Int. Cl. 7 : A61K 35/ Agente: Ungría López, Javier

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1 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 Número de publicación: Int. Cl. 7 : A61K 3/14 A61K 39/39 C12N /06 A61P 37/06 12 TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA T3 86 Número de solicitud europea: Fecha de presentación : Número de publicación de la solicitud: Fecha de publicación de la solicitud: Título: Tratamiento ex vivo de linfocitos T alogénicos y xenogénicos con la ayuda de antagonistas de gp Prioridad: US Titular/es: Regents of the University of Minnesota Morrill Hall, 0 Church Street S.E. Minneapolis, Minnesota 4, US Trustees of Dartmouth College 4 Fecha de publicación de la mención BOPI: Inventor/es: Noelle, Randolph, J.; Blazar, Bruce, R.; Vallera, Daniel, A. y Taylor, Patricia, A. 4 Fecha de la publicación del folleto de la patente: Agente: Ungría López, Javier ES T3 Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. Pº de la Castellana, Madrid

2 DESCRIPCIÓN Tratamiento ex vivo de linfocitos T alogénicos y xenogénicos con la ayuda de antagonistas de gp Campo de la invención Se proporcionan métodos para tratar tejido u órganos trasplantados (alogénicos o xenogénicos) ex vivo para hacer tolerantes las células T, contenidas allí dentro, hacia antígenos del donante (xenoantígenos o aloantígenos). El tejido u órgano tratado puede ser trasplantado a un receptor, con riesgo reducido de enfermedad de injerto contra huésped. Antecedentes de la invención Para inducir la activación de células T antígeno específicas y la expansión clonal, se tienen que liberar dos señales, proporcionadas por células presentadoras de antígenos (CPA), hacia la superficie de linfocitos T en reposo [Jenkins, M. y Schwartz, R. (1987) J. Exp. Med. 16, ; Mueller, D. L. y col. (1990) J. Immunol. 144, ; Williams, I. R. y Unanue, E. R. (1990) J. Immunol. 14, 8-93]. La primera señal, que otorga especificidad a la respuesta inmunológica, está mediada vía el receptor de células T (TCR) después de la identificación del péptido antigénico extraño representado en el contexto del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC). La segunda señal, denominada coestimulación, induce a que las células T proliferen y lleguen a ser funcionales [Schwartz, R. H. (1990) Science 248, ]. La coestimulación no es ni antígeno-específica ni restringida por MHC, y se cree que está proporcionada por una o más diferentes moléculas de la superficie celular expresadas por CPA [Jenkins, M. K. y col. (1988) J. Immunol. 140, ; Linsley, P. S. y col. (1991) J. Exp. Med. 173, ; Gimmi, C. D. y col. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, ; Young, J. W. y col. (1992) J. Clin. Invest. 90, ; Koulova, L. y col. (1991) J. Exp. Med. 173, ; Reiser, H. y col. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, ; van- Seventer, G. A. y col. (1990) J. Immunol. 144, ; LaSalle, J. M. y col. (1991) J. Immunol. 147, ; Dustin, M. I. y col. (1989) J. Exp. Med. 169, 03; Armitage, R. J. y col. (1992) Nature 37, 80-82; Liu, Y. y col. (1992) J. Exp. Med. 17, ]. Una vía coestimuladora involucrada en la activación de células T implica a la molécula CD28 en la superficie de las células T. Esta molécula puede recibir una señal coestimuladora liberada por un ligando en las células B u otras CPA. Los ligandos para CD28 incluyen miembros de la familia B7 de antígenos de la activación linfocitaria B tales como B7-1 y/o B7-2 [Freedman, A. S. y col. (1987) J. Immunol. 137, ; Freeman, G. J. y col. (1989) J. Immunol. 143, ; Freeman, G. J. y col. (1991) J. Exp. Med. 174, ; Freeman, G. J. y col. (1993) Science 262, ; Azuma, M. y col. (1993) Nature 366, 76-79; Freeman, G. J. y col. (1993) J. Exp. Med. 178, ]. El B7-1 y el B7-2 son también ligandos para otra molécula, CTLA4, presente en la superficie de células T activadas, aunque no está claro el papel de la CTLA4 en la coestimulación. La liberación a una célula T de una señal antígeno específica, con una señal coestimuladora, conduce a la activación de células T, la cual puede incluir la proliferación de células T y la secreción de citoquinas. Por contraste, se cree que la liberación a una célula T de una señal antígeno específica, en ausencia de una señal coestimuladora, induce un estado de no reactividad o anergia en la célula T, de ese modo induciendo tolerancia antígeno-específica en la célula T. Las interacciones entre las células T y las células B juegan un papel central en las respuestas inmunológicas. La inducción de inmunidad humoral hacia antígenos timodependientes requiere la ayuda proporcionada por células T ayudadoras (Th en lo sucesivo). Mientras que alguna ayuda proporcionada a los linfocitos B está mediada por moléculas solubles liberadas por células Th (por ejemplo, linfoquinas tales como IL-4 e IL-), la activación de las células B también requiere una interacción dependiente del contacto entre células B y células Th. Hirohata y col., J. Immunol. 140, (1988); Bartlett y col., J. Immunol., 143, (1989). Este indica que la activación de las células B implica una interacción obligatoria entre las moléculas de la superficie celular en las células B y las células Th. La molécula(s) en la célula T, por lo tanto, media las funciones efectoras ayudadoras, dependientes del contacto, de la célula T. Una interacción dependiente del contacto entre moléculas en las células B y las células T está apoyada además por la observación de que las membranas plasmáticas de células T activadas pueden proporcionar funciones ayudadoras necesarias para la activación de las células B. Brian, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8: (1988); Hodgkin y col., J. Immunol., 14: (1990); Noelle y col., J. Immunol., 146: (1991). Se ha identificado una molécula, CD40, en la superficie de linfocitos B inmaduros y maduros que, cuando se reticula mediante anticuerpos, induce la proliferación de células B. Valle y col., Eur J. Immunol., 19: (1989); Gordon y col., J. Immunol., 140: (1988); Gruber y col., J. Immunol., 142: (1989). La CD40 ha sido clonada y caracterizada molecularmente. Stamenkovic y col., EMBO J., (1989). También ha sido clonado y caracterizado molecularmente un ligando para CD40, gp39 (también llamado ligando CD40 o CD40L y, recientemente, CD4). Armitage y col., Nature, 37: (1992); Lederman y col., J. Exp. Med., 17: (1992); Hollenbaugh y col., EMBO J., 11: (1992). La proteína gp39 se expresa en células CD4 + Th activadas pero no en reposo. Spriggs y col., J. Exp. Med. 176: (1992); Lane y col., Eur. J. Immunol., 22: (1992); Roy y col., J. Immunol., 1: 1-14 (1993). Células transfectadas con el gen gp39, y expresando la proteína gp39 en su superficie, pueden desencadenar la proliferación de células B y, junto con otras señales estimuladoras, pueden inducir la producción de anticuerpos. Armitage y col., Nature, 37: (1992); Hollenbaugh y col., EMBO J., 11: (1992). 2

3 Breve descripción de la invención La enfermedad de injerto contra huésped (EICH) es un proceso destructivo del sistema multiorgánico causado por la infusión de células T alogénicas de donante en receptores. Debido a que la enfermedad grave de injerto contra huésped ocurre en el 20-40% de los receptores de injertos de donante hermano con HLA idéntico, y hasta en el 70-80% de receptores de injertos de donante no afín, se necesitan enfoques para prevenir esta complicación del trasplante de médula ósea. Hasta la fecha, se han utilizado dos tipos generales de estrategias. La primera implica la infusión in vivo de agentes inmunosupresores tales como la metatricida, la ciclosporina A, y los esteroides. Los casos anteriores de enfermedad grave de injerto contra huésped son aquellos observados durante la infusión in vivo de estos agentes inmunosupresores. Además de sus efectos protectores incompletos, estos agentes inmunosupresores conducen a periodos prolongados de inmunodeficiencia después del trasplante de médula ósea, de ese modo exponiendo al receptor a complicaciones infecciosas y aumentando potencialmente la incidencia de recaída después del trasplante de médula ósea. Un segundo enfoque general ha implicado la eliminación ex vivo de las células T del injerto del donante. Este enfoque, aunque razonablemente eficaz en prevenir la enfermedad grave de injerto contra huésped produce una mayor incidencia de fracaso del injerto, recaída, complicaciones infecciosas, y retrasa el tiempo de reconstitución inmunológica. Por contraste, la presente invención está dirigida a un método para tratar ex vivo células T de donante, para hacer tales células T sustancialmente no reactivas a antígenos alogénicos o xenogénicos en el trasplante dentro de un huésped. Más específicamente, la presente invención está dirigida a un método para tratar ex vivo células T de donante con una cantidad de al menos un antagonista del gp39 (CD4) y células o tejidos alogénicos o xenogénicos, para hacer tales células T sustancialmente no reactivas a antígenos de donante (aloantígenos o xenoantígenos) en el trasplante dentro de un huésped conteniendo tales células alogénicas o xenogénicas. La presente invención proporciona, de este modo, un medio eficaz para prevenir o inhibir las respuestas de la enfermedad de injerto contra huésped que, de otra manera, ocurrirían potencialmente en el trasplante de células T de donante, o tejidos u órganos conteniendo, por ejemplo, células de médula ósea o sanguíneas periféricas de donante dentro de un receptor. Preferentemente, las células T de donante serán incubadas ex vivo con una cantidad suficiente de anticuerpo antigp39 y células del receptor del trasplante, durante tiempo suficiente, para hacer las células T de donante sustancialmente no reactivas a células del receptor en el trasplante. Esto será llevado a cabo, generalmente, conduciendo una reacción linfocitaria mixta in vitro utilizando células T de donante y estimuladores portando aloantígenos o xenoantígenos mermados de células T del huésped. A este cultivo se añadirá un antagonista del gp39, preferentemente un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se una específicamente a gp39 (CD4). Alternativamente, el antagonista del gp39 puede constar de CD40 soluble o proteína de fusión CD40 soluble, por ejemplo, CD40Ig. Breve descripción de los dibujos La Figura 1 muestra el efecto del tratamiento con mab anti-cd40l de células T de donante en un cultivo MLR primario. 4 0 La Figura 2A muestra el efecto de la adición de mab anti-cd40l (gp39) en la producción de IL-2 en un cultivo MLR primario. La Figura 2B muestra el efecto de mab anti-cd40l hacia la producción de interferones gamma en un cultivo MLR primario. La Figura 3A demuestra que la inducción de hiporreactividad anti- aloantígenos del huésped, por mab anti-cd40l en cultivos secundarios, es reversible mediante IL-2 exógeno. La Figura 3B demuestra que las células T de donante, expuestas a mab anti-cd40 en un cultivo MLR primario, tienen respuestas íntegras a IL-2 en un cultivo secundario. La Figura 4A demuestra que la adición de mab anti-cd40l a un cultivo MLR primario inhibe la producción de IL-1, como se midió en un cultivo MLR secundario La Figura 4B demuestra que la adición de mab anti-cd40l a un cultivo MLR primario inhibe la producción de interferones gamma, como se midió en un cultivo MLR secundario. La Figura A demuestra que el tratamiento con mab anti-cd40l de células T de donante, en un cultivo MLR, redujo notablemente in vivo la capacidad de EICH. La Figura B muestra el efecto del tratamiento anti-cd40l en el peso corporal medio después del trasplante. 3

4 Descripción detallada de la invención Se entenderá que los términos siguientes tienen las definiciones siguientes: Célula alogénica: se refiere a una célula obtenida a partir de un individuo diferente de la misma especie que el receptor. Aloantígeno: se refiere a una célula obtenida a partir de un individuo diferente de la misma especie que el receptor Célula xenogénica: se refiere a una célula obtenida de una especie diferente con respecto a otra especie, típicamente un receptor de trasplante (por ejemplo, las células T de mandril estarían incluidas en células xenogénicas si se trasplantasen en un receptor humano). Xenoantígeno: se refiere a un antígeno expresado mediante una célula obtenida a partir de una especie diferente con respecto a otra especie, típicamente un receptor de trasplante. Antagonista del gp39: se refiere a una molécula que interfiere con la interacción gp39 (CD4)-CD40. Preferentemente, un antagonista del gp39 será un anticuerpo dirigido contra el gp39 (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal específico para gp39 humano), o un fragmento o derivado del mismo (por ejemplo, Fab, fragmento F(ab ) 2, anticuerpo quimérico, anticuerpo humano o anticuerpo humanizado). También, los antagonistas del gp39 incluyen formas solubles de una proteína de fusión de un ligando gp39 (por ejemplo, CD40Ig soluble) o agentes farmacéuticos que interfieren con la interacción go39-cd40. Gp39 o CD4 o CD40 o CD40CR es una molécula expresada en la superficie de una célula T que interactúa con una molécula, CD40, identificada en la superficie de linfocitos B inmaduros y B maduros, que está implicada en inducir la proliferación de células B. Específicamente, la interacción con gp39 en células T con CD40 en células B juega un papel central al activar las respuestas de las células B hacia un antígeno. También, se ha descubierto que el gp39 juega un papel importante en la respuesta de las células T hacia antígenos, por ejemplo, alo y xenoantígenos. No reactividad de las células T o tolerancia de las células T en la presente invención se refiere a la respuesta inmunológica reducida (respuesta de injerto contra huésped) obtenida por células T de donante contra células portando alo o xenoantígenos, en el trasplante de estás células T de donante en un receptor después de que hayan sido puestas en contacto ex vivo con un agonista del gp39 (anticuerpo anti-gp39) y células portando xeno o aloantígenos. Como se comentó, la presente invención proporciona un enfoque alternativo para la prevención de la enfermedad de injerto contra huésped en el trasplante de composiciones conteniendo células T de donante, por ejemplo, células de médula ósea o sanguíneas periféricas alogénicas o xenogénicas. Se sabe que una proporción muy pequeña de las células T de donante poseen la capacidad de identificar el aloantígeno del huésped (se estima que es inferior al 0 0%). La presente invención busca eliminar esta respuesta (hacer tales células no reactivas o tolerantes al aloantígeno o xenoantígeno) alterando funcionalmente la población de células T con capacidades reactivas a alo o xenoantígenos. Se hipotetizó por los presentes inventores que esto se podría llevar a cabo potencialmente iniciando una reacción linfocitaria mixta de células T de donante y estimuladores portando aloantígenos o xenoantígenos mermados de células T irradiadas, y añadiendo a este cultivo de la reacción linfocitaria mixta un antagonista del gp39, en particular un anticuerpo anti-gp39. La esperanza fue que éste interfiriese con las interacciones gp39-cd40 in vitro (entre la célula T de donante y células portando aloantígenos o xenoantígenos), y hacer tolerantes o no reactivas a tales células hacia las células portando aloantígenos o xenoantígenos en el trasplante dentro de un receptor del trasplante. Se hipotetizó que esto sería potencialmente posible basado en los informes previos con éxito en la bibliografía, incluyendo los de los presentes inventores, acerca de inducir tolerancia a las células T hacia el tejido alogénico o xenogénico in vivo mediante el tratamiento del receptor del trasplante con antagonista del gp39 (anticuerpo anti-gp39), solo o en combinación con células alogénicas o xenogénicas, antes de, contemporáneamente o posterior al trasplante de tejido u órgano xenogénico o alogénico. Se ha demostrado que este enfoque in vivo es sumamente eficaz para indicar tolerancia a las células T hacia diversos tejidos u órganos, por ejemplo, hígado, piel, tejido cardíaco, y siguientes. Sin embargo, era impredecible que esta metodología pudiera ser extendida a la inducción de tolerancia o no reactividad in vitro a las células T. Este resultado no era razonablemente previsible porque estudios previos relatados en la bibliografía han demostrado que no hay necesidad de que el gp39 esté presente para la inducción de la activación de células T in vitro. Por ejemplo, Flavel y colegas [Nature, 378: (199)] han demostrado que células T transgénicas para el receptor de células T, que eran genéticamente deficientes en expresión de gp39, respondieron normalmente a células presentadoras de antígenos y al antígeno. Esto demostró que la activación de las células T no requiere gp39 y, en efecto, puede ocurrir normalmente en ausencia de gp39 in vitro. Específicamente, lo datos reportados por Grewal, J. S. y col., Nature, 378: (199), Impairment of antigenspecific T-cell priming in mice lacking CD40 ligand, demostraron que no hay necesidad de que esté presente gp39 para la activación in vitro a corto plazo de células T, y que se puede generar la tolerancia de las células T aloespecíficas in vitro, en ausencia de gp39. 4

5 Por lo tanto, ha sido bastante inesperado demostrar que la tolerancia de las células T o la no reactividad de las células T de donante puede ser inducida eficazmente in vitro incubando tales células con un antagonista del gp39 y células alogénicas o xenogénicas del receptor, las cuales están mermadas de células T del receptor. Esta técnica proporciona un tremendo potencial en el tratamiento de receptores de trasplantes puesto que da un método sumamente eficaz no invasivo de hacer las células T trasplantadas, contenidas en el tejido u órgano trasplantado, tolerantes o no reactivas a aloantígenos o xenoantígenos del receptor. Por consiguiente, este tejido u órgano trasplantado, esto es, la médula ósea xenogénica o alogénica no debería obtener una respuesta adversa de injerto contra huésped en el trasplante. Además, el hecho de que la tolerancia sea inducida in vitro es además ventajoso ya que este tratamiento puede ser utilizado conjuntamente con otras estrategias antirrechazo, esto es, ciclosporina u otros inmunosupresores. También, puede ser combinado con la administración de anticuerpo anti-gp39 (u otro ligando) antes, contemporáneamente o posterior al trasplante. De hecho, el método objeto puede eliminar la necesidad de otros fármacos antirrechazo que, dada su actividad inmunosupresora, pueden producir efectos secundarios adversos, por ejemplo, riesgo incrementado de infección o cáncer. En la forma de realización preferida, las células T del donante, por ejemplo, un donante alogénico o xenogénico, serán cultivadas in vitro con tejido alogénico o xenogénico del receptor que ha sido tratado (por ejemplo, irradiado) para mermar la células T del huésped. A este cultivo se añadirá una cantidad eficaz de un antagonista del gp39, típicamente un anticuerpo anti-gp39 (por ejemplo anticuerpo ó anti-gp39 humano revelado en la Patente U.S. Nº ). Este cultivo será mantenido durante un tiempo suficiente para inducir tolerancia a las células T. Típicamente, este tiempo oscilará desde aproximadamente 1-2 días hasta 30 días, más típicamente unos - días, y muy típicamente, unos días. Después de cultivar, se pueden comprobar las células T de donante para determinar si logran una anti-alo o xenorrespuesta del huésped. También, se puede determinar si tales células permanecen viables y, de otra manera, obtienen una actividad normal de las células T después del tratamiento, por ejemplo, respuestas a IL-2. Como se muestra en los Ejemplos que siguen, se ha descubierto que las células T de donante, cuando son tratadas según la invención, exhiben respuestas anti-xeno o aloantígenos del huésped notablemente romas, mantuvieron la viabilidad, y además mantienen respuestas íntegras a IL-2. También, en la reestimulación, las células T de donante mantuvieron su hiperreactividad anti-aloantígeno del huésped. También se observó que, en el MLR primario, se redujo fuertemente la producción de citoquinas de las T ayudadoras Tipo 1 (Th 1). De manera similar, en cultivos de reestimulación secundarios, también se redujo notablemente la producción de citoquinas Th 1. Además, se descubrió que la administración in vivo de números equivalentes de células T de control o tratadas con anticuerpo monoclonal anti-gp39 (CD4) tenían propiedades de enfermedad de injerto contra huésped notablemente diferentes. Específicamente, los receptores de números tres veces superiores de células T de donante en los controles tuvieron un índice de supervivencia actuarial del 0% comparado con el 0% en los controles. En otros experimentos, se observó hasta una diferencia de 30 veces en los potenciales de enfermedad de injerto contra huésped utilizando células T tratadas con anticuerpo monoclonal anti-gp39 (CD4). Basados en esto, hemos concluido de manera sorprendente que las células T de donante pueden ser hechas tolerantes eficazmente ex vivo mediante una reacción linfocitaria mixta. Esto proporcionaría un nuevo enfoque importante para invocar la tolerancia de las células T de donante hacia células y xenoantígenos del huésped. El método proporciona un potencial significante en el área de las terapias de trasplante de médula ósea o de células sanguíneas periféricas. El trasplante de médula ósea y de células madre se utiliza, convencionalmente, para el tratamiento de diversas enfermedades tales como la leucemia y otras enfermedades que impliquen inmunodeficiencias celulares. Además, el trasplante de médula ósea también puede proporcionar beneficios en el tratamiento de otras enfermedades tales como en el tratamiento de enfermedades autoinmunes. Sin embargo, un riesgo frecuente asociado con la terapia convencional por trasplante de médula ósea es el riesgo de obtener una respuesta de EICH. El método objeto debería reducir o incluso eliminar tal riesgo y, de ese modo, ampliar las indicaciones clínicas para las terapias del trasplante de médula ósea. Esencialmente, estos métodos comprenderán el tratar células de médula ósea o sanguíneas periféricas ex vivo como se describió antes, y la introducción de las células tratadas de médula ósea o sanguíneas periféricas en el receptor necesitado de tal tratamiento, por ejemplo, un paciente con cáncer o persona padeciendo una enfermedad autoinmune necesitado de reconstitución inmunológica, debido a que sus propias células linfoides han sido mermadas a consecuencia de la enfermedad o tratamiento de la enfermedad (por ejemplo, debido a un tratamiento de radiación). El presente método se puede combinar con otros tratamientos antirrechazo, por ejemplo, la infusión in vivo de agentes de inmunosupresión tales como la metatricida, la ciclosporina A, los esteroides, o la administración de antagonista del gp39. Idealmente, el presente método proporcionará en un receptor la reconstitución inmunológica de las células T de donante tratadas, sin obtener ninguna respuesta de EICH. Sin embargo, en algunos casos esta terapia puede necesitar

6 ser repetida si el tejido trasplantado no agarra en el receptor del trasplante. Alternativamente, puede ser necesario si el sistema linfoide del receptor del trasplante llega a ser deteriorado nuevamente a consecuencia de la enfermedad o tratamiento de la enfermedad, por ejemplo, el posterior tratamiento con radiación. En tales casos, células T de donante adecuadas serán puestas nuevamente en contacto ex vivo con anticuerpo anti-gp39 o células del receptor portando alo o xenoantígenos mermadas de células T, para inducir la tolerancia de las células T, y después infundidas en el receptor del trasplante. Ejemplo 1 20 En la Figura 1 se muestra que los resultados de una reacción linfocitaria mixta (MLR) entre células T CD4+ de nodos linfáticos del donante y MHC clase II disparan las células estimuladoras que portan aloantígenos. En este experimento, se plaquearon células T CD4+ de nodos linfáticos muy purificadas, de C.H2 bm12, a una concentración de 0 x 6 por ml de concentración final, en pocillos de microtitulación o en un cultivo en masa en placas de 24 pocillos. Las células estimuladoras eran células de bazo irradiadas, mermadas de células T C7BL/6, utilizadas a una concentración final de 1 x 6 por ml. Los medios de MLR constaban de % de suero de ternero fetal, % de suplementos, y 2-ME. Se añadió mab anti-gp39 a una concentración final de 0 microgramos por ml. Donde se indica en la Figura 2, se añadió IL-2 a una concentración final de 0 unidades por ml. Los pocillos de microtitulación fueron pulsados con un microcurio de timidina tritiada por pocillo, durante un periodo de tiempo de dieciocho horas antes de recolectar. Las CPM medias (CPM de experimental CPM de solo respondedoras) están mostradas en el eje y, y los días de cultivo MLR primario en el eje x. Estos datos demuestran una profunda hiporreactividad en cultivos tratados con mab anti-gp39, la cual es reversible por la adición de IL-2 exógena. Ejemplo Los sobrenadantes de las células cultivadas en boga, del experimento mostrado en la Figura 1, fueron analizados para la concentración de interleuquina 2 (IL-2). Estos resultados están contenidos en la Figura 1. Los sobrenadantes fueron analizados mediante ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN). En el eje y se muestra la concentración del sobrenadante en pg por ml, y los días de cultivo MLR en el eje x. El adicional de mab anti-gp39 inhibió la producción de IL-2 de células T de donante en un cultivo MLR primario. Ejemplo 3 En los mismos cultivos utilizados en el experimento, los resultados de los cuales están contenidos en la Figura 2A, se analizó la concentración de interferón gamma del sobrenadante mediante ELISA. Estos resultados están contenidos en la Figura 2B. Se puede ver que la adición de mab anti-gp39 conduce a una profunda reducción de la producción de interferón gamma en un cultivo MLR primario. Ejemplo Al final del periodo del cultivo celular del décimo día, las células fueron fenotipadas mediante citometría de flujo en dos colores. Como se puede ver en la Tabla 1 (después de los ejemplos), la adición de mab anti-gp39 no evitó la activación de las células T, como se evidenció por los altos niveles de CD2, OX40, CTLA-4, B7-1 y B7-2. La adición de mab anti-gp39, sin embargo, inhibió la conversión de las células T ingenuas en células T efectoras, como se demostró por los altos niveles de L-selectina, ICAM-1, y los bajos niveles de CD4. Las células en el cultivo tratado no experimentaron apoptosis, que está evidenciado por la positividad relativamente más baja para 7-AAD. Ejemplo Al final del cultivo MLR primario, las células fueron lavadas y vueltas a plaquear a una concentración de 3 x 4 por placa de 96 pocillos. A cada pocillo se añadieron esplenocitos irradiados de ratones C7BL/6, a una concentración de células por pocillo. Estos resultados están contenidos en la Figura 3A. Donde se indicó, se añade IL-2 a una concentración final de 0 unidades por ml. Los medios constaban de % de suero de ternero fetal, % de suplementos, y 2-ME. Los pocillos de microtitulación fueron marcados con un microcurio por pocillo, en los momentos indicados, durante un periodo de dieciocho horas antes de la recolección. En el eje y están los valores de proliferación medios ( CPM), y los días de cultivo MLR secundario están en el eje x. Como se puede ver a partir de los resultados en la Figura 3H, células T de donante expuestas a mab anti-gp39, en un cultivo primario pero no secundario, mantuvieron la hiperreactividad aloantígeno-específica en un cultivo secundario. Esta fue reversible por la adición de IL-2 exógena en el cultivo secundario solamente. Ejemplo 6 En cultivos independientes, células T de donante de cultivos tratados de control o de cultivos MLR primarios tratados con mab anti-gp39 fueron expuestas a IL-2 exógena, a 0 unidades por ml de concentración final. Estos resultados están contenidos en la Figura 3B. Se puede ver que existe una respuesta equivalente de las células T de donante de control tratadas comparada con la de cultivos MLR primarios tratados con mab anti-gp39, como se valoró bajo las condiciones secundarias. 6

7 Ejemplo 7 20 Sobrenadantes obtenidos de los cultivos MLR en masa secundarios fueron comprobados mediante ELISA para la producción de IL-2 (Figura 4A) o interferón gamma (Figura 4B), como se midió en un cultivo MLR secundario. Por lo tanto, se puede ver que las células T de donante expuestas a mab anti-gp39, en cultivos MLR primarios pero no secundarios, continúan teniendo en el sobrenadante una concentración de IL-2 (Figura 4A) y de interferón gamma (Figura 4B) notablemente baja. Ejemplo 8 Al final del cultivo MLR primario, se administraron células T de donante a receptores C7BL/6 irradiados subletalmente (600 cgy de irradiación corporal total). Se ensayaron dosis de dos dosis de células ( ó 3 x ). Estos resultados están contenidos en la Figura. A partir de la Figura se puede ver que los receptores de células cultivadas controladas, a cualquier dosis celular, sucumbieron uniformemente a la EICH letal antes de las cuatro semanas postrasplante. Por contraste, los receptores de células T de donante expuestas a mab anti-cd40l ex vivo tuvieron un índice de supervivencia del 88%. Los receptores de 3 x células T de donante expuestas a mab anti-cd40l tuvieron un índice de supervivencia del 0%, en periodos de tiempo mayores de dos meses postrasferencia. Cuando se compararon a receptores de células T de donante obtenidas de cultivos de control, los índices de supervivencia actuariales de receptores de un número igual de células T de donante tratadas, expuestas a mab anti-cd40l, fueron significativamente superiores (p <0 001) a ambas dosis celulares. Ejemplo Los animales en el experimento, los resultados del cual están contenidos en la Figura A, fueron supervisados para la evidencia de EICH mediante curvas de peso medio. Estos resultados están contenidos en la Figura B. Por lo tanto, se puede ver que los receptores de células de control tuvieron una disminución acusada en las curvas de peso medio (eje y), empezando 2 semanas postransferencia, lo que produjo letalidad por EICH antes de las 4 semanas postransferencia. Por contraste, los receptores de células tratadas con mab anti-gp39 tuvieron curvas de peso que sobrepasaron sus pesos corporales medios pretransferencia. También, los receptores de ó 3 x células de cultivos de control tuvieron una reducción acusada en el peso corporal medio, coherente con una reacción de EICH. Esto demostró que la letalidad por EICH fue inhibida mediante el tratamiento con mab anti-gp39. Además, en otros experimentos, se ha observado una reducción de 30 veces en la mortalidad por EICH en receptores recibiendo cultivos tratados con mab anti-gp39 comparada con los controles. Ejemplo Se examinó la expansión in vivo de células T de donante alorreactivas. Células T de donante del experimento mostrado en las Figuras 1-, y Tablas 1 y 2, fueron infundidas dentro de ratones con inmunodeficiencia combinada grave. Estos receptores eran dispares con el donante en el loci del MHC clase I + clase II. En el sexto día postransferencia, se dio a los ratones una infusión intravenosa continua de 1 ml por hora (representando aproximadamente 1/4-1/3 del agua corporal total de los animales por hora) de líquidos. Los conductos linfáticos torácicos fueron canulados, y se recogieron los linfocitos de los conductos torácicos durante un procedimiento de recolección durante la noche. Aproximadamente se recoge 1 ml por hora y animal antes de la muerte. Después, se puede cuantificar el número de células T CD4+ producidas por día. Se puede ver que los receptores de células cultivadas de control produjeron un promedio de 2 x 6 células T CD4+ por ml de efluente de los conductos torácicos. Por contraste, los receptores de cultivos tratados con mab anti-gp39 produjeron únicamente 0 3 x 6 células T CD4+ por ml, representando una reducción aproximada de 7 veces en la generación de células T alorreactivas in vivo. Estos datos proporcionan la evidencia adicional de que el mab anti-gp39 reduce la capacidad de las células T de donante in vivo para mediar la EICH letal. En resumen, los resultados de los experimentos anteriores proporcionan la evidencia decisiva de que el mab antigp39 redujo fuertemente la capacidad de EICH in vivo. Esto representa una nueva metodología para hacer tolerantes ex vivo las células T de donante hacia antígenos o aloantígenos del huésped, como medio para prevenir la EICH letal in vivo

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10 REIVINDICACIONES 1. Un método para inducir tolerancia a células T o la no reactividad de las células T de donante hacia aloantígenos o xenoantígenos ex vivo, comprendiendo lo siguiente: (i) proporcionar un cultivo conteniendo células T de donante; (ii) producir un cultivo de reacción linfocitaria mixta añadiendo células que portan aloantígenos o xenoantígenos a dicho cultivo de células T de donante; (iii) añadir al cultivo de reacción linfocitaria mixta un antagonista del gp39; y (iv) mantener estas células en cultivo durante tiempo suficiente para que las células T de donante se vuelvan sustancialmente no reactivas hacia dichos aloantígenos o xenoantígenos en el trasplante en un huésped conteniendo células portando tales aloantígenos o xenoantígenos. 2. Un método según la Reivindicación 1, en donde las células T de donante están contenidas en una muestra de tejido de médula ósea o células sanguíneas periféricas de donante. 3. Un método según la Reivindicación 1 ó Reivindicación 2, en donde el antagonista del gp39 se selecciona del grupo que se compone de un anticuerpo anti-gp39, CD40 soluble y proteína de fusión CD40 soluble. 4. Un método según la Reivindicación 3, en donde el antagonista del gp39 es un anticuerpo anti-gp39.. Un método según la Reivindicación 4, en donde dicho anticuerpo anti-gp39 es un anticuerpo monoclonal antigp39 humano. 6. Un método según alguna reivindicación precedente, en donde las células T de donante son cultivadas con dicho antagonista del gp39, durante un tiempo que varía desde aproximadamente 1 hasta 30 días. 7. Un método según la Reivindicación 6, en donde dicho tiempo oscila de a días Un método según alguna reivindicación precedente, en donde las células que portan aloantígenos o xenoantígenos comprenden células o tejido obtenidos de un potencial receptor de trasplante que ha sido tratado para mermar las células T del receptor. 9. Un método según la Reivindicación 8, en donde la reducción de células T se efectúa mediante irradiación Un método según alguna reivindicación precedente, comprendiendo además la etapa de ensayar las células T de donante para la obtención de una respuesta anti-huésped contra aloantígenos o xenoantígenos. 11. Un método según la Reivindicación, en donde la etapa de ensayar comprende el medir la concentración de interleuquina-2 (IL-2) en los sobrenadantes del medio de cultivo celular de las células T de donante. 12. Un método según la Reivindicación 11, en donde el añadir antagonista del gp39 inhibe la producción de IL Un método según la Reivindicación, en donde la etapa de ensayar comprende el medir la concentración de interferón gamma en los sobrenadantes del medio de cultivo celular de las células T de donante. 14. Un método según la Reivindicación 13, en donde el añadir antagonista del gp39 reduce la producción de interferón gamma.. Un método según la Reivindicación, en donde la etapa de ensayar comprende el medir los niveles de L- selectina, ICAM-1 y CD4 en las células T de donante. 16. Un método según la Reivindicación, en donde el añadir antagonista del gp39 produce niveles altos de L- selectina, niveles altos de ICAM-1, o niveles bajos de CD Un método para preparar un agente terapéutico para tratar a un receptor necesitado del trasplante de células T, comprendiendo un método como se definió en alguna reivindicación precedente para producir células T de donante tratadas, y utilizando las células T de donante tratadas como principio activo en el agente terapéutico. 18. Un método según la Reivindicación 17, en donde el receptor está necesitado de una reconstrucción inmunológica a consecuencia de una enfermedad o tratamiento de la enfermedad. 19. Un método según la Reivindicación 18, en donde dicha enfermedad es cáncer o una enfermedad autoinmune.

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