Efectos del solvente y del entorno local sobre la fluorescencia
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- Lorenzo Cruz Prado
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1 Efectos del solvente y del entorno local sobre la fluorescencia
2 C 6 C 7 Temario Efectos generales del solvente Efectos específicos del solvente Efectos de la temperatura Transferencia interna de carga y reacciones del estado excitado Efectos de la transición de fases en biomembranas Viscosidad Interacciones entre fluoróforos Cambios en el rendimiento cuántico Procesos en el estado excitado Espectros de emisión resueltos en el tiempo (TRES) Relajación espectral en proteínas Relajación espectral en membranas Relajación en solventes en la escala de los picosegundos Medidas de relajación multiexponenciales Distinción de relajación del solvente y la interconversión rotamérica Espectros de emisión resueltos el tiempo de vida del estado excitado Corrimientos por excitación en el borde rojo Transferencia interna de carga y reacciones del estado excitado hbotti@pasteur.edu.uy
3 El solvente y el entorno pueden afectar el rendimiento cuántico Vida intrínseca o natural Nº de fotones Vida media ( promedio ) Mean lifetime ( = t 1/e ) (Constante de tiempo o tiempo característico) Media vida (t½) Half-life (también es un promedio ) t ½ = Ln2 t ½ = Ln2/( +k nr ) Rendimiento cuántico
4 El solvente y el entorno pueden afectar el corrimiento de Stokes Energía de los fotones Frecuencia c Número de onda 1 Corrimiento de Stokes Ecuación de Planck E h hc Energía disipada E hc( ) A F
5 Efectos del solvente y del entorno Muchos fenómenos, oportunidades e interpretaciones Cuidadosa inspección de las propiedades moleculares del fluoróforo y del entorno
6 Efectos del solvente y del entorno k >> 1/ k 1/ Corrimientos de Stokes dinámicos
7 Ecuación de Lippert-Mataga hc 2 a El fluoroforo es consideredo un dipolo en un medio continuo de constante dieléctrica (permitividad) uniforme f 2 ( 3 E G) const Materiales dieléctricos, conductores y medios biológicos Solvatación de iones Saturación dieléctrica en las cercanías del ión
8 Energía Polaridad del solvente y del fluoróforo Momento dipolar eléctrico Momento dipolar eléctrico molecular en el estado basal (0 ó G) y excitado Momento dipolar de la transición qr 01 1 D = x10-30 Cm -e e 0.2 Ǻ G E 1 0 es importante porque explica acoplamiento: REM, Eint y Ext 2>, 1>, 01 0>,
9 Polarizabilidad, polarización y constante dieléctrica del entorno Polarizabilidad (tensor ) Polarización P N V Constante dieléctrica relativa (cantidad empírica) 0 E 0E D 0 ( 1) E La permitividad relativa o constante dieléctrica relativa ( ) mide el alineamiento de los dipolos del solvente y la producción de dipolos inducidos por un campo eléctrico (polarizabilidad del solvente).
10 Ecuación de Lippert-Mataga Se aplica a corrimientos de Stokes estáticos Se basa en la teoría de campos reactivos de Onsager hc 2 f a 2 ( 3 E G) JACS, 1936, 58, p const Campo eléctrico reactivo Es el campo eléctrico que experimenta el fluoróforo que es fruto de la polarización de las moléculas del entorno por el dipolo del fluoróforo (es paralelo y se orienta en sentido opuesto) La energía de un dipolo (U ó E) Depende de, de E y del cos del ángulo theta En el vacío? E dipolo 0 0 A
11 Ecuación de Lippert-Mataga Se basa el el principio de Franck-Condon hc 2 f a 2 ( 3 E G) const Polarizabilidad de baja frecuencia Polarizabilidad de alta frecuencia Polarizabilidad orientacional ( f) Espectroscopía de dieléctricos
12 Ecuación de Lippert-Mataga hc 2 f a 2 ( 3 E G) const
13 Algunos usos Corrimiento de Stokes Gráfico de Lippert En vesículas de DPPC Determinar la polaridad de un sitio de unión a una sonda por comparación de la fluorescencia de la sonda unida con su fluorescencia en solventes de polaridad conocida.
14 Determinar constantes de unión de un ligando si este es fluorescente y su fluorescencia cambia con la unión o si la fluorescencia intrínseca cambia por efecto de la unión de un ligando
15 Efectos específicos del solvente P de H
16 T, viscosidad
17 Transferencia interna de carga Prodan
18 Viscosidad
19 Entorno proteico
20 Entorno proteico Art. S61
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