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- Jaime Chávez Romero
- hace 8 años
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1 ESCLEROSIS MULTIPLE BANDAS OLIGOCLONALES EN LCR Bioq. María Josefina Boero Hospital Italiano de Buenos Aires
2 Esclerosis Múltiple Es una enfermedad inflamatoria, desmielinizante, neurodegenerativa de curso crónico del SNC
3 INFLAMACIÓN DESMIELINIZACION GLIOSIS
4 DOCTOR, CUÁL ES LA CAUSA DE LA EM?
5 Esclerosis Múltiple (EM) Se piensa en un mecanismo autoinmune: Debido a la destrucción selectiva de la capa de mielina y de las fibras nerviosas, y secundariamente un daño neuronal progresivo Se caracteriza por la ocurrencia sucesiva de focos de desmielinización diseminados en tiempo y espacio en varias áreas del SNC, incluidos la región periventricular, la médula espinal, el tronco encefálico, el cerebro y el nervio óptico.
6 EM: Epidemiología La enfermedad suele comenzar entre los 20 y 40 años, con un pico máximo a los 30 años Es más frecuente en mujeres (2:1) y en caucásicos No se conoce las razones de la variación de prevalencia en el mundo, pero piensan que los factores genéticos y ambientales podrían ser la causa
7 EM: Distribución mundial The New England Journal of Medicine 2000;938:952-Vol. 343-Núm 13.
8 En el Mundo. La prevalencia más alta de la enfermedad (30 /100000) se encuentra en el norte de Europa, sur de Australia y centro de Norte América. En Argentina. Argentina es un país con una prevalencia de 18/100000, lo que significa que hay casos. Con 2.24 nuevos casos /año.
9 EM: Factores de riesgo Factor genético Se asocia a pacientes que presentan ciertos antígenos del complejo mayor de histocompatibilidad HLA-DR2 Factor ambientales En estos individuos la exposición a ciertos factores (infecciones virales, polisacáridos bacterianos, súper antígenos, toxinas) resultarían en la activación y proliferación del sistema inmune.
10 Fisiopatología
11 EM: Fisiopatología
12 EM: Fisiopatología Factores genéticos y ambientales 1 2 Factores locales: infección viral, stress metabólico MBP, MOG, glicoproteína asociada a mielina, proteína proteolipídica,β- cristalina, fosfodiesterasas y S Citoquinas proinflamatorias pueden aumentar la expresión de moléculas en la superficie de LT y CPA Up-regulation Down-regulation Injuria mediada por células 6 Injuria inmunológica mediada por Ac y activación del complemento Injuria mediada por citoquinas Digestión de Ag de superficie de mielina por macrófagos 5 Resolución de la rta inflamatoria Remielinización espontanea Propagación de los canales de Na de los nódulos de Ranvier Injuria directa de oligodendrocitos por CD8+ y CD4+ Axones desnudos The New England Journal of Medicine 2000;938:952-Vol. 343-Núm 13.
13 EM: Fisiopatología En algunas lesiones la presencia de inmunoglobulinas y activación del complemento sugieren que los Ac tienen un rol en el desarrollo de la lesión. Se observa una distrofia primaria de los oligodendrocitos. Finalmente, en otras lesiones un borde de oligodendrocitos necróticos se ven adyacentes al borde de la placa activa.
14 EM: Fisiopatología El marco patológico de la enfermedad es la PLACA DESMIELINIZADA La placa es una zona bien demarcada caracterizada por la pérdida de mielina, con preservación del axón y formación de cicatrices astrociticas. La injuria irreversible axonal y la escasa población de oligodendrocitos progenitores resulta en la pérdida progresiva de la función neurológica. The New England Journal of Medicine 2000;938:952-Vol. 343-Núm 13.
15 Manifestaciones clínicas Debilidad de las extremidades Pérdida de fuerza Fatiga Descoordinación en los movimientos Espasticidad Neuritis óptica Disminución de la agudeza visual Visión borrosa Síntomas sensitivos Parestesias Hiperestesia Alteraciones cognitivas Pérdida de memoria a corto plazo, depresión Falta de atención Dificultad para resolver problemas Lentificación del procesamiento de la información Alteración del juicio Labilidad emocional Otros síntomas Disfagia Disartria Disnea Espasticidad Disfunción sexual Estreñimiento
16 EM: Patrones clínicos EM RECURRENTE-REMITENTE: 85% Discapacidad EM SECUNDARIAMENTE PROGRESIVA: 50% EM PRIMARIAMENTE PROGRESIVA: 10% EM PROGRESIVA RECURRENTE: 5% Tiempo
17 Diagnóstico
18 EM: Diagnóstico Nuevos criterios para el diagnóstico de EM se han publicado como resultado de la formación de un comité internacional Objetivo: simplificar la clasificación y acortar el intervalo entre presentación y diagnóstico Se requiere la presencia de hallazgos clínicos y paraclínicos ( RMN, potenciales evocados y análisis del LCR) Arch Neurol. 2005;62:
19 EM: Diagnóstico La RMN es sensible pero no específica para el diagnóstico de EM una cantidad de otras enfermedades pueden mimetizar con EM, ya sea clínicamente como a través de neuroimágenes. Los Potenciales evocados no son específicos, ya que las anomalías en las respuestas provocadas ocurren en un gran número de enfermedades neurológicas que tienen alteradas las vías que se estudian (vías visuales, auditivas, somato sensitivas o motoras). Los estudios en LCR tienen la ventaja de una mayor especificidad puesto que en población normal, no es frecuente hallar anormalidades de las inmunoglobulinas en este líquido biológico.
20 Diagnóstico Diferencial de EM INFECCIOSAS AUTOINMUNES VASCULARES NEOPLASIAS DEGENERATIVAS ENDOCRINAS/METABÓLICAS GENÉTICAS Enfermedad de lyme Sífilis meningovascular Mielopatías por HIV o HTLV-1 LES Sjögren Sarcoidosis Wegener Malformaciones vasculares de la espina dorsal Vasculitis primaria Linfomas o gliomas Tumores de la espina dorsal Síndrome paraneoplásicos Ataxia espinocerebelar Hipotiroidismo Deficiencia de vit. E o B12 Leuecodistrofia metacromática
21 Laboratorio
22 Estudio del LCR: Proteínas Las proteínas totales en LCR es el indicador más sensible de patología en el SNC El rango normal de proteínas es de mg/dl. Niños y añosos pueden tener rangos mayores Muchas enfermedades pueden aumentar la permeabilidad de la BHE llevando a un aumento de las proteínas Arch Neurol. 2005;62:
23 Estas enfermedades incluyen: Bacterianas, virales y otras formas de meningitis Infiltración neoplásica de meninges Tumores cerebrales y espinales Polineuropatías Hernia de disco Infarto cerebral, hemorragias
24 Estudio del LCR: Proteínas La albúmina, al no ser sintetizada en el SNC, sirve como un indicador de referencia para monitorear permeabilidad. La concentración de IgG debe tomar en consideración el estado de la barrera, para poder distinguir entre aumentos por síntesis intratecal y pasaje de proteínas plasmáticas. Se recomienda el uso del cosciente Alb LCR/ Alb suero, en lugar de PT, para evaluar disfunción de la BHE. Arch Neurol. 2005;62:
25 EM: Estudio del LCR Aspecto: Cristal de roca Leucocitos: normales ( Pleocitosis leve con predominio linfocitario) Glucosa: Normal Proteínas totales: Normal o liger. aumentado IgG LCR/IgG suero: elevada en el 90% de los casos La respuesta inmune humoral a los antígenos de mielina se refleja en un aumento de la concentración de IgG y la síntesis de bandas oligoclonales(bo)
26 EM: Bandas oligoclonales (BOC) en LCR Presencia de BOC en LCR y no en suero, indica síntesis intratecal de IgG No es exclusiva de la EM sino que también puede estar presente en enfermedades infecciosas o inflamatorias del SNC Existen fórmulas matemáticas para intentar cuantificar la producción intratecal de IgG. El consenso establece que la prueba cualitativa esencial es el IEF seguido de inmunofijación, y que no es equivalente a ningún dato cuantitativo utilizado
27 Condiciones que presentan BOC (+) en LCR: Enfermedad Incidencia de BOC % Pruebas sugeridas EM 98 RMN PESS 100 Acs anti-sarampión Neurosifilis 95 Acs anti-treponémica Neuro-SIDA 80 Acs anti-hiv Neuro-Lyme 80 Acs anti-borrelia Neuro-LES 50 Factor antinuclear Neuro-Behçet 20 C 3 PMN en LCR Ataxia-telangiectasia 60 IgA sérica Meningitis-uveítis de Harada 60 PCR sérica Adrenoleucodistrofia 100 Ácidos grasos de cadena larga Neuro-sarcoidosis < 5 Test de Kveim Encefalitis aguda (<7 días) <5 Acs antivirales Meningitis aguda (<7 días) <5 Lactato en LCR, PCR Neoplasias <5 TAC E. J. Thompsom, The National Hospital for Neurology y Nerusurgery Queen Square.
28 EM: Bandas oligoclonales (BOC) en LCR Presencia de BOC en LCR y no en suero, índica síntesis intratecal de IgG No es exclusiva de la EM sino que también puede estar presente en enfermedades infecciosas o inflamatorias del SNC Existen fórmulas matemáticas para intentar cuantificar la producción intratecal de IgG El consenso establece que la prueba cualitativa esencial es el IEF seguido de inmunofijación, y que no es equivalente a ningún dato cuantitativo utilizado
29 Estudio del LCR: Indice IgG IgG LCR/ IgG suero Alb LCR/ Alb suero El valor de este cosciente en un LCR normal es 0.5
30 EM: Bandas oligoclonales (BOC) en LCR Presencia de BOC en LCR y no en suero, índica síntesis intratecal de IgG No es exclusiva de la EM sino que también puede estar presente en enfermedades infecciosas o inflamatorias del SNC Existen fórmulas matemáticas para intentar cuantificar la producción intratecal de IgG El consenso establece que la prueba cualitativa esencial es el IEF seguido de inmunofijación, y que no es equivalente a ningún dato cuantitativo utilizado
31 EM: Toma de muestra Se deben extraer 3-5 ml de LCR Se debe tomar al mismo tiempo una muestra de sangre Conservación de la muestra: 1 semana: 2 a 8 C -20 C
32 EM: Isoelectroenfoque e Inmunofijación Las proteínas son separadas de acuerdo a su pi en un gradiente estable y continuo de ph La carga de superficie de la molécula (anfotérica) se mantiene cambiando de acuerdo a su curva de titulación, hasta alcanzar una posición de equilibrio a lo largo del gradiente de ph Esa posición de equilibrio la alcanza donde el ph es igual al pi de la molécula Es decir, que en IEF las proteínas son continuamente desaceleradas hacia una zona de equilibrio donde la carga neta es cero( ph=pi) Esta técnica requiere crear y mantener en el gel un gradiente continuo de ph, lo que se logra por el pasaje de la corriente eléctrica a través de una solución de compuestos anfotéricos, cuya característica principal es que tienen pi muy cercanos, abarcando un dado rango de ph
33 EM: Isoelectroenfoque e Inmunofijación Medir la concentración de IgG en suero y LCR por nefelometría. La concentración de IgG debe ser la misma en ambas NO se debe concentrar el LCR Se realiza la corrida en paralelo del suero y LCR en gel de agarosa para separar las proteínas Se realiza la inmunofijación con un antisuero anti-igg marcado con peroxidasa para detectar BOC de IgG
34 EM: Preparación de las muestras Concentración de IgG en LCR LCR SUERO > 20 mg/l Diluir para obtener una conc. de 20 mg/l de IgG Diluir para obtener una conc. de 20 mg/l de IgG mg/l Sin diluir Diluir para obtener una conc. de IgG identica a la del LCR < 10 mg/l Diluir para obtener una conc. de IgG identica a la del LCR Similares concentraciones de IgG para suero y LCR nos aseguran corridas óptimas
35 EM: Isoelectroenfoque e Inmunofijación Medir la concentración de IgG en suero y LCR por nefelometría. La concentración de IgG debe ser la misma en ambas NO se debe concentrar el LCR Se realiza la corrida en paralelo del suero y LCR en gel de agarosa para separar las proteínas Se realiza la inmunofijación con un antisuero anti-igg marcado con peroxidasa para detectar BOC de IgG
36 EM: Isoelectroenfoque Ventajas Es una técnica de equilibrio y por lo tanto los resultados no dependen del modo de aplicación o del tiempo de operación Se mide un parámetro intrínseco fisicoquímico de la proteína (pi) Permite la resolución excelente de proteínas que difieren en 0.02 unidades de ph en sus pi, que pueden ser excelentemente separadas en bandas muy finas debido al efecto de focalizado
37 EM: Isoelectroenfoque Limitaciones Sólo sustancias anfotéricas pueden ser separadas Los anfolitos y los péptidos son reactivos a los mismos colorantes, por ello se deben usar coloraciones específicas Péptidos cortos no focalizan ya que son isoeléctricos en casi todo el rango de ph(4-8)
38 IEF/PAGE Tinción con plata vs IEF/Inmunofijación Resultado PAGE/IEF con Tinción Ag IEF con Inmunofijación Positivo verdadero Falso positivo 12 2 Clin Chem 2000;48:1578
39 Sensibilidad y especificidad de IEF para EM Origen N total de pacientes N total de pacientes con EM Sensibilidad,% Kostulas et al McLean et al Ohman et al Especificidad % Beer et al Paolino et al La presencia de BOC está fuertemente Relacionada (>95%) con EM Clin Chem 2000;48:1578
40 Interpretación de IEF Patrón 1: Normal (no BO en LCR ni en suero) Patrón 2: Esclerosis Múltiple (si BO en LCR, no en suero) Patrón 3: Enfermedad sistémica (algunas bandas en LCR y adicionales en concordancia con suero) Patrón 4: Inflamación sistémica (patrón de bandas idéntico en LCR y suero) Patrón 5: Gammopatía monoclonal (patrón monoclonal en espejo en LCR y suero)
41 Interpretación de IEF 5 PATRONES Normal IgG síntesis local IgG síntesis local Síntesis no local Síntesis no local Banda monoclonal splitted en varias bandas en IEF
42 Interpretación de una única banda en LCR La presencia de una banda solitaria en LCR debe ser interpretada en conjunto con hallazgos clínicos y en suero. Su presencia está asociada a linfoma, pero también es observada en sujetos normales y no excluyen el diagnóstico de EM. En series de pacientes seguidos por 6 años las dos terceras partes de los pacientes revertían el patrón, pero aproximadamente 1/3 desarrollaban una respuesta intratecal con diagnóstico de EM o síndromes desmielinizantes. Sin embargo, en la mayoría de los series la banda única es poco común.
43 Ejemplos de los perfiles Patrón 1
44 Ejemplos de los perfiles Patron 2 Síntesis local EM
45 Ejemplos de los perfiles Patron 3 Síntesis sistémica+local Patrón «mayor que» Monoclonal componente bandas adicionales bandas adicionales
46 Ejemplos de los perfiles Patron 4 Bandas Idénticas «En espejo»
47 Ejemplos de los perfiles PATRON 5 Bandas Monoclonales
48 SUERO LCR
49 HYDRAGEL 9 ISOFOCUSING sebia LCR SUERO CN CP
50 SUERO LCR
51 CONTROL DE CALIDAD Control externo Hay controles externos de calidad (CAP) Control interno Se utilizan como controles internos de calidad, las muestras mandadas por el CAP, también pueden ser usadas muestras de pacientes validadas clínicamente por un médico
52
53 CONTROL DE CALIDAD Control externo Hay controles externos de calidad (CAP) Control interno Se utilizan como controles internos de calidad, las muestras mandadas por el CAP, también pueden ser usadas muestras de pacientes validadas clínicamente por un médico
54 Conclusión
55 Nuevos Criterios diagnósticos para Esclerosis Múltiple 1- El análisis del LCR es una parte integral del diagnóstico de EM 2- El único análisis informativo es el establecimiento cualitativo de IgG en LCR, utilizando IEF seguido de una técnica de detección inmune( fijación o blotting). Esta es la técnica declarada gold-standard por la FDA 3- El análisis cualitativo debe ser realizado en LCR sin concentrar y debe ser comparado directamente con un suero corrido simultáneamente en el mismo ensayo Arch Neurol. 2005;62:
56 Nuevos Criterios diagnósticos para Esclerosis Múltiple 4- Corridas óptimas usan similares concentraciones de IgG para suero y LCR 5- Controles positivos y negativos deben ser corridos en cada set de muestras y el gel debe ser desechado si no se ven bien las bandas en los controles 6- El informe del LCR debe ser realizado en términos de los 5 patrones reconocidos Arch Neurol. 2005;62:
57 Nuevos Criterios diagnósticos para Esclerosis Múltiple 7- La interpretación debe ser realizada por una persona experta en la técnica utilizada 8- Considerar una nueva punción en el caso de una alta sospecha clínica pero resultados negativos del LCR, o solo mostrando una banda 9- El análisis cuantitativo de IgG es un buen complemento informativo, pero no se considera un substituto al análisis cualitativo, el cual posee la más alta especificidad y sensibilidad Arch Neurol. 2005;62:
58 Nuevos Criterios diagnósticos para Esclerosis Múltiple 10- Cuando se realice el dosaje de IgG en LCR, fórmulas no lineales deben ser usadas para medir integridad de la BEH, midiendo la relación de albúmina en LCR/Albúmina en suero 11- Los laboratorios que realicen de rutina la búsqueda de Bandas Oligoclonales en LCR deben poseer controles internos y externos de calidad para asegurar un alto standard de confiabilidad y desempeño Arch Neurol. 2005;62:
59 BIBLIOGRAFIA Recommended Standard of Cerebrospinal Fluid Analysis in the Diagnosis of Multiple Sclerosis. A Consensus Statement Mark S. Freedman, MSc, MD, FRCPC; Edward J. Thompson, DSc; Florian Deisenhammer, MD; Gavin Giovannoni, PhD; Guy Grimsley, PhD; Geoffrey Keir, PhD; Sten Öhman, PhD; Michael K. Racke, MD; Mohammad Sharief, PhD; Christian J. M. Sindic, MD, PhD; Finn Sellebjerg, MD, PhD, DMSci; Wallace W. Tourtellotte, MD, PhD. Arch Neurol. 2005;62: Multiple sclerosis.noseworthy JH, Lucchinetti C, Rodriguez M, Weinshenker BG. N Engl J Med 2000;343: Multiple Sclerosis The Plaque and Its Pathogenesis Elliot M. Frohman, M.D., Ph.D., Michael K. Racke, M.D., and Cedric S. Raine, Ph.D., D.Sc. The new england journal o f medicine2006;354:
60 BIBLIOGRAFIA E. J. Thompson. Líquido cefalorraquídeo en la Esclerosis Múltiple. The National hospital for Neurology and Neurosurgery Queen Square. London. Joaquín A. Peña, Eduardo Mora de la Cruz, Cecilia Montiel-Nava. Enfermedades inflamatorias desmielinizantes. Neurología Pediátrica 3 edición. Stephen L. Hauser, Donald E. Goodkin. Esclerosis Múltiple. Principios de medicina interna. Harrison. Esclerosis Múltiple en la infancia. Silvia N. Tenembaum. Revista Española de Esclerosis Múltiple N 3:2007. El estudio de laboratorio en el diagnóstico diferencial de la Esclerosis Múltiple. Francisco Coret Ferrer, Bonaventura Casanova Estruch. Hospital Clínico Universitario; Hospital Universitario La Fe, Valencia. Recomendación para el estudio de las proteínas del líquido cefalorraquídeo Sociedad Española de Bioquímica Clínica y Patología Molecular. Química Clínica 2002;83-90.
61 MUCHAS GRACIAS.
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