Tipificación VPH PCRtr Resultados en medio privado

Tipificación VPH PCRtr Resultados en medio privado Dr. José de J. Curiel Valdés Anatomopatólogo Patólogo Clínico Colposcopista Academia Mexicana de Cirugía

Evolución en la detección del Cáncer de Cérvix Meisels and Fortin 1976 Purola and Savia 1977 Coilocito / Efecto citopatico HPV Dürst et al. 1983 Revisión de las pautas de screening VHP 99,7% Cánceres de Cérvix 1 LBC: Citología líquida ThinPrep SurePath P16 CINTec Cervatec p16 ELISA L1Ag Cytoactiv ONCOTEC mrna E6/E7 Screening 1º basado en DNA HPV 1949 Test de Papanicolau Prevención Secundaria Prog. Base Poblacional Finlandia 1963-2008 PCR 1980 1 Walboomers et al., Journal of Pathology 189:12-19,1999 ( Modificado ) 1990s LBC 1996 1999 HC-2 / H Ventana Amplicor* Roche DNA Invader* WD 2000s 2003 2008 PREVENCION PRIMARIA ESCENARIO POSTVACUNAL

Cómo se si lo tengo? Cómo se diagnostica? 1.- Estudio de Papanicolaou citología cervical. FORMA TRADICIONAL 2.- Colposcopía 3.- Biopsia Estándar de 4.- Pruebas moleculares FORMA MODERNA MAS SEGURA BASE LIQUIDA

Citología Es el método de detección recomendado Se considera en NIC 1 poco sensible y específica. Solo es positiva por definición si existe una fase productiva. NIC 2 y 3 es mas sensible y específica. En base líquida sube la sensibilidad y especificidad. Es estándar para medir esta sensibilidad y especificidad ha sido la biopsia.

Colposcopía Indicada cuando existe una citología anormal Usada de rutina y en personas de 20 a 30 años es causa de sobre diagnóstico Imágenes en mosaico de diversos tipos, relieves, patrón de vasos etc. Algunos muy característicos. Siempre requiere de biopsia que lo corrobore.

Cómo se si lo tengo? Cómo se diagnostica? 2.- Colposcopía 3.- Biopsia Estándar de Oro (?) 4.- Pruebas moleculares NORMAL VIRUS

ALGUNAS IMÁGENES COLPOSCÓPICAS Y SU CORRELACIÓN HISTOLÓGICA Aceto Blanco Liso Mosaico Punteado Leucoplasia Fino Metaplasia Madura Metaplasia Inmadura Rara vez NIC Denso NIC Alto Grado Fino Metaplasia Madura con paraqueratosis Grueso NIC Alto Grado a Carcinoma Invasor Fino NIC I Grueso NIC II y III Metaplasia queratinizante Siempre ver que hay por debajo

Cómo se si lo tengo? Cómo se diagnostica? 1.- Estudio de 2.- Colposcopía VIRUS 3.- Biopsia Estándar de Oro (?) 4.- Pruebas mol NORMAL

P16 VS HISTOLOGÍA TODAS LESIONES ACETOBLANCAS N INFLAMATORIO/REACTIVO O SUGESTIVO DE VPH NIC 1 NIC2 NIC 3 CARCINOMA H.E 460 R /S 128 296 28 5 3 NEGATIVO 46.3 % POSITIVO 53.7 % DE + A +++ NUCLEAR O CITOPLASM P16 460 213 212 20 12 3 Curiel-Valdés Rev Mex de enf del Tr Gen inf 2008

ESTADÍSTICA ENTRE H.E. Y P16 Valor Predictivo positivo: VP(+) = 0.5650 Valor Predictivo Negativo: VP(-) = 0.5986 Sensibilidad: Se = 0.7540 Especificidad: Es = 0.3872 Curiel-Valdés Rev Mex de enf del Tr Gen inf 2008

CONCORDANCIA INTEROBSERVADOR EXPERTOS CONCORDANCIA INTEROBSERVADOR CON H.E Y P16 NORMAL L. No Dx NIC 1 NIC 2 NIC 3 CARCINOMA TOTAL CONCORDANCIA NORMAL 71% 3% 52% 35% 72% 94% 3800 71% P 16 94% * 91% 100% 99% 100% 96% NIC DE 40 A 97 % KLAES AM. J. SURG PATH. NOV 2002

PATOLOGOS MEXICANOS FRAG 1 NIC 1 100 % OBJETIVO POSITIVO FOCAL FRAG 2 NIC 2 Curiel-Valdés Rev Mex de G y obstet 2008 POSITIVO DIFUSO

No todo lo que parece es!!!

A quienes seleccionar 80-90% < 25 años ~20 % > 30 años 40-50% < 25 años ~20 % 30 años <10 % > 30 años UNIVERSO POSIBLE A ESTUDIAR

A quienes seleccionar PCR Y CH II P16 UNIVERSO CON ENFERMEDAD GRAVE NUESTRO OBJETIVO A ENCONTRAR

Debemos situar de manera segura a nuestra paciente en este esquema antes de cualquier tratamiento HS METAPLASIAS PORTADOR J.J.C.V.

Espectros molecular y visible para diagnóstico de VPH

META DETECTAR LAS INFECCIONES PERSISTENTES PREDOMINATEMENTE POR VIRUS DE ALTO RIESGO DEFINICIÓN DE ALTO RIESGO POR BIOLOGÍA MOLECULAR Y DATOS EPIDEMIOLÓGICOS. CASOS CON Dx HISTOLÓGICO DE CÁNCER Y NIC

METODOS MOLECULARES PCR CH2 OTROS Inmunohistoquímica: P16 L 1 DE Cápsula otros

INFECCION POR VPH DOS MODALIDADES TRES ETAPAS PRODUCTIVA: L1 Y L2 TRANSFORMANTE: E6 (P53) Y E7 (grb) (ONCOGÉNICA) AMBAS EN TRES ETAPAS CLÍNICAS PORTADOR SANO INFECCIÓN SUBCLÍNICA INFECCIÓN CLÍNICA

Donde está el Patólogo en el diagnóstico del VPH Detección Como riesgo Enfermedad Diagnóstico y Capacidad de progresión Patólogo Detección a confirmación Clínico Ginecólogo Colposcopista Colposcopía y Toma de muestras Anatomopatólogo Citopatólogo Interpretación y diagnóstico Estudio citológico Sensibilidad mediana Especificidad alta Colposcopía Sensibilidad alta Especificidad baja Biopsia Sensibilidad alta Especificidad mediana a alta

Para que se usan las pruebas moleculares EPIDEMIOLOGIA DETECCION: Presencia de VPH como método primario de tamizaje antes de citología CONFIRMACION DE DX? SEGUIMIENTO DESPUÉS DE TRATAMIENTO CURIOSIDAD (POSITIVO EN LA PAREJA) USO EN HOMBRES (?) EN TEJIDOS FRESCO Y PARAFINA Involucrados: Biólogos moleculares Anatomopatólogos Patólogos Clínicos, Químicos

EVOLUCIÓN DE VIRUS PRESENTE A VIRUS TRANSFORMANTE

HPV Prevalence and Cervical Cancer Incidence by Age 30 30 HPV Prevalence (%) 25 20 15 10 5 0 15-19 20-24 HPV (HC2) 25-29 30-34 35-39 40-44 45-49 50-54 Cancer 55-59 60-65 25 20 15 10 5 0 Cancer incidence per 100,000 Age (Years) 1. Sellors JW, et al. CMAJ, 2000;163:503. Ries, et al. 2000 SEER Cancer Stats NCI, 1973-1997. Sellors JW, et al. CMAJ, 2002;167:871.

Porque? Involucionan o evolucionan

Ciclo viral productivo y transformante

PCR secuencial o de punto final Replicación, y electroforesis con comparación de un codigo de barras contra controles ya establecidos. No es absoluta la comparación, similitud de un % decreciente 95 % virus de alto riesgo 89 % virus de bajo riesgo 70 Virus de alto riesgo.

Los tipos pueden variar dentro de los grupos ya que se parecen molecularmente

PCR de punto final Indicaciones de uso Como un método de Dx epidemiológico. Detecta desde portadores y enfermedad transitoria hasta enfermos No distingue fase productiva o transformante Selecciona a quienes vigilar de los 30 años en adelante.

Detección del VPH mediante amplificación de la señal. Tecnología de captura de híbridos (HC2) Hibridación ADN/ARN. Cóctel de sondas: - Alto riesgo: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68. - Bajo riesgo: 6, 11, 42, 43 y 44. Sensibilidad adecuada a procesos de tamizaje de VPH (1 pg/ml). Aprobado por la FDA. Posibilidad de semicuantificar. Estandarizada y automatizable. (Poljak et al. J Clin Virol 2002; 25: S89-97.)

CAPTURA DE HIBRIDOS TRADUCCION CLINICA Al ser menos sensible a través de estudio se ha comprobado que detecta a los mas capaces de inducir neoplasia. Factor pronóstico de progresión. Aprobado por FDA Posteriormente su fuerza especificidad de no LAG o CaCu

CAPTURA DE HIBRIDOS TRADUCCION CLINICA Una prueba negativa de CH2 no significa que no se tenga virus El método ha sido estandarizado de manera que las unidades relativas de luz detectadas se compararon con la evolución a Ca Cu Se requiere un número relativamente elevado de copias para que sea oncogénico Por ello es que se requiere realizar la prueba cada 3 años

PRC en tiempo real El mismo método para subir la temperatura y desdoblar la cadena de DNA Ciclos con temperatura controlada con sustratos que emiten luz Medida a diferentes temperatura y diferentes colores para los tipos específicos de virus El proceso dura unas horas y se realiza en una termociclador programado que lee EN TIEMPO INMEDIATO (REAL) la progresión de la replicación viral.

PRC en tiempo real Ventajas sobre PCR de punto final Detección segura del tipo viral: la lectura de la electroforesis es dependiente de la calidad de la electroforesis, en PCR TR esta dada por la temperatura de unión y el color en cada ciclo Detección de enfermedades mixtas (varios tipos virales) PCR de punto final el tipo que predomina inhibe a los otros y no se detectan. Tiempo de proceso: el mismo día (se requieren cuando menos 16 muestras por corrida) PCR tradicional mínimo 10 días Costo: es semejante

CH2 y PCR tiempo real FUTURO Método de tamizaje Es mas senisble que el estudio citológico (pero es mas caro) Si se realiza de manera simultánea obliga a revisar la citología de manera mas minuciosa, evita falsos negativos sobre todo el LAG Detecta mas mujeres en riesgo sin enfermedad (CCV detecta solo las que tienen enfermedad)

En ASC US o H en México Es preferible hacer colposcopía y tomar biopsia. La Positividad de PCR, CH2 no indica necesariamente NIC, puede ser metaplasia atípica o inmadura con virus en reposo. En EU la colposcopía y la biopsia son mucho mas caras que una prueba de PCR o CH2. Si sale positiva en EU ya se manda a Colposcopía y biopsia.

PCR tr REPORTE

Detalles de informe

Controles detalles

Reporte gráfica PCRtr permite la cuantificación de los virus y ello permite hacer una homología con CH2 ya que esta no significa que en realidad no se tenga VPH

Ejemplos de infección mixta

Ejemplos de infección mixta

Ejemplos de infección mixta

Detección de tipo viral en medio privado D.F. 2.5 años Se realizaron 1234 estudios de PCRtr para determinar la presencia y en su caso, el genotipo de VPH 3 años (2013-2015) en pacientes atendidos en nuestra clínica de patología. En el 98% de las determinaciones se realizaron en mujeres (cervicales), el resto en hombres (no cervicales). El promedio de la edad global fue de 33.74+9.39 años, con un rango de los 11 a los 83 años de edad. La edad en relación al sexo no fue diferente (p>0.05), sin embargo, la edad de los hombres fue 3 años mayor a la edad de las mujeres (36.9+11.91 vs 33.5+9.0). El 36.2% de las muestras realizadas pertenecían a personas menores de 30 años

Estudio estadístico Se determinó media y desviación estándar, frecuencias y porcentajes. Se aplicaron las pruebas de Kolmogorov-Smirnov, T de Student, ANOVA y Chi cuadrada. Se calcularon los parámetros de prueba diagnóstica con un intervalo de confianza del 95%. El análisis se realizó con el programa SPSSv19 y con el programa Epidat3.1. Se tomó como significancia estadística un valor de p<0.05. Dra. Cindy Bandala INReahabilitacion

Resultados

PCR en relación al sexo

40 35 30 25 20 15 10 5 0 11 a 25 años 26 a 33 34 a 43 44 a 53 54 a 83 Positivos Negativos Columna1

PCR y citología * * Otros virus no comprendidos en los 28 de la prueba

PCR y Biopsia * Otros virus no comprendidos en los 28 de la prueba

Sensibilidad y especificidad de PCRtr

Los genotipos de AR se asociaron a la Citología positiva (P=0.0001) Los genotipos de bajo riesgo están asociados tanto a Citología como a la Biopsia positiva (P=0.0001) En relación a sexo, (mujer) (p=0.0001) No hubo validez estadística con la edad (p=0.035)

PCR de punto final dos etapas 1994 a 2004 2013

PCR punto final o secuencia 2013 174 casos Población con E anormal Positivos AR 76 43.6% 16 27 15.5 % 18 12 6.9% 31 7 4.0% 16 y 18 5 2.9% Positivos BR 24 6 7 29% 11 5 20.8% 37 4 16.7%

Seguimiento y correlación con la pareja Pareja con PCRtr correlación 80% Pareja con PCR tradicional 20% En relación a persistencia: Con PCR tradicional se optó por inicial tipificar y después con CH2. Había cambios de tipo viral frecuente Con PCRtr en infecciones múltiples se aprecia eliminación de varios y se conservan algunos o es negativo en su totalidad.

Caso clínico 1 Mujer de 40 años de edad con estudio citológico anormal, LAG Colposcopía normal, UEC en el orificio muy pequeño PCRtr positiva VPH 16 y 31 Cono diagnóstico

Cono diagnóstico

Conclusión PCR RT es una metodología que se está usando en forma alterna y mas segura que CH2 y PCR de punto final 1.- Detecta infecciones múltiples 2.- El tipo viral detectados en el mas real 3.- Mismo costo 4.- Menos tiempo de proceso 5.- En ETS es mas segura y con un costo similar a los dos cultivos.