Diagnóstico microbiológico del género Streptococcus. TM Pedro Alarcón Laboratorio de Referencia Cocaceas Gram positivas Mayo 2011

Transcripción

1 Diagnóstico microbiológico del género Streptococcus TM Pedro Alarcón Laboratorio de Referencia Cocaceas Gram positivas Mayo 2011

2 Dominio Phylium Taxonomia Bacterias Firmicutes Clase Orden Bacillales Bacilli Lactobacillales Familia Staphylococcaceae Lactobacillaceae Aerococcaceae Carnobacteriaceae Enterococcaceae Leuconostocaceae Streptococcaceae Genero Gemella Pediococcus Aerococcus Abiotrophia Dolosicoccus Eremococcus Flaklamia Globicatella Ignavigranum Alloiococcus Dolosigranulum Granulicatella Enterococcus Melissococcus Tetragenococcus Vagococcus Leuconostoc Oenococcus Weissella Streptococcus Lactococcus Bergey's Manual (September 2009)

3 α-hemolíticos Género Streptococcus Los Streptococcus son un género de Bacterias Gram positivas, esféricas de menos de 2 um de tamaño. Estas bacterias crecen en cadenas o pares, donde cada división celular ocurre a lo largo de un eje. De allí que su nombre, del Griego streptos, significa que se dobla o retuerce con facilidad, como una cadena. β-hemolíticos γ-hemolíticos

4 Características Generales del genero Streptococcus Son bacterias anaerobias facultativas La mayoría de las especies crece en un ambiente con CO2 (5%), son capnofilos Son homofermentativos, producen acido láctico a partir de la fermentación de la glucosa sin formación de gas Son catalasa negativo Son oxidasa negativo Forman cadenas cuando crecen en medios líquidos Algunos poseen capsula, la cual los permite serotipificar Pared Celular de Gram positivo Tinción de Gram Reacción de Catalasa

5 Streptococcus α hemolíticos Grupo viridans heterogéneo e incluye varios subgrupos grupo mitis grupo anginosus grupo mutans grupo salivarius grupo bovis grupo sanguis

6 Grupo mitis Asociado a endocarditis y caries dentales Streptococcus mitis : En prótesis y válvulas Streptococcus oligofermentans Streptococcus oralis : En prótesis y válvulas Streptococcus gordonii Streptococcus cristatus Streptococcus infantis Streptococcus peroris Streptococcus australis Streptococcus pneumoniae

7 Grupo anginosus Asociado a abscesos subcutáneos y órganos Streptococcus anginosus : Tracto urogenital, abscesos abdominales, tejidos blandos, cabeza y cuello Streptococcus constellatus : Tracto Respiratorio subespecies constellatus y subespecie pharyngis Streptococcus intermedius : En absceso de cerebro e hígado

8 Grupo mutans Asociado a endocarditis y caries dentales Streptococcus mutans : En placa bacteriana (principal agente productor de caries y bacteremia) Streptococcus sobrinus : En placa bacteriana (dental) Streptococcus criceti (animales) Streptococcus ratti (animales) Streptococcus downei (animales) Streptococcus macacae (animales) Streptococcus ferus (animales)

9 Grupo salivarius Asociado a endocarditis y caries dentales Streptococcus salivarius : En boca, especialmente lengua, mucosa y saliva. (bacteremia, endocarditis y meningitis) Streptococcus vestibularis : En vestíbulo oral Streptococcus thermophilus : En lecherías Streptococcus hyointestinalis: En tripas de cerdo

10 Grupo bovis Infección del tracto biliar y urinario, endocarditis Streptococcus infantarius II.1 (humanos) *subsp. infantarius y subsp. coli Streptococcus alactolyticus (animales) Streptococcus equinus/bovis(animales) Streptococcus gallolyticus *Streptococcus gallolyticus subsp. gallolyticus (I) (cancer gastrointestinal) *Streptococcus gallolyticus subsp.pasteurianus II.2 (meningitis) *Streptococcus gallolyticus subsp.macedonicus

11 Grupo sanguis/sanguinis Asociado a bacteremias Streptococcus sanguis biotipo 1 Streptococcus sanguis biotipo 2 Streptococcus sanguis biotipo 3 Streptococcus parasanguis Streptococcus gordonii Streptococcus sinensis Aislados en humanos

12 Diferenciación n fenotipica de Streptococcus grupo viridans α - hemólisis, LAP +, PYR -, Vancomicina S Grupo viridans Arginina Dihidrolasa Hidrólisis de la Esculina Acetoina (VP) Manitol Sorbitol Lactosa Actividad Ureasa Grupo Sanguis Grupo Mitis Grupo Mutans Grupo Salivarius Grupo Anginosus Grupo Bovis v LAP: Leucina-aminopeptidasa PYR: Pirrolidonil-arilamidasa

13 Flujograma de diferenciación de Streptococcus grupo viridans LAP (+), PYR (-),Lactosa (+), Vancomicina sensible grupo sanguis grupo anginosus Producción de Acetoina (VP) Hidrólisis de Arginina (+) (-) grupo mitis grupo bovis grupo mutans grupo salivarius grupo anginosus aroma dulce (+) (-) grupo sanguis Hidrólisis de la urea (-) (+) grupo bovis grupo mutans grupo mitis grupo salivarius grupo bovis grupo mutans Producción de Acetoina (+) (-) grupo mitis Acidificación de Sorbitol (+) (-) grupo mutans grupo bovis Latex D (+) Bilis esculina (+) Nacl (-)

14 1- Características fenotipicas de otros Géneros bacterianos Que presentan α - hemólisis, Catalasa negativa GENERO LAP PYR SUSCEP. VANCOMICINA MOVILI DAD CALDO SAL 6.5% Enterococcus + + S/R V + Abiotrophia + + S - - Granulicatella + + S - - Aerococcus V V S - + Helcococcus - + S - + Leuconostoc - - R - V Weisella - - R - + Pediococcus + - R - V Tetragenococcus + - S - + Gemella V + S - -

15 2- Características fenotípicas de otros Géneros bacterianos Que presentan α - hemólisis, Catalasa negativa GENERO LAP PYR SUSCEP. VANCOMICINA MOVILI DAD CALDO SAL 6.5% Vagococcus + + S + + Alloiococcus + + S - + Globicatella - + S - + Facklamia + + S - + Dolosigranulum + + S - + Ignavigranum + + S - + Dolosicoccus - + S - - Eremococcus - - S - + Lactococcus + + S - V

16 Streptococcus grupo viridans (n:133) Laboratorio de Referencia Cocaceas Gram positivas Año Numero Grupo mitis Grupo anginosus Grupo bovis Grupo salivarius Grupo sanguis Grupo mutans Aerococcus viridans Dolosigranulum pigrum Gemella haemolysans Gemella morbillorum Globicatella sanguinis Granulicatella adiacens

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19 Streptococcus grupo mitis Streptococcus pneumoniae Kawamura et al en estudio basado en comparación de secuencias de genes de 16S de rrna encuentra una estrecha relación filogenética entre S. pneumoniae y Streptococcus grupo viridans, sugiere incluirlo como parte del grupo mitis

20 Streptococcus pneumoniae Características generales: Cocaceas gram Positivas capsuladas con un tamaño de 0.5 a 1.2 um de diámetro, dispuestas en pares o diplos lanceolados Son anaerobias facultativas Para su crecimiento y desarrollo necesitan de una atmosfera de 8 a 10 % de CO2 Presenta colonias redondas, mucosas y no pigmentadas, de 1 a 3 mm de diámetro, las cuales presentan un aspecto umbilicado, con una depresión central producida por una autolisis progresiva.

21 Factores de virulencia Streptococcus pneumoniae Adherencia( pspa y psaa): Capacidad de adherirse a celulas blanco Cápsula polisacárida: hay alrededor de 90 tipos capsulares Pneumolisina (gen ply): Citotoxina que destruye la membrana de globulos rojos Neuraminidasa:(NamA-NamB) hidroliza glucoproteinas y glucolipidos celulares Autolisina (gen lyta): hidroliza la capa de peptidoglican, permite la division celular Proteasa para IgA: inactiva la IgA1 presente en las mucosas, facilitando la adherencia y colonización Hialuronidasa: diseminación de los organismos en los tejidos

22 Pruebas Bioquimicas de Laboratorio Solubilidad en bilis Desoxicolato de sodio 10% Reacción Control positiva Negativo Susceptibilidad a optoquina 5ug (Ethil hydrocupreina hydrochloride)

23 Serotipificación por técnica de Quellung Método de Referencia Se produce el aumento (hinchazón) de la capsula al añadir antisueros capsulares específicos lo que la hace visible microscópicamente (100x)

24 Serotipos de Streptococcus pneumoniae de muestras invasivas años 2008 a 2010 Instituto de Salud Publica de Chile A A 12F 15A 15B C 15F 16F 1 18A c C 18F 19A 80 7F 19F 22F 23A 23B 60 7F 3 7F 23F 24F 28A F 3 19F 19F 33F 35F 6A 6B 7F 20 9A 9L 9N 9V 0 Otros Año 2008 Año 2009 Año 2010

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28 Susceptibilidad de Streptococcus pneumoniae aislados de cuadros invasivos años Instituto de Salud Publica de Chile Penicilina Meningitis (CIM) Resistente Sensibles Año Total casos n % n % , , , ,9 Penicilina No Meningitis (CIM) Resistente Sensibles Intermedia Año Total casos n % n % n % , , ,8 24 2, , ,3 15 2,2

29 Susceptibilidad de Streptococcus pneumoniae aislados de cuadros invasivos (n 786) Instituto de Salud Publica de Chile, año 2010 Ceftriaxona meningitis (CIM) Ceftriaxona no meningitis (CIM) Grupo de edad n Sensibles Intermedia Resistente n Sensibles Intermedia Resistente n % n % n % n % n % n % < 12 meses ,0 1 4,8 3 14, ,9 7 9,7 1 1, meses ,6 1 7,7 1 7, , ,2 0 0, meses ,5 0 0,0 3 37, , ,1 1 1,3 5 a 14 años ,0 0 0,0 0 0, ,0 0 0,0 0 0,0 15 a < 60 años ,9 2 5,4 1 2, ,9 6 3,5 1 0,6 60 años ,0 0 0,0 0 0, ,0 8 4,7 4 2,3 Sin edad ,0 0 0,0 0 0, ,3 2 3,8 1 1,9 Total ,0 4 3,7 8 7, ,2 45 6,6 8 1,2 Eritromicina (KB o CIM) SXT (KB o CIM) Grupo de edad n Sensibles Intermedia Resistente n Sensibles Intermedia Resistente n % n % n % n % n % n % < 12 meses ,5 0 0, , , , , meses ,7 0 0, , , , , meses ,7 1 1, , , , ,3 5 a 14 años ,0 0 0,0 4 8, , , ,0 15 a < 60 años ,2 0 0, , , , ,4 60 años ,7 1 0, , , , ,2 Sin edad ,7 2 3, , , , ,1 Total ,7 4 0, , , , ,2 Cloranfenicol (KB o CIM) Grupo de edad n Sensibles Resistente n % n % < 12 meses ,8 2 2, meses ,1 2 1, meses ,7 2 2,3 5 a 14 años ,0 0 0,0 15 a < 60 años ,6 3 1,4 60 años ,9 2 1,1 Sin edad ,0 0 0,0 Total ,6 11 1,4

30 Métodos de Concentración Inhibitoria Mínima

31 Streptococcus beta hemolítico Grupo Piogénico Streptococcus pyogenes Streptococcus agalactiae Streptococcus equi subespecie equi Streptococcus equi subespecie zooepidermicus Streptococcus dysgalactiae subespecie dysgalactiae Streptococcus dysgalactiae subespecie equisimilis Streptococcus canis Streptococcus iniae Streptococcus porcinus Streptococcus phoacae Streptococcus didelphis Streptococcus urinalis

32 Streptococcus pyogenes Caracteristicas: Cocaceas gram positivas dispuestas en cadenas Son colonias blancas de 1-2 mm de diametro con una marcada zona beta hemólisis Anaerobios facultativos Inmoviles no formadores de esporas, capsulados Son catalasa negativa Rango de temperatura de crecimiento es de 25-45ºC (optimo 37 ºC)

33 Streptococcus pyogenes Pruebas de laboratorio: Colonias beta-hemolíticas con diámetro mayor a 0.5 mm Catalasa - PYR PYR + LAP + Grupo de Lancefield A (año 1933) VP - Bacitracina 0,04U Sensible Cotrimoxazol Resistente DNAsa Positiva - +

34 Streptococcus pyogenes Factores de Virulencia Proteína M: principal factor de virulencia, confiere resistencia a la fagocitosis por los polimorfonucleares, en base a esta proteína podemos serotipificar a S.pyogenes, existen mas de 124 serotipos ( emmgene sequence typing) Proteína F:adherencia y evasión del sistema inmune Acido Lipoteicoico: unión a fibronectina Enzimas: estreptoquinasas, DNAsas, amilasas, esterasas y hialuronidasas Toxinas: Estreptolisinas son hemolisinas (S y O) capaces de lisar eritrocitos, leucocitos y plaquetas; Exotoxinas pirogénicas A, B y C (SpeA,SpeB y SpeC)

35 Streptococcus pyogenes Cuadros clínicos en orden de frecuencia: Enfermedades supurativas Faringitis Escarlatina Impétigo Erisipela Celulitis Fascitis necrosante (gangrena estreptocócica) Sindrome del shock tóxico estreptocócico Otras: sepsis puerperal, linfangitis, neumonía, bacteriemia, endocarditis, meningitis y artritis. Enfermedades no supurativas Fiebre reumática Glomerulonefritis postestreptocócica

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37 emm typing Secuenciamiento del gen emm que codifica a proteína M Reemplaza el convencional método serologico (1943) Se analiza la secuencia nucleotidica NH2-terminal (región hipervariable) La definición de un nuevo tipo emm se basa en la identificación de mas de 160 bases nucleotidicas (mayor a 95% de similitud con el gen emm de referencia) La secuencia de emm types puede ser encontrada online en: Los tipos emm mas frecuentemente encontrados son: emm1, emm3, emm4, emm6, emm12, emm28 y emm89.

38 emm types encontrados en cepas de Streptococcus pyogenes (N 62) Laboratorio de Referencia año Cantidad emm1 emm12 emm89 emm80 emm6 emm3 emm28 emm4 emm33 emm87 emm81 emm11 emm22 emm44 emm48 emm82 emm90 emm types

39 Distribución de Serotipo M de S. pyogenes por muestra Laboratorio de Referencia de Cocaceas gram positivas Año 2010 SEROTIPO M SANGRE LIQ. ARTICULAR TEJIDOS LIQ. PERITONEAL SECRECIONES TOTAL TOTAL

40 Streptococcus agalactiae Caracteristicas: Cocaceas gram positivas dispuestas en cadenas Catalasa negativas Colonias de color blanco con tamaño >0.5mm de diametro, presentando una pequeña beta hemolisis Anaerobio facultativo Crece mejor en presencia de 5% CO2 (capnofilos)

41 Streptococcus agalactiae Factores de virulencia Capsula: Antifagocitaria, especificidad tipo, 10 antigenos capsulares Beta hemolisina/citolisina: Lisis de células de epitelio pulmonar Acido Lipoteicoico: adherencia celular como primer paso en la infección Enzima hialuronato liasa (gen hylb): Participa en la diseminación rompiendo el acido hialuronico de la matriz extracelular, tejido de placenta, tejido fetal y liquido amniótico.

42 Patologías asociadas *Es un importante patógeno en neonatos y mujeres embarazadas produciendo cuadros de bacteremia, meningitis, neumonía, shock séptico y neutropenia. *Causante de bacteriuria en mujeres embarazadas *Causa cistitis, pielonefritis, uretritis en hombres, mujeres no embarazadas y niños *Infección de heridas, artritis.

43 Streptococcus agalactiae Pruebas bioquimicas : - Catalasa - - Látex (C. Lancefield ) B - Test de CAMP + (>98%) - Hidrólisis de Hipurato de sodio + - LAP + - PYR - Test CAMP Hidrólisis de Hipurato

44 Prueba de CAMP Streptococcus agalactiae (CAMP test positivo) Staphylococcus aureus (ATCC 25923) Arcanobacterium haemolyticum (CAMP reverso positivo) Christie, Atkins, and Munch-Peterson, fue descrito en 1944.

45 Streptococcus agalactiae Serotipificación La clasificación serológica está basada en la identificación de polisacáridos ( Ia, Ib, II, III, IV, V, VI, VII, VIII y IX) y proteínas antigénicas (C, R y X) Los serotipos mas comúnmente aislados en países americanos son Ia, Ib, II y III Serotipos VI y VIII han sido aislados en Japón El serotipo III se aísla con mayor frecuencia de casos de sepsis neonatal y meningitis.

46 Serotipos de Streptococcus agalactiae según muestra Serotipos SAG Sangre LCR Liquido Articular Secreciones Total Ia Ib II III IV V VI VII VIII NT Total

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49 Resistencia de Eritromicina y Clindamicina en Streptococcus pyogenes / Streptococcus agalactiae E Cl E Cl Eritromicina y Clindamicina :S Eritromicina : R y Clindamicina:S Fenotipo M gen mef (macrolide efflux) E E Cl Cl E Cl Eritromicina y Clindamicina :R Fenotipo MLSc gen erm (erythromycin ribosomal methylase) Eritromicina y Clindamicina :R inducida Fenotipo MLSi

50 Susceptibilidad Streptococcus pyogenes año 2009 n: 103 Laboratorio de Referencia 120 Fenotipos encontrados M 1 MLSc Cantidad Sensible Resistencia a eritromicina 1.94% Resistencia a clindamicina 0.97% 20 Resistente 0 0 Penicilina Clindamicina Antibioticos 1 Eritromicina 2 Vancomicina 0 Cantidad Susceptibilidad de Streptococcus agalactiae año 2009 n:136 Laboratorio de Referencia Fenotipos encontrados M 1 MLSc 8 MLSi 2 Resistencia a eritromicina 8.08% Resistencia a clindamicina 7.35% 40 Sensible 20 0 Penicilina 0 Clindamicina 10 Eritromicina 11 Vancomicina 0 Resistente Antibioticos

51 Cantidad Penicilina Susceptibilidad de Streptococcus pyogenes año 2010 n:62 Laboratorio de Referencia Eritromicina Clindamicina Antibioticos Cefotaxima Vancomicina Sensible Resistente Fenotipos encontrados M 2 MLSc 2 Resistencia a eritromicina 6.45% Resistencia a clindamicina 3.22% Cantidad Penicilina Susceptibilidad de Streptococcus agalactiae año 2010 n:147 Laboratorio de Referencia Eritromicina Clindamicina Antibioticos Cefotaxima Vancomicina Sensible Resistente Fenotipos encontrados M 3 MLSc 5 MLSi 2 Resistencia a eritromicina 6.16% Resistencia a clindamicina 4.79%

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53 Streptococcus β - hemolíticos Grupos A,C, G con diámetro de colonia mayor a 0,5 mm Streptococcus dysgalactiae subespecie equisimilis : - Catalasa - - PYR - - Látex (Grupo Lancefield) A,C,G - VP - - Bacitracina 0.04u Resistente

54 Streptococcus β- hemolíticos no piogenico Grupos A, C, G con diámetro de colonias menor a 0,5 mm Streptococcus anginosus (A, C, G, F, ) Streptococcus constellatus ( A,C, F, ) Streptococcus intermedius (F) - Catalasa - - PYR - - VP + - Trehalosa + - Sorbitol - Voges-Proskauer - +

55 Identificación Streptococcus β- hemolíticos Grupo Lancefield Tamaño de colonia Especies PYR VP Hidrólisis almidón Sorbitol CAMP A Grande S. pyogenes A,C,G,F Pequeña <5mm Streptococcus grupo anginosus A,C,G Grande S. dysgalactiae subesp equisimilis B Grande S. agalactiae C Grande S. dysgalactiae subesp disgalactiae C Grande S. equi subesp equi C Grande S. equi subesp zooepidermicus

56 Control de Calidad Staphylococcus aureus ATCC Streptococcus pneumoniae ATCC Staphylococcus aureus ATCC BAA-976 (Test D Negativo) Staphylococcus aureus ATCC BAA-977 (Test D Positivo) Streptococcus pyogenes ATCC (Latex A) Streptococcus agalactiae ATCC (Latex B) Streptococcus dysgalactiae sp dysgalactiae ATCC (Latex C) Streptococcus dysgalactiae sp equisimilis ATCC (Latex G)

57 Comentarios generales Streptococcus grupo viridans aislados de sangre u otros sitios estériles (LCR) se debe hacer estudio de susceptibilidad a PEN o AMP solo por método Concentración Inhibitoria Mínima. Streptococcus beta hemolíticos del grupo anginosus se les debe hacer antibiograma de grupo viridans.

58 Los test de susceptibilidad a penicilina y otros β- lactámicos aprobados por la FDA para el tratamiento de Streptococcus pyogenes o Streptococcus agalactiae no es necesario realizarlo de rutina, como también para vancomicina, ya que no se han reconocido cepas resistentes. Cualquier cepa considerada no susceptible DEBE enviarse al laboratorio de referencia para su confirmación.

59 MUCHAS GRACIAS