REQUISITOS PARA LA VIGILANCIA A EFECTOS DE RECONOCIMIENTO INTERNACIONAL DE LA AUSENCIA DE INFECCIÓN

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1 CAPÍTULO REQUISITOS PARA LA VIGILANCIA A EFECTOS DE RECONOCIMIENTO INTERNACIONAL DE LA AUSENCIA DE INFECCIÓN PARTE 1 A. RECONOCIMIENTO INTERNACIONAL DE LA AUSENCIA DE INFECCIÓN 1. PRINCIPIOS GENERALES A continuación se ofrecen los principios generales para declarar libres de infección un país, región o establecimiento de acuicultura en relación con el momento de su última aparición y, en particular, el reconocimiento de la ausencia previa de la enfermedad. Es un requisito esencial para garantizar el reconocimiento de la ausencia de enfermedad que el país miembro concernido cumpla con los requisitos del capítulo del Código de animales acuáticos para la evaluación pertinente por parte de las autoridades competentes. Los principios generales son: En ausencia de infección o vacunación, la población de animales sería susceptible a la enfermedad clínica o a la infección durante un periodo de tiempo; Los patógenos de la enfermedad a los que se aplican estas medidas probablemente producirán en los animales susceptibles síntomas clínicos o patológicos que pueden ser identificados; Es posible que una población de animales esté libre de algunos patógenos específicos pero no de otros; La autoridad competente cuenta con personal cualificado capaz de investigar, diagnosticar, y emitir informes sobre la enfermedad o la infección cuando esta está presente; La ausencia de enfermedad durante un periodo largo de tiempo puede sustanciarse mediante una investigación e informe efectivo sobre la enfermedad por la autoridad competente del país miembro. 2. REQUISITOS PARA QUE UN PAÍS, ZONA O ESTABLECIMIENTO DE ACUICULTURA PUEDAN SER DECLARADOS LIBRES DE INFECCIÓN POR UN PATÓGENO ESPECÍFICO Los requisitos para declarar a un país, zona o establecimiento de acuicultura libres de infección varían en función del estado sanitario previo del país, zona o establecimiento de acuicultura: Ausencia de especies susceptibles; Históricamente libre; Última aparición de la enfermedad durante los últimos 25 años; Desconocimiento de la existencia de infecciones previas Ausencia de especies susceptibles Salvo que se especifique lo contrario en el capítulo correspondiente a una enfermedad concreta, puede declararse que un país, zona o establecimiento de acuicultura están libres de infección sin Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos

2 Chapter Requisitos para la vigilancia a efectos de reconocimiento internacional de la ausencia de infección necesidad de aplicar una vigilancia dirigida cuando en ese país, zona o establecimiento de acuicultura no existan especies susceptibles, siempre que se hayan aplicado de forma continua durante al menos los últimos 10 años anteriores en ese país, zona o establecimiento de acuicultura las condiciones de bioseguridad obligatorias Ausencia histórica de la enfermedad Salvo que se especifique lo contrario en el capítulo dedicado a una enfermedad, puede reconocerse un país, zona o establecimiento de acuicultura como libre de infección sin necesidad de aplicar vigilancia dirigida, cuando: o nunca se ha observado la presencia de la enfermedad; se ha logrado erradicar la enfermedad, o no se ha producido la enfermedad durante al menos los últimos 25 años, siempre que se hayan aplicado de forma continua durante al menos los últimos 10 años anteriores en ese país, zona o establecimiento de acuicultura las condiciones de bioseguridad exigidas Presencia de la enfermedad en los últimos 25 años anteriores Para los países o zonas en las que se ha logrado erradicar la enfermedad, (o en los que ha desaparecido la enfermedad) durante los 25 años anteriores, además de las condiciones de bioseguridad obligatorias, deberá haberse aplicado una vigilancia dirigida adecuada para demostrar la ausencia de infección, de acuerdo con las medidas que se mencionan en la sección B de este capítulo Desconocimiento de la existencia de infecciones previas. En los países o zonas cuyo estado sanitario previo se desconoce, o en los que no se han aplicado las disposiciones de las secciones A.2.1, A.2.2 o A.2.3 referidas anteriormente, deben introducirse las condiciones de bioseguidad obligatorias, además de la vigilancia dirigida acorde con las medidas de la sección B del presente capítulo. 3. DIRECTRICES PARA EL MANTENIMIENTO DEL RECONOCIMIENTO PERMANENTE DE LA AUSENCIA DE INFECCIÓN El país, zona o establecimiento de acuicultura a los que se haya reconocido como libres de la infección de acuerdo con los procedimientos señalados en las secciones A.2.1 o A.2.2, pueden conservar su estatus oficial como libres de infección siempre que se apliquen de forma continua las condiciones de bioseguridad obligatorias. El país, zona o establecimiento de acuicultura a los que se haya reconocido libres de la infección de acuerdo con los procedimientos señalados en las secciones A.2.1 o A.2.2A pueden interrumpir la vigilancia dirigida y conservar su estatus oficial como libres de infección a condición de que se mantengan de forma permanente las condiciones de bioseguridad obligatorias.. En el siguiente diagrama se resumen las vías para obtener el reconocimiento de la ausencia de infección. 34 Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006

3 Capítulo Requisitos para la vigilancia a efectos de reconocimiento internacional de la ausencia de infección 1. INTRODUCCIÓN B. VIGILANCIA DIRIGIDA PARA LA DEMOSTRACIÓN DE LA AUSENCIA DE INFECCIÓN En esta sección nos ocupamos de los estándares que han de aplicarse una vez se demuestre que un país, zona o establecimiento de acuicultura están libres de la infección, de acuerdo con los principios de la sección A. Los estándares descritos en esta sección pueden aplicarse a todas las enfermedades, a sus correspondientes agentes patógenos y a las especies susceptibles listadas en el Código de animales acuáticos, y están pensados para ayudar en la elaboración de procedimientos de vigilancia. En los capítulos del presente Manual de animales acuáticos en los que se describe de forma monográfica cada enfermedad, se puede encontrar información más detallada sobre los enfoques generales esbozados en el presente capítulo. Cuando en alguno de esos capítulos no se ofrezca información detallada sobre una enfermedad dada, se deberán escoger valores adecuados basándose en las directrices del presente capítulo. 2. PRINCIPIOS GENERALES La demostración de la ausencia de infección significa que se aportan suficientes pruebas que demuestran la ausencia de infección por un agente concreto en una población específica. En la práctica, es prácticamente imposible demostrar de forma absoluta que una población está libre de infección salvo que cada individuo de la población se examine de forma simultánea con una prueba perfecta, y con una especificidad y sensibilidad del 100 %. En lugar de eso, se trata de aportar evidencia suficiente (con un nivel de confianza aceptable), de que la infección, en caso de estar presente, lo está en una medida que es inferior a una proporción especificada de la población. Para tratar situaciones complejas reales, las metodologías a utilizar para la demostración de la ausencia de infección deberán ser flexibles. No existe un método que se pueda aplicar en todos los casos. Las metodologías deben adaptarse para su aplicación a una variedad de especies de animales acuáticos, a muchas enfermedades importantes, a una producción variada y sistemas de vigilancia, así como a los tipos y cantidades de datos y de información disponibles. Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos

4 Chapter Requisitos para la vigilancia a efectos de reconocimiento internacional de la ausencia de infección La metodología utilizada debe basarse en la mejor información disponible, que esté en sintonía con los conocimientos científicos actuales. Debe estar bien documentada y apoyada con referencias a la literatura científica y a otras fuentes, incluida la opinión de los expertos. Debe promoverse la consistencia de las metodologías y la transparencia es esencial para asegurar la ecuanimidad y la racionalidad, así como la consistencia en la toma de decisiones y facilidad de comprensión por todas las partes implicadas. En las solicitudes de reconocimiento del estatus de ausencia de infección deben documentarse las dudas, los supuestos asumidos y los efectos de ambas cosas en la estimación final. 3. REQUISITOS GENERALES PAR LA DEMOSTRACIÓN DE LA AUSENCIA DE ENFERMEDAD 3.1. Población La población diana a la que se refiere la demostración de la ausencia de infección está compuesta por todos los individuos de todas las especies susceptibles a la infección en un país, zona o establecimiento de acuicultura. La población bajo estudio puede ser idéntica a la población diana o puede ser una parte de esta última. La población bajo estudio debe ser, (en orden de preferencia): La población bajo estudio adecuada tal como se la define en cada capítulo destinado a una enfermedad (si es que tal definición existe), Un subgrupo de la población diana que define a un grupo de animales que, de estar presente la infección, tendría las mayores probabilidades de tener una prevalencia de infección superior a la de la población diana. Ese subgrupo debe definirse en términos de: especie; momento (ej., estación o mes del año); estadio/ciclo vital o periodo de crecimiento; sistema de producción y/o características de manejo; ubicación; características físicas o de comportamiento de fácil identificación. Idéntica a la población diana, Un subgrupo de la población diana con una probabilidad de sufrir la infección idéntica o inferior a la de la población diana. Deben considerarse, documentarse y tomarse en cuenta durante el análisis la naturaleza e impacto de cualquier sesgo de los resultados del análisis Fuentes de evidencia Las pruebas de la ausencia de infección pueden basarse en una serie de fuentes diversas, como: estudios estructurados, basados en poblaciones en los que se utilizan una o más pruebas para detectar la presencia del agente. otros tipos de vigilancia, incluida la vigilancia estructurada no aleatoria, como: sitios centinela; notificación de la enfermedad y documentos con la investigación del laboratorio; estudios académicos y otros estudios científicos; conocimientos de la biología del agente que incluyan información medioambiental, distribución de la población hospedadora, distribución geográfica conocida, distribución de vectores e información sobre el clima; 36 Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006

5 Capítulo Requisitos para la vigilancia a efectos de reconocimiento internacional de la ausencia de infección historia de las importaciones de material potencialmente infectado; medidas de bioseguridad adoptadas; evaluación de los servicios oficiales; o cualesquiera otras fuentes que proporcionen evidencia relevante en el sentido de que no hay infección en el país, zona o establecimiento de acuicultura. Deben describirse de forma exhaustiva las fuentes de evidencia para demostrar la ausencia de infección. En el caso de los estudios estructurados, estos deben incluir una descripción de la estrategia de muestreo utilizada para la selección de las unidades a ensayar. Por lo que respecta a los sistemas de vigilancia complejos, estos deben incluir la referencia a cualquier tipo sesgo inherente al sistema Metodología estadística El análisis de datos para hallar pruebas de la ausencia de infección implica una estimación de la probabilidad (α) de que la evidencia observada (los resultados de la vigilancia) haya podido producirse de acuerdo con la hipótesis nula de que la infección está presente en la población a una prevalencia especificada (s) (la prevalencia [s]de diseño). La confianza en que (o, lo que equivale a decir, la sensibilidad de) el sistema de vigilancia con el que se produjo la evidencia es igual a 1 α. Si el nivel de confianza sobrepasa un umbral preestablecido, la evidencia se estimará como suficiente para demostrar la ausencia de infección. El nivel de confianza requerido en el sistema de vigilancia (la probabilidad de que el sistema detecte la infección, en caso de que ésta exista, a un nivel especificado) debe ser igual o superior al 95%. La potencia (la probabilidad de que del sistema se derive un informe de ausencia de infección cuando realmente no hay infección) puede establecerse en cualquier nivel. Lo estipulado es que sea un nivel del 80%, pero este puede ajustarse de acuerdo con los requisitos de cada país o zona. Se aceptan diversas metodologías estadísticas para el cálculo de probabilidades α, incluidos los enfoques cualitativos y cuantitativos, siempre que estén basados en principios científicos. La metodología utilizada para calcular la confianza en el sistema de vigilancia, debe sustentarse en bases científicas y documentarse con claridad, incluyendo referencias a publicaciones en las que se describa la metodología en cuestión Concentración de la infección En el país, zona o establecimiento de acuicultura, la infección suele aparecer de forma concentrada en vez de distribuirse de forma homogénea en la población. Las concentraciones se pueden producir a distintos niveles (ej., una concentración de peces moribundos en un estanque, un grupo de estanques en un criadero, o un grupo de criaderos en una zona). Salvo con poblaciones que se sabe que son homogéneas, en los enfoques utilizados para demostrar la ausencia de infección deben tomarse en cuenta las concentraciones aludidas durante el diseño y el análisis estadístico de los datos, sobre todo al nivel de concentración considerado como más significativo para una población e infección de animales concreta Prevalencia de diseño El cálculo de la confianza del sistema de vigilancia se basa en la hipótesis nula de que la población está infectada. El nivel de infección se especifica por la prevalencia de diseño. En el caso más sencillo, la prevalencia de diseño consiste en la prevalencia de la infección en una población homogénea. De forma más común, cuando hay presencia de concentración de la enfermedad, se requieren dos valores de prevalencia; por ejemplo, la prevalencia del nivel de animales (proporción de pescado infectado en una piscifactoría infectada) y la prevalencia a nivel de grupo (proporción de Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos

6 Chapter Requisitos para la vigilancia a efectos de reconocimiento internacional de la ausencia de infección piscifactorías infectadas en el país, zona o establecimiento de acuicultura). Se pueden considerar las concentraciones a otros niveles, en cuyo caso se requieren valores de prevalencias de diseño adicionales. Los valores de la prevalencia de diseño empleadas en la realización de los cálculos deben ser los especificados en el capítulo sobre la enfermedad pertinente (si es que lo hay) del presente Manual de animales acuáticos. Si no están especificados para una enfermedad particular, debe justificarse la selección de los valores de prevalencia de diseño, y tal justificación debe basarse en las siguientes directrices: A nivel de animal individual, la prevalencia de diseño se basa en la biología de la infección que afecta a la población. Es igual a la prevalencia mínima esperada de la infección que afecta a la población del estudio, una vez que la infección se haya establecido para esa población. Depende de la dinámica de la infección que afecta a la población y de la definición de la población del estudio (que puede definirse para maximizar la prevalencia esperada en presencia de la infección). Un valor de prevalencia de diseño a nivel de animal (ej., prevalencia de los animales de una jaula) puede ser de: entre 1% y 5% para infecciones que se trasmiten de forma lenta, y más del 5% para infecciones más contagiosas. A niveles superiores (ej., jaula, estanque, piscifactoría, aldea, etc.) la prevalencia de diseño normalmente refleja la prevalencia de infección que es práctica y razonablemente detectable por un sistema de vigilancia. Rara vez se puede detectar la infección al límite más bajo (una sola unidad infectada de la población) en poblaciones grandes. También puede desempeñar un papel importante la evolución de la infección. Las infecciones que pueden extenderse rápidamente de unas piscifactorías a otras puede tener una prevalencia de diseño, a nivel de de piscifactoría, superior a la de las infecciones que se trasmiten con lentitud. Para una concentración al primer nivel (ej. la proporción de piscifactorías de una zona), se considera como conveniente una prevalencia de hasta el 2% Características de la prueba Todos los tipos de vigilancia implican la realización de una o más pruebas para obtener evidencia de la presencia de una infección, actual o anterior, que van desde los exámenes de laboratorio detallados a las observaciones del criador. El nivel de realización de una prueba a nivel de población se describe en términos de su sensibilidad y especificidad. La sensibilidad y/o specificidad imperfectas tienen su impacto en la interpretación de los resultados de la vigilancia y deben tenerse en cuenta durante el análisis de los datos de la vigilancia. Todos los cálculos deben tener en cuenta el nivel de desempeño (sensibilidad y especificidad) de las pruebas. Deben especificarse los valores de la sensiblidad y la especificidad utilizados en los cálculos, y se debe documentar el método utilizado para determinar la estimación de esos valores. Cuando aparezcan en el presente Manual de animales acuáticos los valores de sensibilidad y/o especificidad de una prueba concreta, se utilizarán dichos valores sin necesidad de justificar su uso. Cuando se utilice más de una prueba en un sistema de vigilancia (lo que a veces se denomina uso serial o paralelo de pruebas), se deben calcular la especificidad y sensibilidad del sistema de pruebas completo utilizando un método que tenga validez científica. La utilización de pruebas grupales implica la agrupación de ejemplares de múltiples individuos y la realización de una única prueba sobre el conjunto. El ensayo grupal constituye un enfoque 38 Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006

7 Capítulo Requisitos para la vigilancia a efectos de reconocimiento internacional de la ausencia de infección aceptable. Cuando se utilicen pruebas grupales, los resultados de la prueba deben interpretarse utilizando valores de sensibilidad y especificidad que se hayan determinado o estimado para ese procedimiento concreto de prueba conjunta y para los tamaños agrupados que se utilizan. El análisis de resultados de pruebas conjuntas debe realizarse, en la medida de lo posible, utilizando metodologías basadas en la estadística, que incluyan documentación completa y las referencias bibliográficas Fuentes de evidencia múltiples Donde haya o se generen muchas fuentes diferentes de datos que aporten pruebas de la ausencia de infección, puede analizarse cada una de estas fuentes de acuerdo con las directrices de la secciones B.3, B.4 (para estudios estructurados) y B.5 (para fuentes de datos complejas). Se pueden combinar las estimaciones de la confianza resultantes en relación con cada fuente de datos a fin de proporcionar un nivel general de confianza para las fuentes de datos combinados. Metodología a utilizar para combinar las estimaciones procedentes de fuentes múltiples de datos: Debe tener validez científica, y estar bien documentada incluyendo referencias a obras publicadas; y Debe considerar, en la medida de lo posible, la falta de independencia estadística de las distintas fuentes de datos. La información sobre vigilancia recogida en un mismo país, zona o establecimiento de acuicultura en diferentes ocasiones puede proporcionar evidencia acumulada de la ausencia de infección. Esa evidencia obtenida a lo largo de un tiempo puede combinarse para obtener un nivel general de confianza. Por ejemplo, se pueden analizar estudios anuales repetidos que proporcionen un nivel acumulativo de evidencia. No obstante, con un solo estudio (más amplio) se puede lograr el mismo nivel de confianza en un solo año. El análisis de la información sobre la vigilancia obtenida de forma intermitente o continua a lo largo de un periodo de tiempo debería mencionar, cuando sea posible, el tiempo empleado en recoger la información para tener en cuenta la disminución del valor de la información vieja. 4. REQUISITOS ESPECÍFICOS PAR EL DISEÑO Y ANÁLISIS DEL ESTUDIO ESTRUCTURADO Un método para aportar pruebas de la ausencia de infección consiste en el empleo de estudios dirigidos, estructurados y basados en la población. Además de los requisitos especificados en la sección B.3, se deben utilizar las siguientes directrices durante la implementación y análisis de los estudios para la demostración de la ausencia de infección Diseño del estudio La unidad de diagnóstico más importante es la unidad epidemiológica. La población de unidades epidemiológicas se debe definir con claridad. El diseño del estudio dependerá del tamaño y estructura de la población objeto de estudio. Si la población es relativamente pequeña y se puede considerar como homogénea en cuanto al riesgo de infección, se puede llevar a cabo un estudio de una única fase. Con poblaciones más grandes, cuando no esté disponible un marco de muestreo o, cuando es probable que la enfermedad aparezca de forma concentrada, se requiere un muestreo en varias fases. Cuando el muestreo es de dos fases, durante la primera fase se seleccionan grupos de animales (ej. estanques, piscifactorías o pueblos). En la segunda fase, y a efectos de la prueba, se escogen animales de cada uno de los grupos seleccionados. En el diseño de la prueba, se puede utilizar la estratificación. Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos

8 Chapter Requisitos para la vigilancia a efectos de reconocimiento internacional de la ausencia de infección 4.2. Muestreo El objetivo del muestreo de una población es la selección de un subconjunto de unidades procedentes de una población que es representativa de la población en cuanto dato que se quiere averiguar (en este caso, la presencia o ausencia de infección). El muestreo debe llevarse a cabo de tal forma que sea representativo de la población, dentro de las limitaciones de tipo práctico debidas al entorno y los sistemas de producción. El muestreo sesgado o dirigido propio de este contexto conlleva que las muestras se tomen de una población de estudio definida que tenga una probabilidad de infección distinta de la correspondiente a la población diana, de la que la primera constituye una subpoblación. Una vez identificada la población de estudio, el objetivo sigue siendo la selección de una muestra representativa de esa subpoblación Métodos de muestreo El diseño del estudio puede requerir un muestreo a varios niveles. Para el muestreo a nivel de unidades epidemiológicas, o unidades de rango superior, se debe utilizar el método formal de muestreo de probabilidades (ej. Muestreo aleatorio simple). Cuando se muestrea a niveles inferiores al de la unidad epidemiológica (ej. un solo ejemplar), el método de muestreo a utilizar debe proporcionar una opción óptima de generar una muestra representativa de la población correspondiente a la unidad epidemiológica elegida. A menudo resulta muy difícil recoger una muestra que sea verdaderamente representativa de los animales individuales (bien procedan de un estanque, una jaula o una piscifactoría). A fin de optimizar la las opciones de descubrir la infección, debe tomarse como objetivo orientar el muestreo hacia los animales infectados, por ejemplo, seleccionando animales moribundos, estadios de vida con una mayor probabilidad de infección activa, etc. Los métodos de muestreo realizados a cualquier nivel deben acompañarse de una justificación y documentación completas Tamaño de la muestra El número de unidades de una muestra correspondiente a una población debe calcularse mediante una técnica con validez estadística en la que se tomen en cuenta por lo menos los siguientes factores: la sensibilidad y especificidad de la prueba de diagnóstico, o el sistema de prueba; la prevalencia de diseño (o prevalencias para las que se use un diseño con varias fases); el nivel de confianza que se persigue para los resultados del estudio. De forma adicional, se pueden considerar otros factores para calcular el tamaño de las muestras, incluyendo (pero sin limitarse a): el tamaño de la población (se puede asumir que la población tiene un tamaño infinito); la potencia del estudio; incertidumbre o variaciones con respecto a las estimaciones de la sensibilidad y la especificidad. Los requisitos específicos de muestreo deberán diseñarse de forma específica para cada enfermedad por separado, teniendo en cuenta sus características y la sensibilidad y especificidad de los métodos de prueba establecidos para detectar el agente de la enfermedad en las poblaciones hospedadoras. En la quinta edición del Manual de animales acuáticos se ofrecen directrices detalladas. 40 Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006

9 Capítulo Requisitos para la vigilancia a efectos de reconocimiento internacional de la ausencia de infección 4.5. Análisis de datos El análisis de los resultados de las pruebas de un estudio deberá llevarse a cabo de acuerdo con las indicaciones de la sección B.3 y se tendrán en cuenta las siguientes consideraciones: El diseño del estudio; La sensibilidad y especificidad de la prueba o sistema de pruebas; La prevalencia de diseño (o prevalencias para las que se utiliza un diseño en varias fases; Los resultados del estudio Garantía de calidad Los estudios debe incluir un sistema de garantía de calidad documentado, para asegurarse de que los procedimientos de campo y otros se ajustan al diseño de estudio especificado. Los sistemas aceptables pueden ser muy sencillos, siempre que aporten una documentación verificable de los procedimientos y controles básicos para detectar cualquier desviación significativa de los procedimientos con respecto a los procedimientos que se documentan en el diseño del estudio. 5. REQUISITOS ESPECÍFICOS CON RESPECTO A FUENTES DE DATOS COMPLEJAS DISTINTAS DEL ESTUDIO Las fuentes de datos que proporcionan pruebas de la ausencia de infección, pero no se apoyan en estudios estructurados basados en una población, también pueden utilizarse para demostrar la ausencia de infección ya se utilicen en exclusiva o en combinación con otras fuentes de datos. Se pueden utilizar diferentes metodologías para el análisis de tales fuentes de datos, pero la metodología empleada debe cumplir con las directrices de la sección B.3. En el enfoque utilizado también debe tenerse en cuenta cualquier falta de independencia estadística entre las distintas observaciones. Las metodologías analíticas que se basan en el empleo de las estimaciones de la probabilidad por pasos para describir el sistema de vigilancia pueden determinar la probabilidad de cada paso mediante uno de los dos procedimientos siguientes: Mediante el análisis de los datos disponibles, utilizando una metodología con validez científica o, si no hay datos disponibles, Mediante la utilización de las estimaciones basadas en la opinión de los expertos que se recogen y combinan en una metodología documentada y con validez científica. Cuando existe una incertidumbre significativa/o variabilidad en las estimaciones del análisis, se deben utilizar modelos estocásticos u otras técnicas equivalentes para evaluar el impacto de esa duda y/o variabilidad de relativa a las estimaciones finales de la confianza. PARTE 2 EJEMPLOS DE SISTEMAS DE VIGILANCIA Los siguientes ejemplos sirven para describir los sistemas de vigilancia y los enfoques para el análisis de la evidencia que reúnen los requisitos de la Parte 1 de este capítulo. El propósito de estos ejemplos es: ilustrar la variedad de enfoques que pueden considerarse como aceptables, proporcionar una guía práctica y unos modelos que pueden utilizarse para el diseño de sistemas específicos de vigilancia; y proporcionar referencia a las fuentes disponibles que sean útiles para el desarrollo y análisis de sistemas de vigilancia. Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos

10 Chapter Requisitos para la vigilancia a efectos de reconocimiento internacional de la ausencia de infección Aunque estos ejemplos ponen de manifiesto las formas de demostrar con éxito la ausencia de infección, no se pretende que los procedimientos ilustrados sean obligatorios. Los países son libres de utilizar enfoques diferentes a condición de que cumplan con los requisitos de la Parte 1 de este capítulo. Los ejemplos tratan del empleo de estudios estructurados y se han designados para ilustrar diferentes diseños de estudio, esquemas de muestreo, el cálculo del tamaño de la muestra y el análisis de resultados. Es importante advertir que actualmente se están desarrollando, y pronto aparecerán publicados 4. Otros enfoques alternativos para demostrar la ausencia de infección mediante el empleo de fuentes complejas de datos no basadas en estudios. EJEMPLO 1 ESTUDIO ESTRUCTURADO DE UNA FASE (ACREDITACIÓN DE UNA PISCIFACTORÍA) Contexto Una industria de acuicultura de agua dulce que cría peces en estanques ha establecido un esquema de acreditación de piscifactorías. Este implica la demostración de la ausencia de infección por una enfermedad hipotética concreta (Enfermedad X) a nivel de piscifactoría. La enfermedad no se extiende con mucha rapidez, y es más frecuente en los meses de invierno, siendo los más gravemente afectados los peces adultos al final del ciclo de producción. Las piscifactorías constan de un número de tanques de crecimiento, en número que varía de 2 a 20, y cada tanque tiene entre y peces. Objetivo El objetivo es implementar la vigilancia que sea capaz de proporcionar evidencia de que una piscifactoría concreta está libre de la Enfermedad X (el tema de la ausencia en un país o una zona, como contrapuestos a la ausencia para una piscifactoría se tratará en el capítulo siguiente.) Enfoque El esquema de acreditación establece un conjunto de procedimientos operativos estandarizados y los requisitos para el reconocimiento de la ausencia de infección basados en las directrices del presente capítulo. Estos requieren que en las piscifactorías se realicen estudios estructurados capaces de ofrecer una confianza del 95% de que la enfermedad sea detectada en caso de hallarse presente. Una vez que se hayan investigado las piscifactorías sin que se detecte la enfermedad, se las reconocerá como libres de infección siempre que mantengan un mínimo conjunto de normas de bioseguridad. Esas normas están diseñadas para evitar la aparición de la enfermedad en la piscifactoría (mediante la implementación de controles específicos de la forma de propagarse esa enfermedad), y para garantizar que la enfermedad se detecte rápidamente en caso de que se produzca en la piscifactoría (basándose en la evidencia del mantenimiento de un registro sanitario adecuado y la pronta investigación de episodios inusuales de la enfermedad). La implementación efectiva de estas medidas de bioseguridad se evalúa mediante inspecciones anuales de la piscifactoría realizada por inspectores independientes. Estándares del estudio Basándose en las directrices ofrecidas en el presente capítulo, se ha establecido un conjunto de estándares para realizar estudios tendentes a demostrar la ausencia de infección por el agente patógeno de la Enfermedad X. Esos estándares son: El nivel de confianza exigido para el estudio es del 95% (es decir, error de Tipo I = 5%). La potencia del estudio establece de forma arbitraria en el 95% (i.e. error de Tipo II = 5%, lo que significa que hay un 5% de probabilidades de concluir que una piscifactoría libre de la enfermedad esté infectada.). 4 International EpiLab, Denmark, Research Theme 1: Freedom from disease Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006

11 Capítulo Requisitos para la vigilancia a efectos de reconocimiento internacional de la ausencia de infección La población diana son todos los peces de la piscifactoría. Debido a los patrones de la enfermedad en este sistema de producción, en el que sólo los peces en fase final de crecimiento están afectados y que sólo lo están en invierno, la población del estudio se define como formada por los peces adultos durante los meses de invierno. Se considera el tema del agrupamiento. Como los peces se agrupan en tanques, es lógico pensar que estos constituyen el primer nivel de agrupamiento. No obstante, cuando se infecta una piscifactoría, la enfermedad suele aparecer en varios tanques, de manera que tal hecho aún no implica la presencia de un agrupamiento fuerte. Además, si la piscifactoría tiene pocos tanques, será difícil definir la prevalencia de diseño a nivel de tanque. (i.e. la proporción de tanques infectados que el estudio debe poder detectar en la piscifactoría). Por estos motivos, se tiene que tratar a toda la población de peces en engorde de cada piscifactoría como una única población homogénea. También se considera la estratificación. A fin de asegurar una plena representatividad, el tamaño de la muestra se estratificará por tanques, en proporción a la población de cada tanque. La prevalencia de diseño a nivel de animal se determina en base a la epidemiología de la enfermedad. Sin embargo, la enfermedad no se extiende con rapidez en una población diana definida; se ha informado de que afecta al menos a un 10% de los peces en caso de que la población se infecte. Siguiendo el criterio más conservador, se utilizará una prevalencia de diseño que se establecerá un tanto arbitrariamente en un 2%. Podría utilizarse una prevalencia del 10% (con lo que el resultado sería un tamaño de muestra mucho más pequeño), pero las autoridades no están convencidas ante la idea de que puede que la población esté infectada a un nivel de, por ejemplo, el 5%, y aún así siga sin detectarse la enfermedad. La prueba utilizada conlleva un muestreo que implica la destrucción de los peces, y se basa en el enzimoinmunoensayo (ELISA). La enfermedad X está presente en algunas zonas del país (de ahí la necesidad de un programa de acreditación a nivel de piscifactoría). Eso nos permite evaluar la sensibilidad y especificidad del ELISA en poblaciones similares a las de las piscifactorías. En un estudio reciente (en el que se utilizó una combinación de histología y cultivo como prueba de referencia, se estimó la sensibilidad del ELISA en un 98% (con un intervalo de confianza del 95% de %), y la especificidad en un 99.4% (con el intervalo %). Debido a los intervalos de confianza relativamente estrechos, se decidió emplear estimaciones puntuales de la sensibilidad y especificidad en lugar de complicar los cálculos con la toma en consideración de la falta de certeza que se llevó a cabo en aquellas estimaciones. Tamaño de la muestra El tamaño de la muestra necesaria para cumplir con los objetivos del estudio se calcula teniendo en cuenta el tamaño de la población, la realización de la prueba, la confianza requerida y la prevalencia de diseño. Dado que la población de cada piscifactoría es relativamente grande, es muy pequeña la influencia de las diferencias de tamaño de cada piscifactoría en el cálculo del tamaño de la muestra. El resto de parámetros necesarios par calcular el tamaño de la muestra se determina para todas las piscifactorías. Por lo tanto, se calcula un tamaño estándar (basado en la utilización de este ELISA concreto, en esta población). Para el cálculo del tamaño de las muestras se utiliza el software 5 FreeCalc. Basado en los parámetros listados anteriormente, el tamaño requerido de muestra se establece en 410 peces por piscifactoría. Además, el programa calcula que, a pesar de que la especificidad es imperfecta, la prueba puede producir hasta cinco reactivos positivos falsos de una población no infectada utilizando ese tamaño de muestra. Como a las autoridades no les gusta tener que tratar con reactivos positivos falsos, se ha decidido cambiar el sistema de prueba, incluyendo una prueba confirmativa para cualquier reactivo positivo. Se elige el cultivo como la prueba más adecuada, ya que su especificidad alcanza el 100%. No obstante, la sensibilidad es de sólo 90% debido a la dificultad de cultivar el organismo. 5 FreeCalc Cameron, AR. Software para el cálculo del tamaño de la muestra y el análisis de estudios realizados para demostrar la ausencia de la enfermedad. Disponible mediante descarga gratuita desde la página Web Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos

12 Chapter Requisitos para la vigilancia a efectos de reconocimiento internacional de la ausencia de infección Como ahora se utilizan dos pruebas, se debe calcular el sistema de prueba, y el tamaño de la muestra se calcula de nuevo en base a la realización del sistema de prueba. Utilizando esa combinación de pruebas (en la que una muestra se considera positiva sólo si resulta positiva en las dos pruebas), la especificidad de las dos pruebas combinadas se puede calcular mediante la fórmula: Esp ( ) Combinada = Esp1 + Esp2 Esp1 Esp2 que produce una especificidad combinada de 1 + 0,994 (1 0,994) = 100% La sensibilidad puede calcularse con la fórmula: Se Combinada Se Se = 1 que produce una sensibilidad combinada de 0,9 0,98 = 88,2% Estos nuevos valores se usan para calcular el tamaño muestral del estudio y da un resultado de 169 peces. Conviene resaltar que los intentos de mejorar la realización de una prueba (en el presente caso, se trataría de mejorar la especificidad), por lo general, provocan un peor resultado en otras variables (en el presente ejemplo, una peor sensibilidad). No obstante, en nuestro caso, la pérdida de sensibilidad se compensa con creces por el menor tamaño muestral gracias a una mayor especificidad. También conviene apuntar que, si se utiliza un sistema de prueba de un 100% de especificidad, la potencia efectivo del estudio será siempre del 100%, con independencia de la cantidad utilizada en el diseño. Eso se debe a la imposibilidad de cometer un error del tipo II, y de concluir que la piscifactoría está infectada en los casos en que no lo está realmente. Es conveniente comprobar el impacto del tamaño de la población en el cálculo del tamaño de la muestra. El cálculo del tamaño muestral está basado en una población de tamaño infinito. Si el tamaño de la población es menor, su impacto en el tamaño de la muestra es el que aparece en el siguiente cuadro: Tamaño de la población Tamaño de la nuestra Sobre la base de esos cálculos, está claro que los tamaños de población apenas influyen en el tamaño de las muestras correspondientes. A efectos de simplificación, se utiliza un tamaño estandarizado de muestra de 169, con independencia del número de peces adultos de la piscifactoría. Muestreo La elección individualizada de peces para la muestra debe llevarse a cabo de tal forma que la muestra sea lo más representativa posible de la población estudiada. En el Survey Toolbox 6, se ofrece una descripción más detallada de como conseguir esa representatividad en circunstancias diversas. Para ilustrar estas cuestiones, utilizaremos el supuesto de una única piscifactoría. 6 Survey Toolbox for Aquatic Animal Diseases A Practical Manual and Software Package. Cameron A.R. (2002). Australian Centre for International Agricultural Research (ACIAR), Monograph No. 94, 375 pp. ISBN Versión impresa disponible en ACIAR ( Versión electrónica para descarga gratuita disponible en 44 Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006

13 Capítulo Requisitos para la vigilancia a efectos de reconocimiento internacional de la ausencia de infección Supongamos que hay una piscifactoría de 8 tanques, de los que cuatro se usan para el engorde. En el momento del estudio (realizado en invierno), los cuatro tanques de engorde tienen 1.850, 4.250, y peces, respectivamente, lo que arroja una población total de de peces de cultivo. Es probable que un muestreo simple al azar de toda esa población tenga tamaños muestrales para cada tanque que guarden cierta proporción con el número de peces de cada tanque. No obstante, el muestreo estratificado y proporcional garantizará que a cada tanque tendrá una representación proporcional. Para ello tan sólo se precisa dividir el tamaño de la muestra entre los tanques de forma proporcional a la población de cada uno de ellos. El primer tanque tiene peces de un total de , lo que representa el 12.13%. De ahí que se debería tomar del primer tanque un 12,13% de la muestra (21 peces). Por el mismo procedimiento, el tamaño muestral para cada uno de los demás tanques sería 47, 47 y 54 peces, respectivamente. Una vez establecida la muestra para cada tanque, el siguiente punto es cómo elegir los 21 peces de un tanque de para que sean representativos de la población. Existen varias opciones: Si los peces se pueden manejar de forma individualizada, se puede utilizar el muestreo aleatorio sistemático. Eso es lo que probablemente ocurre cuando, por ejemplo: La recolección de los peces se realiza en invierno, en cuyo caso las muestras pueden obtenerse durante la recolección; o Las actividades de rutinarias de manejo (como la clasificación o la vacunación) se realizan en invierno. Durante el manejo de los peces, el muestreo sistemático consistiría en la selección de un pez a intervalos regulares. Por ejemplo, para seleccionar 21 de un total de 1.850, el intervalo de selección muestral será 1850/21 = 88. Eso significa que, de cada 88 peces manipulados, se debe seleccionar el que se haya manipulado en último lugar. Para asegurar que la muestra es aleatoria, un buen procedimiento es escoger aleatoriamente un número entre 1 y 88 (en nuestro caso supuesto) para escoger el primer pez (por ejemplo, mediante una tabla de números aleatorios), y a continuación escoger cada pez que ocupe el número 88. En caso de que los peces no se puedan manipular de forma individualizada (siendo este supuesto el más común) deben capturarse en los tanques los peces que integrarán la muestra. Esa captura debe realizarse de la forma más efectiva y práctica posible, garantizando por todos los medios posibles la representatividad de la muestra. En nuestro ejemplo, el método normal de captura es el uso del salabardo. Mediante el salabardo, un muestreo fácil implicaría la captura de 21 peces mediante inmersiones sucesivas en un lugar y la toma de los peces más fáciles de capturar (quizás los más pequeños). No se recomienda en absoluto esta práctica. Una forma de incrementar la representatividad es realizar la captura en diferentes puntos del tanque unas veces en un extremo del mismo, otras a un lado, otras al otro extremo, otras en el centro, otras en los bordes. Cuando los peces son de tamaño diferente, se debe intentar por todos los medios que los peces de diferentes tamaños tengan la misma posibilidad de ser capturados (i.e. no se deben capturar sólo los pequeños sino también los grandes). Este procedimiento de recogida de muestras no es ni mucho menos el ideal y más representativo de de lo que constituye un muestreo aleatorio, pero dada la dificultad práctica de realizar el muestreo aleatorio de peces de forma individualizada, nuestro enfoque es aceptable siempre que se hagan esfuerzos genuinos y plenamente documentados por aumentar la representatividad de la muestra. Realización de las pruebas Los ejemplares se recogen, se procesan y se ensayan siguiendo procedimientos estandarizados que se han elaborado según un programa de acreditación y se han designado para que cumplan los requisitos del presente Manual de animales acuáticos. Según el protocolo de las pruebas, es preceptivo que cualquier ejemplar positivo a la prueba de ELISA sea sometido a cultivo, y que cualquier resultado positivo de un Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos

14 Chapter Requisitos para la vigilancia a efectos de reconocimiento internacional de la ausencia de infección cultivo indica que un ejemplar es realmente positivo (es decir, que la piscifactoría no está libre de la enfermedad). Es importante seguir ese protocolo al pie de la letra. Si se halla un cultivo positivo, no es procedente someterlo a un nuevo ensayo, salvo que se indique lo contrario en el protocolo original de la pruebas, y se registre el impacto de tales pruebas en las estimaciones de la especificidad y sensibilidad del sistema de prueba (y por lo tanto, en el tamaño de la muestra). Análisis En caso de utilizarse un tamaño calculado de muestra de 169, y no se hallan reacciones positivas, la muestra tendrá un margen de confianza del 95%. Esto puede confirmarse por un análisis de resultados en el que se utilice los programas de FreeCalc mencionados con anterioridad (en el que se especifica un nivel de confianza de 95.06%). En algunos caso puede suceder que el estudio no se realice tal como se planificó, y que el tamaño de la muestra sea inferior al tamaño muestral diana. Sin embargo, puede que el tamaño de la piscifactoría también sea menor. En tales casos, es aconsejable analizar los datos de cada piscifactoría por separado (una a una). Por ejemplo, si se sólo se recogen 165 ejemplares de una piscifactoría que tiene sólo peces, la confianza correspondiente sería aún del 95%. Si se recogen sólo 160 peces, la confianza será de sólo el 94.5%. Si se emplea, de forma rígida una confianza meta del 95%, el presente estudio sería incapaz de cumplir con esa meta y se precisaría una evidencia más amplia. EJEMPLO 2 ESTUDIO ESTRUCTURADO EN DOS FASES (AUSENCIA A NIVEL NACIONAL) Contexto Un país pretende declarar que está libre de la Enfermedad Y de los crustáceos. La industria de ese país se basa en gran medida en estanques de pequeños propietarios, que se agrupan estrechamente dentro y alrededor de las aldeas. La enfermedad es bastante contagiosa y causa mortalidad masiva en un período que va desde la mitad del ciclo de producción hasta el final del mismo, los animales afectados se tornan moribundos y mueren en cuestión de días. Los animales afectados muestran pocas lesiones características, pero en un estanque infectado la mortalidad será casi siempre masiva, salvo que antes se realice la recolección de los peces. La mortalidad es más frecuente al final del verano, pero puede darse en cualquier época del año. También puede ocurrir ocasionalmente a comienzos del ciclo productivo. En ese país existen limitaciones en lo concerniente a la disponibilidad de instalaciones de laboratorio e infraestructura de transporte. Sin embargo, existe una estructura gubernamental relativamente amplia, y una red exhaustiva de funcionarios de piscifactorías. Objetivo El objetivo es establecer la ausencia de la Enfermedad Y a nivel nacional. El sistema de vigilancia debe cumplir con los requisitos de la Parte 1 del presente capítulo, pero tiene que poder ser implementada de forma práctica en el sistema de producción de pequeños propietarios. Enfoque Las autoridades de acuicultura deciden utilizar un estudio para obtener evidencia sobre la ausencia de enfermedad, utilizando un diseño de estudio en dos fases (primero muestreo a nivel de aldeas y después a nivel de estanques). No se consideran factibles las pruebas de laboratorio con ejemplares procedentes de un gran número de piscifactorías, así que se elabora un sistema de pruebas combinadas a fin de minimizar los gastos que conllevan las costosas pruebas de laboratorio. La unidad de observación y análisis es, en nuestro caso, el estanque en vez del animal individual. Eso quiere decir que el diagnóstico se realiza a nivel de estanque (un estanque infectado o uno no infectado) y no a nivel de animal. 46 Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006

15 Capítulo Requisitos para la vigilancia a efectos de reconocimiento internacional de la ausencia de infección Se trata, por tanto, de un estudio con el que se pretende demostrar que ninguna aldea está infectada (utilizando una muestra aleatoria de aldeas y realizando un diagnóstico a nivel de aldea). La prueba utilizada para realizar un diagnóstico a nivel de aldea es, de hecho, otro estudio con el que se pretende demostrar que ningún estanque de la villa está infectado. A continuación se realiza una prueba a nivel de estanque (si es preciso, a las observaciones del acuicultor siguen las pruebas de laboratorio). Estándares del estudio La confianza perseguida en el estudio es del 95%. La potencia se fija en el 95% (que puede llegar en la práctica al 100% cuando con el sistema de prueba utilizado se logra una especificidad del 100%, como se demostró en el ejemplo anterior). La población diana comprende todos los estanques del país repoblados con langostinos durante el periodo de estudio. La población estudiada es la misma, excluyendo la de zonas remotas de acceso imposible. Puesto que pueden darse brotes en cualquier época del año y en cualquier estadio del ciclo de producción, se decide no refinar más la definición de la población de cara a un momento o edad concretos. Se utilizan tres pruebas. La primera consiste en la observación del acuicultor para determinar si ocurre una mortalidad masiva en un estanque concreto. Si el estanque da positivo en la primera prueba (i.e. se detecta mortalidad masiva), se aplicará una segunda prueba. Esa prueba consiste en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los casos que resulten positivos por la PCR se someten a pruebas adicionales mediante la utilización de experimentos de transmisión. La observación del acuicultor puede considerarse una prueba como cualquier otra. En el presente caso, la observación de una mortalidad masiva se utiliza como prueba de la presencia de la Enfermedad Y. Puesto que existe una variedad de otras enfermedades capaces de provocar una mortalidad masiva, la prueba en cuestión no es muy específica. Por otra parte, puede que la Enfermedad Y sea bastante infrecuente y que no provoque mortalidad masiva, lo que indica que la prueba es bastante sensible. Se establece una definición de caso estándar de mortalidad masiva (por ejemplo, superior al 20% de la población de langostinos del estanque que se ha observado que están muertas en un periodo inferior a una semana). Basándose en esta definición, los acuicultores pueden diagnosticar la presencia de mortalidad masiva en cada estanque. Algunos acuicultores pueden ser muy sensibles y decidir que hay mortalidad masiva cuando sólo una pequeña cantidad de langostinos están muertas (positivos falsos, lo que conlleva una disminución de la especificidad), mientras que otro pequeño número de acuicultores pueden no percatarse de las mortalidades, con lo que disminuye la sensibilidad. Con el fin de cuantificar la especificidad y sensibilidad de la observación de la mortalidad masiva por parte de los acuicultores, se realiza otro estudio separado para la Enfermedad Y. Eso implica la realización de un estudio retrospectivo del número de eventos de mortalidad masiva en una población que se cree que está libre de la enfermedad, y también un estudio en el que se ofrece a los acuicultores una serie de escenarios de mortalidad, a fin de determinar su capacidad de identificar con precisión un estanque con mortalidad masiva. Combinando esos resultados, se estima que la sensibilidad de las mortalidades masivas descritas por los acuicultores como prueba de la Enfermedad Y es del 87% mientras que la especificidad es del 68%. Cuando un acuicultor detecta u estanque con mortalidad masiva, los ejemplares se recogen entre los langostinos moribundos siguiendo un protocolo establecido. Se recogen muestras de tejido de 20 langostinos, y se agrupan para la prueba de PCR. Se ha estudiado la capacidad de la PCR con muestras agrupadas para identificar un único animal infectado de un grupo de 20, y la sensibilidad de ese procedimiento es del 98.6%. En un estudio similar de ejemplares negativos se ha descrito que en ocasiones se han dado resultados positivos, probablemente debidos a la contaminación del laboratorio, pero quizás también se deban a la presencia de material genético no viable procedente de otras fuentes (se sospecha de material alimenticio elaborado con langostinos). La especificidad se estima, por tanto, en un 99%. Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos

16 Chapter Requisitos para la vigilancia a efectos de reconocimiento internacional de la ausencia de infección De acuerdo con algunos estudios publicados en otros países, la sensibilidad de las pruebas de transmisión, el tercer tipo de prueba a utilizar, es de 95%, lo que en parte se debe a la variación en la carga del agente en el material inoculado. Por lo que respecta a la especificidad, hay acuerdo en que es del 100%. Sobre la base de las cifras anteriores, la sensibilidad y especificidad del sistema de pruebas combinadas se calcula mediante la fórmula presentada en el Ejemplo 1, primero con las dos primeras pruebas, y luego con el efecto combinado de las dos primeras pruebas y de la tercera. El resultado es una sensibilidad del 81.5% y una especificidad del 100%. La prevalencia de diseño debe calcularse a dos niveles. En primer lugar, se determina la prevalencia de diseño a nivel de estanque (la proporción de estanques de la aldea que estarían infectados en caso de haber enfermedad). En los países colindantes en los que hay infección, la experiencia ha demostrado que los estanques que están en estrecho contacto mutuo se infectan rápidamente. Es infrecuente que en una aldea infectada tenga menos del 20% de los estanques infectados. Desde una posición un tanto conservadora, se utiliza una prevalencia del 5%. El segundo valor de prevalencia de diseño se aplica a nivel de aldea, es decir, la proporción de aldeas infectadas identificables en el estudio. Se utiliza un valor del 1%, ya que es razonable pensar que la infección pueda persistir en un área local sin extenderse rápidamente a otras partes del país. Se considera que este es el valor de prevalencia de diseño más bajo para el que resulta práctico diseñar un estudio. La población de las aldeas de un país es de , según cifras oficiales del gobierno. Las que tienen estanques de langostinos totalizan , según los registros de las autoridades de acuicultura. Dichos registros se elaboran mediante un censo agrícola quinquenal, y se actualiza anualmente a partir de los informes de los funcionarios de los establecimientos de acuicultura. No está registrado el número de estanques en cada una de las aldeas. Tamaño de la muestra Se calcula el tamaño de la muestra para los dos niveles de muestreo, en primer lugar el número de aldeas que se contempla en la muestra y luego el número de estanques que hay que muestrear. El número de aldeas de la muestra depende de la sensibilidad y especificidad de la prueba utilizada para clasificar las aldeas como infectadas o no infectadas. Como la prueba utilizada en cada aldea constituye un estudio en sí mismo, la sensibilidad es igual a la confianza y la especificidad equivale a la potencia del estudio a nivel de aldea. Es posible ajustar la confianza y la potencia cambiando el tamaño de la muestra en el estudio a nivel de aldea (número de estanques examinados), lo que equivale a decir que podemos determinar, dentro de ciertos límites, la sensibilidad y especificidad alcanzables. Eso permite un enfoque flexible del cálculo del tamaño de la muestra. Si se desea un menor tamaño de muestra de primer nivel (un menor número de aldeas), se necesitan una sensibilidad y especificidad muy altas, lo que significa que es mayor el número de estanques de cada aldea que ha de someterse a examen. Un número menor de estanques dará por resultado una sensibilidad y especificidad más bajas, necesitándose un número mayor de aldeas. En Survey Toolbox se describe el enfoque necesario para determinar la combinación óptima (la de menor coste) de los tamaños muestrales de primer y segundo nivel. El hecho de que cada aldea tenga un diferente número de estanques supone una complicación adicional. Con el fin de obtener la misma (o similar) confianza y potencia para cada aldea (sensibilidad y especificidad), puede que se requiera un tamaño muestral diferente. Las autoridades prefieren elaborar una tabla de tamaños muestrales de cara al número de estanques que se han de muestrear en cada aldea, que están basados en el número total de estanques de cada aldea. A continuación se ofrece el ejemplo de un posible enfoque en la determinación del tamaño muestral: La sensibilidad diana (confianza) lograda en cada estudio a nivel de aldea es del 95%. La especificidad diana es del 100%. Utilizando el programa FreeCalc, con una prevalencia de diseño del 1% (con el estudio 48 Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006

17 Capítulo Requisitos para la vigilancia a efectos de reconocimiento internacional de la ausencia de infección se puede detectar la enfermedad si el 1% o más de las aldeas están infectadas), el tamaño de la muestra del primer nivel se calcula en 314 aldeas. Dentro de cada aldea, la prueba a utilizar es el sistema de pruebas combinadas mencionado con anterioridad, con una sensibilidad del 81,5% y una especificidad del 100%. Sobre la base de esas cifras, se ha compilado la siguiente tabla con el listado de la cantidad de estanques que deben integrar la muestra a fin de conseguir una sensibilidad del 95%. Muestreo Población Tamaño de la muestra El muestreo de primer nivel se lleva a cabo usando números aleatorios y un marco de muestreo basado en la lista de aldeas con estanques de langostinos que obra en poder de las autoridades de las piscifactorías. La lista de aldeas aparece en una hoja de cálculo en la que aparece numerada cada aldea del 1 al Se utiliza una tabla de números aleatorios (como la que se incluye en Survey Toolbox) o programas diseñados para producir números aleatorios (como EpiCalc 7 ). El segundo nivel de muestreo conlleva la selección aleatoria de estanques dentro de cada aldea. Para ello se requiere un marco de muestreo, o una lista de cada estanque de la aldea. Para la coordinación del estudio, las autoridades de los establecimientos de acuicultura emplean funcionarios entrenados de los establecimientos de acuicultura locales. Por cada aldea seleccionada, el funcionario cursa una visita a la misma y convoca a una reunión a todos los acuicultores de langostinos. En esa reunión, se les pregunta por el número de estanques de su propiedad, se recaba una lista con los nombres de los acuicultores y se compila el número de estanques. De esa lista se selecciona una muestra aleatoria simple del número adecuado de estanques (entre 29 y 70, según la tabla anterior, dependiendo del número de estanques de la aldea). Eso se hace bien utilizando soporte lógico (como el programa RandomAnimal [AnimalAleatorio] de Survey Toolbox), o bien manualmente con una tabla de números aleatorios o con dados decimales para la 7 Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos

18 Chapter Requisitos para la vigilancia a efectos de reconocimiento internacional de la ausencia de infección selección de los números aleatorios. Los detalles de este procedimiento se describen en Survey Toolbox. En este proceso de selección se identifica un estanque particular en términos de nombre del propietario y la secuencia de números entre los estanques que poseen (ej. 3er estanque del Sr. García). La identificación de cada estanque concreto se basa en el sistema de numeración de estanques que utilizan los propietarios. Las pruebas Una vez identificados los estanques, el estudio consiste en el ensayo de esos estanques. En la práctica, eso significa que los acuicultores observen los estanques durante un ciclo entero de producción. El funcionario local de establecimientos de acuicultura visita a los acuicultores una vez por semana para verificar si en alguno de los estanques seleccionados se ha producido mortalidad masiva. Si ese es el caso en alguno de ellos (i.e. la primera prueba resulta positiva), se recogen 20 langostinos moribundos para su examen en el laboratorio (en primer lugar, mediante PCR, y a continuación, si el resultado es positivo, mediante experimentos de transmisión). Análisis El análisis se lleva a cabo en dos fases. En primer lugar se analizan los resultados de cada aldea para asegurarse de que alcanzan el nivel de confianza necesario. Si se consigue el tamaño diana de la muestra (y sólo se obtienen resultados negativos), la confianza deberá ser del 95% o más en cada aldea. En la siguiente fase, se analizan los resultados de cada aldea para obtener el nivel de confianza a nivel de país. Si se logra, una vez más, el tamaño diana de la muestra (número de aldeas) el nivel de confianza debería ser superior al 95%. EJEMPLO 3 EL MUESTREO ESPACIAL Y EL USO DE PRUEBAS CON ESPECIFICIDAD IMPERFECTA Contexto Un país tiene una industria de acuicultura de ostras constituida, sobre todo, por la acuicultura de ostras con bastidores en 23 estuarios distribuidos a lo largo de la costa. En regiones similares de otros países, la Enfermedad Z causa mortalidades al final del verano/comienzo del otoño. Durante el brote de la enfermedad, se ve afectada una gran proporción de ostras; no obstante se sospecha que el agente puede estar presente a una prevalencia relativamente baja en ausencia de brotes de la enfermedad. Objetivo Las autoridades nacionales quieren demostrar la ausencia de la Enfermedad Z a nivel nacional. Si se detectase la enfermedad, un objetivo secundario del estudio sería la aportación de evidencia adecuada para apoyar la distribución por zonas a nivel de estuario. Enfoque Las autoridades llegan a la conclusión que la vigilancia clínica de los brotes de la enfermedad es adecuada en vista de la posibilidad de infecciones subclínicas de bajo nivel. Por tanto se decide fundamentar la vigilancia con un estudio de dos fases, en el que las ostras de la muestra se someten a pruebas de laboratorio. La primera fase del estudio consiste en la selección de los estuarios. Sin embargo, debido al objetivo de proporcionar evidencia para la distribución por zonas (en caso de detectarse la enfermedad en cualquiera de los estuarios), se decide utilizar un enfoque censal y muestrear cada estuario. Esto quiere decir, en esencia, que se realizarán 23 estudios separados, uno por cada estuario. Se contempla una gama de opciones para el muestreo de las ostras, incluyendo el muestreo durante la su recolección o su venta, o utilizando las granjas (arrendamiento de ostras) como nivel de muestreo o estratificación. Sin embargo el tiempo álgido de actividad del agente no se corresponde con el período de recolección, y la utilización de las piscifactorías significaría la exclusión de cantidades considerables de ostras silvestres que habitan en los estuarios. Por tanto se decide intentar la simulación de un muestreo aleatorio simple de toda la población de ostras del estuario, utilizando un enfoque de muestreo espacial. 50 Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006

19 Capítulo Requisitos para la vigilancia a efectos de reconocimiento internacional de la ausencia de infección Estándares del estudio La población diana está formada por todas las ostras de cada uno de los estuarios. La población del estudio la constituyen las ostras que están presentes durante el periodo álgido de riesgo de enfermedad al final del verano o comienzo del otoño. Las ostras silvestres y las de cultivo son susceptibles de padecer al enfermedad, y pueden conllevar diversos (aunque desconocidos) riesgos de infección. Por lo tanto, se incluye a ambas en la población a estudiar. Tal como se describe más adelante, el muestreo se basa en el mapeo. Por tanto, se puede describir la población del estudio de forma más precisa como la población que se halla dentro de las zonas mapeadas que se han identificado como habitats de ostras. El valor de prevalencia de diseño sólo se necesita a nivel de ostras (ya que a nivel de estuario se utiliza un censo). Mientras que a menudo se reconoce la enfermedad con una prevalencia muy alta durante los brotes de la misma, se utiliza un valor bajo para el caso de que el agente siga presente sin acompañamiento de signos clínicos. Se aplica una prevalencia del 2%. La prueba se utiliza en histopatología aplicando técnicas de inmunotinción. Se sabe que en algunas ocasiones esta prueba produce resultados positivos falsos debidos a la tinción inespecífica, pero es muy sensible. En algunas publicaciones se indican valores de 99.1% para la sensibilidad y 98.2% para la especificidad. No se dispone de otras pruebas que resulten prácticas. Eso quiere decir que no es posible distinguir de una forma definitiva los resultados positivos falsos de los positivos verdaderos, y que, sea cual sea el tamaño de la muestra, son de esperar algunos positivos falsos. (i.e. 1.8%). La confianza se fija al 95% y la potencia al 80%. En los ejemplos previos, dado que se asumía una especificidad del 100%, lograda por el uso de varias pruebas, el poder efectivo era del 100%. En este caso, con una especificidad imperfecta, existirá un riesgo de concluir falsamente que un estuario saludable está infectado; por lo tanto el poder no es del 100%. La elección de una cifra relativamente baja (80%) significa que hay una posibilidad de 1 en 5 de llamar erróneamente a un estuario infectado cuando no está infectado, pero también reduce mucho el coste del estudio, mediante un tamaño de muestra menor. Tamaño de la muestra Basándonos en el supuesto de que el procedimiento de muestreo será de tipo aleatorio simple, puede calcularse el tamaño de la muestra (número de ostras incluidas en la muestra por cada estuario) mediante FreeCalc. Se asume que el tamaño de la población (número de ostras por estuario) es muy grande. El tamaño calculado de la muestra, utilizando las cifras de sensibilidad, especificidad y prevalencia de diseño, es 450. De a cuerdo con los resultados del FreeCalc, basados en este tamaño de muestra y en la especificidad de la prueba, es posible obtener 10 o menos resultados de prueba positivos falsos y aún así llegar a la conclusión de que la población está libre de la enfermedad. Ello se debe a que, si la población estuviese infectada a una prevalencia del 2% o más, el número de reactivos positivos que cabría esperar de una muestra de 450 sería mayor de 10. De hecho, serían de esperar 9 positivos verdaderos (450 2% 99.1%) y 8 positivos falsos (450 98% 1.8%) o un total de 17 positivos si la población estuviese infectada a una prevalencia del 2%. Lo anterior sirve para ejemplificar como la teoría de la probabilidad y un tamaño de muestra adecuado pueden ayudarnos a distinguir entre resultados positivos verdaderos y positivos en los casos en que no cabe otra alternativa que no sea la utilización de una prueba de especificidad imperfecta. Muestreo El objetivo es recoger una muestra de 450 ostras que representan un estuario completo. El muestreo aleatorio simple depende de la creación de un marco de muestreo en el que aparezca listada cada ostra (algo imposible) y el muestreo sistemático depende de si se es capaz de (al menos conceptualmente) alinear todas las ostras (de nuevo, algo imposible). Las autoridades deciden utilizar un muestreo espacial como lo más cercano a un muestreo aleatorio simple. El muestreo espacial implica la selección de puntos Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos

20 Chapter Requisitos para la vigilancia a efectos de reconocimiento internacional de la ausencia de infección aleatorios (definidos por coordenadas) y luego seleccionar ostras cercanas a los puntos elegidos. A fin de evitar la selección de demasiados puntos en torno a los que no haya ostras, primero se mapea el estuario (las autoridades de los establecimientos de acuicultura ya tienen mapas digitales en los que constan las concesiones de ostras disponibles). Se añaden a esos mapas las áreas con concentraciones significativas de ostras silvestres, ayudándose de expertos locales. Se generan pares de números aleatorios de tal forma que el punto definido esté incluido en las áreas de ostras delimitadas. Se contemplan otros esquemas (incluida la utilización de una cuerda marcada a intervalos regulares, extendida sobre una concesión para definir una transección, y recogiendo las ostras cercanas a cada marca de la cuerda) pero se adopta el enfoque de coordinada aleatoria. A continuación, los equipos que intervienen en le estudio visitan cada punto en lancha (utilizando un sistema GPS [sistema de radionavegación por satélite] para fijar la ubicación). Se dispone de una variedad de estrategias para determinar qué ostras se deben seleccionar en zonas densamente pobladas, pero con cualquiera de ellas debe procurarse que la selección sea aleatoria. El personal del estudio se inclina por un enfoque simple: cuando el receptor del GPS indique que se ha llegado al lugar o punto, se lanza un guijarro al aire, y se selecciona la ostra más cercana al punto en que el guijarro toca el agua. Mientras que las ostras se disponen verticalmente (ej. ostras silvestres que crecen sobre un poste), se utiliza un enfoque sistemático para determinar la profundidad a la que se halla la ostra que se va a seleccionar. Primero una ostra cercana a la superficie, después una ostra a profundidad media y finalmente una ostra a la mayor profundidad a la que se pueda acceder desde la lancha. Con este enfoque se corre el riesgo de que se produzca un sesgo orientado hacia zonas poco pobladas, por lo que ha de hacerse una estimación de la densidad relativa de ostras en cada punto del muestreo a fin de ponderar los resultados (ver Survey Toolbox para más detalles). Las pruebas Se recogen, procesan y analizan los ejemplares siguiendo un procedimiento estandarizado. Se clasifican los resultados como positivos definitivos (indicados por una fuerte coloración característica, que puede darse asociada con lesiones de tejidos), positivos probables (según las probabilidades), pero con coloración menos definida, y negativos. Análisis La interpretación de los resultados de una prueba de especificidad imperfecta se basa en el supuesto de que, a fin de concluir que la población está libre de infección, cualquier resultado positivo identificado es realmente un positivo falso. Con un tamaño de muestra de 450, son de esperar hasta 10 positivos falsos aunque se pueda concluir que la población está libre de la enfermedad. Sin embargo, si hay pruebas razonables de que existe un positivo verdadero, no se podrá afirmar que la población está libre de infección. Esa es la razón por la que los resultados positivos se clasifican en definitivos y probables. Si por casualidad se dan resultados positivos definitivos, se debe considerar a la población de ese estuario como infectada Los positivos probables son congruentes con los positivos falsos, y, por tanto, se pueden aceptar hasta 10. Mediante FreeCalc se puede calcular la confianza real que se ha obtenido sobre la base del número de (presuntos) positivos falsos detectados. Por ejemplo, se detectasen 8 resultados positivos probables en un estuario, el nivel de confianza del estudio sería del 98.76%. Por otro lado, si se detectasen 15 resultados positivos probables, la confianza sería de sólo el 61.9%, lo que indica que es probable que el estuario esté infectado. Discusión Normalmente, puede resultar seguro el asumir una especificidad del 100% para un sistema de vigilancia cuyo objetivo es demostrar la ausencia de enfermedad. Eso es debido a que se investiga cualquier sospecha de la existencia de la enfermedad hasta que se pueda formular una conclusión definitiva. Si la conclusión es que el caso investigado constituye un auténtico caso de enfermedad, entonces ya no será una cuestión de declaración de ausencia puesto que se sabe que hay enfermedad. Este ejemplo lleva aparejada una situación diferente, en la que, debido a la inexistencia de pruebas adecuadas, es imposible 52 Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006