Salmonella typhimurium TA104 Ventaja respecto a Ames DNA entero es blanco del genotóxico en contraste con la mutación de un único gen del test original Ames (his). Resulta mucho más sensible (1000 veces) requiriendo concentraciones significativamente menores de tóxico para verificar respuesta