Fluorescencia de proteínas

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Daniel Valenzuela Núñez
hace 8 años
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1 Fluorescencia de proteínas Fluorescencia intrínseca (emisión dominada por trp) Marcado con sondas fluorescentes (RET, anisotropía) GFP y derivados (visualización, RET)

2 Fluorescencia de proteínas Herramienta útil para dar información de Estructura Dinámica Conocer estructura de la proteína nativa, relacionar estructura con su actividad, su función Detectar cambios de estructura, que pueden llevar a alterar su función Cambios de estructura al interaccionar con otras macromoléculas o con ligandos Por ejemplo: Plegamiento / desnaturalización Asociación / disociación

cambios de estructura, que pueden llevar a alterar su función Cambios de estructura al

4 Phe Abundancia: 3.5% λex = 260 nm, λem= 282 nm (Q.ε ~ 5) Insensible al entorno Tyr Abundancia: 3.5% λex = 275 nm, λem= 303 nm (Q.ε ~ 220) Insensible al entorno, quencheable Ionizable, tirosinato emite (<Q) Trp Abundancia: 1.1% λex = 295 nm, λem= 350 nm (Q.ε ~ 770) Sensible al entorno, quencheable Varias τ

5 Emisión de Tirosinato Emisión normalizada de Y a ph 7 y a ph 12 λex = 280 nm pka (Y) = 10.3 Emisión del tirosinato a > λ (350 nm) pero bajo rendimiento

6 Emisión de Tirosinato excitado Emisión de Y a ph 6 en buffer acetato λex = 280 nm pka (Y) = 10.3 pka (Y*) = 4-5 Emisión del tirosinato a > λ (340 nm) pero bajo rendimiento

7 Emisión de Tirosina / Tirosinato Emisión de proteínas que no contienen triptofanos Emisión del tirosinato a > λ (350 nm) puede confundirse con emisión de W

8 Emisión del W es sensible al efecto del solvente Emisión de indol en mezclas ciclohexano-etanol λex = 280 nm Emisión del W es sensible a efecto general del solvente y efecto específico del solvente Ciclohexano - no enlace H Etanol solvente más polar

es sensible a efecto general del solvente y efecto específico

9 Emisión del W es sensible al entorno local Ubicación de W en la proteína 1- azurin 2- ribonucleasa 3-Staphylo nucleasa 4- glucagón Blue W Red W

10 Emisión del W proteico es sensible al entorno local Es claro el corrimiento al rojo al pasar el W a un entorno más polar No existe clara correlación con la Intensidad en el máximo (Q, τ) la intensidad de emisión de los W de una proteína depende de la estructura particular de esa proteína en general, mayor F en entorno más hidrofóbico, o sea, > F para blue W Centro de masa espectral: <λ i > = F i λ i / F i

de emisión de los W de una proteína depende de la estructura particular de esa proteína en general,

11 Emisión del W es sensible al entorno local Plegamiento de proteína

12 Emisión del W es sensible a desactivación bimolecular Desactivación por quenchers solubles indica mayor exposición del W al solvente

13 Emisión del W es sensible a desactivación bimolecular 1- glucagón (1 W bien expuesto) 21- apozurin (1 W interior)

14 RET en fluorescencia intrínseca Solapamiento espectral Distancias entre residuos ~ 24 Å F Y W

15 RET entre Tyr y Trp hifnγ homodímero, cada subunidad tiene 4Y y 1W

16 RET entre Tyr y Trp La Eficiencia de RET Y W se calcula a partir de espectros de excitación Si E = 100% Q (W) independiente de λ exc, Q rel = 1 Si E = 0% Q rel <1 Q λ / Q 295 λ em = 350 nm

17 Emisión de Triptofano Relajación por solvente exposición al solvente interacción con entorno proteico Quenching dinámico quencher externo quencher = grupos cercanos de la proteína (Lys, His, COOH, amida, cistina) RET F Y W blue W red W W aceptor Anisotropía (τ ~ 3 4 ns, φ cortos, flexibilidad de dominios proteicos)

= grupos cercanos de la proteína (Lys, His, COOH, amida, cistina) RET F Y W

18 Emisión de proteínas con varios W TRF (Fluorescencia resuelta en el tiempo) Ajuste multiexponencial, distintas vidas medias / distribución I ss (Intensidad de F en estado estacionario) Distinguir grupos de W (quenching, fracción accesible) Mutantes con 1 solo W En proteínas que no contienen W, insertar W en determinada posición Insertar análogo de W con otra emisión Insertar aminoácidos no naturales fluorescentes

$de W (quenching, fracción accesible) Mutantes con 1 solo W En proteínas que no contienen W, insertar W$

19 GFP = Green Fluorrescent Protein Formación espontánea del fluoróforo al plegarse

20 Fotoestables Exc. y Em. en el visible Proteínas de fusión con GFP para marcado intracelular Fluoróforo se forma espontáneamente, no necesita agregados (a diferencia de proteínas fitofluorescentes de organismos fotosintéticos, apoproteina + pigmento)

22 Tyr - emisión desde una única transición electrónica (L b ) Trp - emisión posible desde 2 transiciones electrónicas isoenergéticas con distinta orientación del momento dipolar (L a no estructurado, r alto, L b estructurado, r bajo)

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