11 knúmero de publicación: kint. Cl. 6 : A01N 37/18

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1 k 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 knúmero de publicación: kint. Cl. 6 : A01N 37/18 C12P 19/34, C12N 1/00 C12N 1/00, C12N /00 C12P 21/02, C12Q 1/00 12 k TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA T3 86 k Número de solicitud europea: k Fecha de presentación : k Número de publicación de la solicitud: k Fecha de publicación de la solicitud: k 4 Título: Receptores para factores de crecimiento de fibroblastos. k Prioridad: US k 73 Titular/es: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA 0 Lakeside Drive, 22nd Floor Oakland, California , US k 4 Fecha de la publicación de la mención BOPI: k 72 Inventor/es: Williams, Lewis T.; Johnson,DanielE.y Lee, Pauline E. k 4 Fecha de la publicación del folleto de patente: k 74 Agente: Ponti Sales, Adelaida ES T3 Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, Madrid

2 1 ES T3 2 DESCRIPCION Receptores para factores de crecimiento de fibroplastos. Campo de la invención La presente invención hace referencia a receptores de factores de crecimiento, específicamente al receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF-R). Más particularmente, proporciona diversas proteínas purificadas de receptor del factor de crecimiento de fibroblastos, ácidos nucléicos que codifican para las proteínas del receptor, procedimientos para la producción de proteínas de FGR-R purificadas, proteínas producidas por estos procedimientos, anticuerpos contra estas proteínas y utilizaciones diagnósticas y terapéuticas de éstos diversos reactivos. Antecedentes de la invención Los factores de crecimiento polipeptídicos son mitógenos que actúan sobre las células mediante la unión específica a receptores situados en la membrana plasmática. Estos receptores presentan generalmente tres regiones principales identificables. La primera es una región extracelular que contiene el dominio que se une al factor de crecimiento polipeptídico (es decir, el dominio de unión al ligando). La segunda región es una región transmembrana y la tercera es una región intracelular. Muchos de estos receptores contienen un dominio tirosina quinasa en la región intracelular. Las proteínas del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF-R) se unen a una familia de ligandos relacionados con factores de crecimiento, la familia de los factores de crecimiento de fibroblastos (FGF). Esta familia de factores de crecimiento se caracteriza por la homologíade secuencia aminoacídica, la avidez por la unión a heparina, la capacidad de promover la angiogénesis y la actividad mitogénica sobre las células de origen epitelial, mesenquimal y neural. La familia FGF incluye los siete siguientes FGFs: FGF (1,2)acídico (afgf) y el FGF básico (bfgf) (D. Gospodarowicz y col., Mol. Cell. Endocrinol., 46:7 (1986); (3) el producto del gen int-2 (R. Moore y col., EMBO. J., : 919 (1986); (4) el producto del gen hst o FGF del sarcoma de Kaposi (K.J. Anderson y col., Nature, 332:3 (1988); M. Taira y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:2980 (1987)); () FGF- (X. Zhan y col., Mol. Cell. Biol., 8: 3487 (1988)); y (6) el factor de crecimiento de queratinocitos (J.S. Rubin y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:802 (1989)). (7) el FGF-6 (I. Marics, y col., Oncogene 3:33 (1989)). Las acciones del FGF acídico y básico están mediadasa través de la unión a receptores de alta afinidad de la superficie celular de aproximadamente 14 y 12 KDa (G. Neufeld y D. Gospodarowicz, J. Biol. Chem., 261:631 (1986)). La referencia de Imamura y col., Purification of Basic FGF Receptors from Rat Brain, Biochem. Biophys. Res. Communications, 1:83 (1 de septiembre de 1988) describe la purifi cación de cantidades del orden de nanogramos de un receptor FGF básico (bfgf-r) a partir de cerebro de rata. Aunque genes que codifican para diversos receptores de factores de crecimiento se han clonado molecularmente (p.ej., el receptor de PDGF murino, Yarden y col., Nature, 323:226 (1986), no se había identificado ningún clon como un receptor de factor de crecimiento de fibroblastos (FGF-R). Mediante la utilización de anticuerpos antifosfotirosina para rastrear bibliotecas de expresión de ADNc en λgt11, se aisló un ADNc de 2, kilobases que codificaba para un nuevo gen de tirosina quinasa, designado bek (quinasa expresada en bacterias), a partir de una biblioteca de ADNc de hígado murino. (S. Kornbluth y col., Novel Tyrosine Kinase Identified by Phosphotyrosine Antibody Screening of cdna Libraries, Mol. Cell. Biol. 8, 41 (1988)). La secuencia bek no contenía una región transmembrana y por ello no podía identificarse como un receptor de factor de crecimiento. Otro gen de proteína tirosina quinasa designado flg (gen semejante a fms) se aisló a partir de una biblioteca de ADNc de células endoteliales humanas mediante hibridación con estringencia suave con una sonda del oncogen v-fms. (M. Ruta y col., A Novel Protein Tyrosine Kinase Gene Whose Expression is Modulated During Endothelial Cell Differentiation, Oncogene, 3:9 (1988)). Esos autores no pudieron identificar una región transmembrana en su secuencia aislada y por ello hipotetizaron que flg codificaba para una tirosina quinasa citoplasmática. Se ha afirmado que el receptor de FGF había sido aislado a partir de células endoteliales derivadas de la vena umbilical humana, y que éste presentaba un PM de (Neufield y col., J. of Cell. Physiol. 136: 37-42). No se proporcionó ninguna información sobre la secuencia. Lee y col., (Purification of the receptor for FGF and cloning of its cdna) informan del clonaje sin dar detalles sobre éste. Los receptores de bfgf humano y bfgf de pollo clonados y purificados de esta invención presentan homología de secuencia aminoacídica con los clones bek y flg en las regiones que se han aislado. Sin embargo, las secuencias bek y flg publicadas fueron incompletas y no hubo reconocimiento de su función como receptores de unión FGF. Además, las anteriores publicaciones no pudieron reconocer muchas de las características estructurales y funcionales descritas en la presente invención. Los miembros de la familia de FGF parecen tener funciones en el desarrollo tisular, reparación tisular, mantenimiento de neuronas y en la patogénesis de la enfermedad. La expresión aberrante de FGF puede causar la transformación celular mediante un mecanismo autocrino. Además, los FGFs pueden incrementar el crecimiento tumoral y la invasividad mediante la estimulación del crecimiento de vasos sanguíneos en el tumor o mediante la inducción de producción de proteínas como el activador del plasminógeno. Sin embargo, la identificación de los componentes implicados y el conocimiento de los mecanismos e interacciones implicadas permanecen lamentablemente incompletas.

3 3 ES T3 4 Los receptores de FGF purificados y fragmentos, y las secuencias de ADN aisladas que codifican para los receptores de FGF definidos y fragmentos definidos (p.ej., el dominio de unión al ligando) acelerarán en gran manera el conocimiento de las funciones de los factores de crecimiento de fibroblastos. También están disponibles los anticuerpos contra regiones específicas y definidas del receptor de FGF. Estos reactivos hallarán utilizaciones diagnósticas y terapéuticas en los anteriormente mencionados procesos. La presente invención satisface ésta y otras necesidades. Resumen de la invención La presente invención proporciona las proteínas purificadas del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF-R), los ácidos nucleicos que codifican para las proteínas de FGF- R, los procedimientos para la producción de las proteínas purificadas de FGF-R, las proteínas purificadas producidas mediante estos procedimientos, los anticuerpos contra estas proteínas y fragmentos y utilizaciones diagnósticas y terapéuticas. Notablemente, la presente invención proporciona formas solubles y secretadas de los receptores que exhiben una estructura de receptor inusual. En particular, la presente invención proporciona un polipéptido soluble purificado que comprende dominios de IgII e IgIII de cualquiera de las secuencias aminoacídicas que se muestran en la Figura 7 o una secuencia aminoacídica que comprende dos dominios homólogos en al menos el 8 % con los dominios IgII e IgIII, respectivamente, de cualquiera de las citadas secuencias; dicho polipéptido carece de dominio transmembrana y es capaz de inhibir la unión entre un factor de crecimiento de fibroblastos y un receptor del factor de crecimiento de fibroblastos. Tal polipéptido de acuerdo con la invención incluye un polipéptido que comprende un primer dominio Ig que tiene (i) dos residuos cisteína, (ii) un residuo triptófano 11 ó12aminoácidos en el extremo carboxiterminal de uno de los residuos anteriormente mencionados de cisteína, que está cercano al extremo N-terminal, y (iii) una secuencia DXGXYXC en el extremo aminoterminal de los otros residuos de cisteína; un segundo dominio Ig C-terminal al primer dominio que también comprende las características (i), (ii) y (iii) como se definió para el primer dominio Ig, excepto que el segundo dominio Ig puede tener una secuencia carboxiterminal que al menos sea homóloga en un 8 % con la secuencia de 79 aminoácidos desde el residuo 224 al 2 ó del 222 al 0 de la proteína humana h4 ó h, respectivamente, de la Figura 7 en lugar del otro residuo cisteína y de la secuencia (iii). La invención también proporciona un polipéptido purificado que comprende la secuencia humana designada como h4 óhenlafigura7,y un polipéptido purificado que es inferior a 8 KDa y comprende un dominio de unión al factor de crecimiento de fibroblastos de un receptor del factor de crecimiento de fibroblastos; dicho receptor comprende una secuencia de aminoácidos como semuestraenlafigura7ó una variante alélica o mutante de ello, o una secuencia homóloga que está codificada por un ácido nucleico que hibrida con el ADN que codifica para dicha secuencia variante o mutante en condiciones de estringencia que incluyen una temperatura sobre 37 C y una concentración de sal inferior a 1 M. En un aspecto adicional, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal que se une a un polipéptido de la invención. En otro aspecto, la invención proporciona ácidos nucleicos. En particular, ácidos nucleicos aislados que codifican para un polipéptido de acuerdo con la invención, como un ácido nucleico aislado que comprende o hibrida selectivamente con toda o parte de una secuencia en los dominios IgII e IgIII, que se muestran en cualquiera de las Figuras 3, 4 ó 9 en condiciones de estringencia que comprenden una temperatura sobre 37 C y una concentración de sal inferior a 1 M, y que codifica para un polipéptido que es capaz de inhibir la unión de un factor de crecimiento de fibroblastos con un receptor de factor de crecimiento de fibroblastos. Los ácidos nucleicos se pueden expresar para proporcionar polipéptidos de la invención, por ejemplo mediante un procedimiento en donde el péptido se produzca en una célula transformada con un ácido nucleico, que comprende una secuencia que codifica para dicho péptido unida operativamente con las regiones de iniciación de la transcripción y traducción, dicho procedimiento comprende la expresión de dicho ácido nucleico y la recuperación del péptido FGF-R. También se proporciona un procedimiento para la producción de un anticuerpo contra un fragmento del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos, dicho procedimiento comprende una etapa de producción de un anticuerpo contra un epitopo del polipéptido, el cual contiene al menos seis aminoácidos contiguos de un polipéptido de acuerdo con la invención. La invención también proporciona un procedimiento de cuantificación de un factor de crecimiento de fibroblastos o de un receptor del factor de crecimiento de fibroblastos en una muestra diana, dicho procedimiento comprende las etapas de: combinación de dicha muestra diana con un polipéptido de acuerdo con la invención; y determinación de la magnitud de la unión entre dicho segmento y dicha muestra. La presente invención tiene aplicaciones como en un procedimiento para la modificación in vivo de una actividad modulada por el receptor del factor de crecimiento de fibroblastos que comprende la administración a un paciente de una cantidad de agente bloqueante del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos eficaz para inhibir la unión del factor de crecimiento de fibroblastos a dicho receptor del factor de crecimiento de fibroblastos. Alternativamente, la invención se puede utilizar para proporcionar un procedimiento para inhibir la unión entre un factor de crecimiento de fibroblastos y un receptor del factor de crecimiento de fibroblastos en una solución. Este procedimiento contendrá una etapa de combinación de un péptido FGF-R, p.ej., un péptido de la secuencia homóloga a la secuencia descrita en las 3

4 ES T3 6 Figuras 3, 4 o 7, con la solución o medio que contenga el receptor del factor de crecimiento de fibroblastos, generalmente el receptor del factor de crecimiento de fibroblastos nativo. Dichos procedimientos serán útiles in vitro, después de utilizar el péptido FGF-R marcado en procedimientos de ensayo. También se describen aquí las composiciones que contienen un polipéptido FGF-R soluble que tienen entre cinco y doscientos aminoácidos contiguos de un dominio extracelular de FGF-R humano. Un polipéptido contiene al menos unos 80 aminoácidos desde los residuos 1 a 287 de un receptor del factor de crecimiento de fibroblastos humanos de la Figura 7 o de un dominio IgII o IgIII, o de ambos. Breve descripción de las figuras La Fig. 1 compara la unión de varios derivados de FGF con FGF-R. La Fig. 1(A) es una gráfica que muestra el porcentaje de inhibición de la unión de bfgf marcado con I 12. La Fig. 1(B) es una autoradiografía de células Swiss 3T3 ligadas a bfgf y sometidas a electroforesis en gel. La Fig. 2(A) es una autoradiografía de fracciones de membrana de pollo ligadas y de eluídos en WGA sometidos a electroforesis en gel. La Fig. 2(B) es un gel teñido con plata que muestra el receptor de FGF puro que resulta de una purificación por afinidad realizada con el eluído de embriones de pollo en columnas WGA-Sepharose 4B que se muestra en la Fig. 2(A). La Fig. 3 muestra la secuencia nucleotídica y de aminoácidos de un receptor bfgf de pollo. La Fig. 4 muestra la secuencia nucleotídica y de aminoácidos de un receptor FGF humano. La Fig. (A) representa una autoradiografía de una transferencia de northern de ARN de pollo hibridado con un ADNc de longitud completa del receptor de bfgf de pollo en condiciones de alta estringencia. La Fig. (B) representa una autoradiografía de una extensión por cebador del ARNm de pollo sometido a electroforesis en un gel de secuenciación de acrilamida. La Fig. 6 es un esquema de un receptor de bfgf de pollo que señala el dominio acídico (línea continua); región transmembrana (bloque rallado); dominio tirosina quinasa (bloque punteado); (S), posición de los residuos de cisteína SH (en contraste con la designaciónsdelatabla I); (W), posición del residuo triptófano respecto al primer residuo de cisteína en el dominio semejante a Ig. La Fig. 7 proporciona una comparación de secuencias aminoacídicas de varias formas de receptor de FGF diferentes. Las secuencias aminoacídicas de 4 formas de receptor humano se muestran en comparación con una secuencia de receptor de FGF de pollo. Las secuencias que difieren de la secuencia del receptor de FGF de pollo están enmarcadas. Las secuencias transmembrana estan subrayadas. Estas secuencias de ADN estan en la base de datos GenBank/EMBL bajo los siguientes números de acceso: h2 es M3418, h3 es M34186, h4 es M34187, y h es M La Fig. 8 proporciona una representación esquemática de diversos receptores de FGF diferentes. Las siguientes características estructu rales se identificaron: secuencia señal putativa hidrofóbica (bloques rellenos), región altamente acídica (bloques vacíos), dominio transmembrana (bloques rallados), dominios quinasa 1 y quinasa 2 (bloques punteados) y la región divergente de h4/h (línea en zigzag). Los asteriscos indican la posición en la cual h2 y h4 contienen la secuencia ArgMet, el receptor de pollo contiene un residuo Asn único y h3 y h no contienen los correspondientes residuos. Los triángulos indican la posición en la cual h3 contiene un residuo Glu y todas las formas de otros receptores contienen un residuo Lys. Los números en la parte superior de la figura indican los grados de identidad aminoacídica entre dominios similares del receptor humano h2 y el receptor de pollo. La Fig. 9 representa una comparación de varias secuencias genómicas del receptor de FGF humano con secuencias aminoacídicas deducidas de clones del ADNc del receptor de FGF. La secuencia de un fragmento genómico humano obtenido por PCR se muestra en comparación con las secuencias del ADNc humano y de pollo. Un intrón de 1 Kb separa las secuencias genómicas que codifican para el dominio semejante a Ig (Ig) ylaregión altamente acídica. Las líneas punteadas representan la secuencia continua sin huecos. La secuencia aminoacídica deducida muestra que para el receptor de FGF de pollo se inicia con el residuo iniciador metionina (1) y finaliza con la región acídica (EDDDDEDD; aminoácidos en FGF-R c1). La secuencia aminoacídica que se muestra para el receptor de FGF h2 humano se inicia con el residuo iniciador metionina (1) y finaliza con la región acídica (EDDDDDDD; aminoácidos en h2). La Fig. muestra la unión de FGF acídico o básico con el receptor en las células transfectadas con los ADNc del receptor de FGF. Las células L6 (x ) transfectadas con la construcción de expresión cfgfr/psv7d (carriles 1, 2, 7 y 8), la construcción de expresión h2fgfr/psv7d (carriles3,4,9y),osólo con los vectores (carriles, 6, 11 y 12) se incubaron con 0,1 pmoles de afgf-i 12 (carriles 1-6) o bfgf-i 12 (carriles 7-12) en la presencia o ausencia de un exceso de 0 veces de afgf no marcado (carriles 2, 4 y 6) o bfgf (carriles 8, y 12). La unión se realizó durante minutos a 37 C. A continuación las células se lavaron dos veces con DME H21 frío que contenía HEPES mm ph 7,4, gelatina al 0,2 % y dos veces con PBS frío. Se añadió disuccimidil suberato (DSS) a una concentración final de 0,1 mm y se permitió que la unión tuviera lugar durante 1 minutos a 4 C. Las muestras se resuspendieron en tampón de muestra y luego se sometieron a SDS PAGE seguido de autoradiografía. La Fig. 11 muestra la inducción de FGF acídico y básicodeunflujode 4 Ca ++ en oocitos de Xenopus inyectados con ARN que codifica para el receptor de FGF de pollo o para el receptor de FGF humano h2. Las gráficas muestran el flujo de 4 Ca++ de los oocitos inyectados con el ARN del receptor del FGF de pollo (A y C, cuadrados vacíos), ARN h2 humano (B y D, cuadrados vacíos), ARN h3 humano (B y D, triángulos relle-

5 7 ES T3 8 nos) o agua (A-D, cuadrados rellenos). Los oocitos inyectados se incubaron con 4 CaCl 2 durante 3 horas a 19 C y luego se lavaron extensamente. Grupos de oocitos se colocaron en pocillos individuales de una placa de 24 pocillos y se añadió 0, ml de medio. A intervalos de minutos, el medio se retiró paraelcontajey se añadió medio nuevo. Al cabo de minutos, se añadió afgf (panel a y B) o bfgf (panel C y D) a una concentración final de 0, nm. Como un control positivo, se añadió carbachol al cabo de 0 minutos. Cada punto de los resultados representa la media de los pocillos por triplicado. Descripción detallada de la realización preferida Esquema I. Descripción general A. FGF-R 1. características estructurales a. dominio extracelular i. secuencia señal iii. dominios Ig iii. región aminoacídica acídica b. segmento transmembrana c. dominio intracelular i. tirosina quinasa ii. inserto 2. función a. unión a FGF b. unión al péptido FGF-R c. actividad tirosina quinasa B. Funciones fisiológicas 1. de la célula 2. diferenciación tisular 3. del organismo II. Polipéptidos A. Formas solubles B. Formas truncadas C. Proteínas de Fusión D. Variantes genéticas (mutagénesis dirigida) E. Composiciones que incluyen proteínas III. Acidos nucleicos A. Acidos nucleicos aislados B. Acidos nucleicos recombinantes C. Composiciones que incluyen ácidos nucleicos IV. Procedimientos para producir FGF-R A. Purificación de proteínas 1. afinidad con FGF derivado 2. diversos ligandos, el mismo receptor B. Expresión de ácidos nucleicos V. Anticuerpos VI. Procedimientos para su utilización A. Diagnóstica B. Terapéutica I. Descripción General Un primer aspecto de la invenciónproporciona péptidos FGF-R homogéneos. Estos FGF-Rs homogéneos incluyen un receptor del factor de crecimiento de fibroblastos básico de pollo y diversos receptores del factor de crecimiento de fibroblastos humano. Se describen los polipéptidos homogéneos que tienen actividad de FGF-R de unión al ligando o que contienen una porción del dominio de unión al ligando de un FGF-R. Principalmente, la presente invención proporciona polipéptidos homogéneos que corresponden a proteínas de unión al FGF que se producen de forma natural y que tienen características estructurales inesperadas. Una clase proporciona proteínas solubles carentes de un segmento transmembrana, otra clase proporciona proteínas que poseen un segmento transmembrana y un dominio tirosina quinasa. Ambas clases presentan una estructura de dominio extracelular inesperada, más corta que la correspondiente del FGF-R de pollo. También se describen los resultados experimentales que indican que un sólo receptor se une a diversos tipos de FGF. Un segundo aspecto de la invención proporciona secuencias de ADN aisladas. Estas secuencias de FGF-R codifican para los polipéptidos que presentan actividad de unión al ligando, incluyendo los polipéptidos que corresponden a los receptores del factor de crecimiento de fibroblastos de tamaño completo que se producen de forma natural. Se han aislado las secuencias de ADN que codifican para un bfgf-r de pollo o que codifican para diversos FGF-Rs humanos (hfgf-r). También se proporcionan los vehículos de clonaje yexpresión que contienen las secuencias que codifican para el FGF-R. Una secuencia de ADN que codifica para el receptor de FGF de tamaño completo o un fragmento polipeptídico de FGF-R pueden unirse operativamente para controlar las secuencias y expresarlas en un cultivo de células huésped compatibles transformadas, transfectadas o infectadas. Se proporcionan los procedimientos para sintetizar las proteínas del receptor del factor de crecimiento y los procedimientos para proporcionar análogos de los receptores del factor de crecimiento de fibroblastos. La invención también proporciona los anticuerpos contra dominios definidos del receptor. Otros aspectos de la invención incluyen procedimientos para la evaluación de composiciones que son agonistas o antagonistas al ligando y las interacciones con el receptor, en particular aquellas que promueven o inhiben las interacciones de la unión. También se describen aquí las utilizaciones diagnósticas y terapéuticas de los reactivos que se proporcionan. A. Receptores FGF Los receptores del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF-R) son receptores de la familia de factores de crecimiento de fibroblastos (FGFs), como se describió anteriormente. Ver también P.L. Lee y col., Science 24:7-, (1989), que se ha incorporado aquí como referencia. La familia de FGF consiste de factores de crecimiento polipeptídico caracterizados por la homología de secuencia aminoacídica, avidez de

6 9 ES T3 unión a la heparina, capacidad para promover la angiogénesis y actividad mitogénica en las células de origen epitelial, mesenquimal y neural. La familia de FGF incluye el FGF acídico, FGF básico, el producto del gen int-2, el producto del gen hst (FGF del sarcoma de Kaposi), FGF-, el factor de crecimiento de queratinocitos y el FGF- 6. Los miembros de la familia FGF parece que tienen funciones en el desarrollo, reparación tisular, mantenimiento de neuronas y la patogénesis de enfermedades. La expresión anómala del FGF puede causar la transformación celular mediante un mecanismo autocrino. Además, los FGFs pueden incrementar el crecimiento tumoral y la invasividad mediante la estimulación del crecimiento de vasos sanguíneos en el tumor o mediante la inducción de la producción de proteasas como el activador del plasminógeno. El término ligando hace referencia a las moléculas, generalmente miembros de la familia del factor de crecimiento de fibroblastos, que se unen a los dominios implicados en la unión del factor de crecimiento. También, un ligando es una molécula que sirve como el ligando natural al que se une el receptor, o un análogo funcional que sirve como un agonista o antagonista. Como se describe aquí, un receptor de bfgf de pollo se caracteriza por diversas características estructurales identificables. Las estructuras del FGF-R de pollo y humano se generalizan por definir una nomenclatura estructural aplicable a otros FGF-Rs. Las descripciones generales de la estructura proteica y su relación con las secuencias de ácidos nucleicos se discuten en J.D. Watson y col., Molecular Biology of the Gene, 4 ā Ed., vols. 1 y 2, Benjamin/Cummings, Menlo Park, California, (1987); y B. Alberts y col., Molecular Biology of the Cell, 2 ā Ed., Garland, New York, (1989), cada de ellas se ha incorporado aquí por referencias. Se describen las características estructurales comunes de los FGF-Rs conocidos, incluyendo diversas proteínas de unión al FGF, humanas, solubles que se producen de forma natural. Un receptor del factor de crecimiento de fibroblastos humano es una proteína derivada de un gen FGF-R humano natural, o que comparte importantes características estructurales peculiares de un receptor humano de FGF que se produce de forma natural. El ARNm de FGF-R de pollo, de longitud completa, aislado contiene un sólo segmento hidrofóbico semejante a un segmento que se expande por la membrana (designado el segmento transmembrana). Los segmentos de FGF-R próximos al extremo amino del segmento transmembrana se denominan el dominio extracelular, mientras que los segmentos próximos al extremo carboxilo del segmento transmembrana se denominan dominio intracelular. Desde el extremo aminoterminal, el dominio extracelular tiene una secuencia señal putativa hidrofóbica NH 2 -terminal, un dominio semejante a la inmunoglobulina (denominado IgI), un segmento acídico, un segundo dominio semejante a la inmunoglobulina (denominado IgII) y un tercer dominio semejante a la inmunoglobulina (denominado IgIII). Aunque se pueden identificar diversas características estructurales en el dominio externo del FGF-R, la propiedad funcional más importante que define el dominio es la unión con los ligandos del receptor, p.ej., miembros de la familia de FGF. Como se discute más adelante, esta función está correlacionada con la presencia combinada de dominios IgII e IgIII. El dominio intracelular se caracteriza por la presencia de un dominio estructural de tirosina quinasa dividido y, en el receptor de pollo, es aproximadamente de 424 residuos de largo. Funcionalmente, este dominio se define por su actividad tirosina quinasa, modulada característicamente por la unión del ligando con el dominio extracelular. Una proteína carece sustancialmente de dominio intracelular cuando carece de un dominio intracelular prototípico, en particular cuando carece de un dominio tirosina quinasa. Además del receptor de pollo, se han identificado cuatro únicos clones de ADNc humanos. Estos codifican para las variantes de receptor de FGF anteriormente desconocidas, que sólo contienen dos dominios semejantes a Ig. Dos de los clones humanos codifican para receptores que se expanden a lo largo de la membrana y dos codifican para putativas formas secretadas. Ambas formas que exhiben las estructuras de dominios semejantesaig3oig2medianlarespuestabiológica al FGF acídico y básico. Así, el primer dominio Ig de la forma del dominio Ig 3 puede tener una función distinta que la unión del FGF acídico ybásico. Las múltiples formas del receptor humano, son idénticas en algunas regiones pero son altamente divergentes en otras regiones seleccionadas del dominio extracelular. Dos de los receptores de variantes humanas, h4 y h, parece que codifican para una forma secretada del receptor de FGF. Una secuencia de ácido nucleico de FGF-R típica codifica para una secuencia hidrofóbica NH 2 - terminal transitoria, que generalmente se corta durante el proceso de translocación. La función clásica de una secuencia señal es dirigir la cadena polipeptídica naciente a los ribosomas unidos a membrana, conduciendo así a la translocación de membrana. Sin embargo, ya que la secuencia señal se elimina típicamente en el proceso de translocación, la secuencia señal está ausente en un polipéptido maduro. Los dominios semejantes a Ig (dominios Ig) se caracterizan por tres hechos principales: (i) la presencia de dos residuos cisteína característicos en cada dominio; (ii) la presencia de un residuo de triptófano consenso 11 a 12 aminoácidos en el sitio COOHterminal del primer residuo de cisteína en cada dominio semejante a Ig; y (iii) la presencia de la secuencia consenso, DX- GXYXC, en el sitio NH 2 -terminal del segundo residuo de cisteína. La última característica se modifica en los casos de las proteínas de receptor solubles, y se sustituye con una secuencia de tamaño equivalente. Características adicionales de los dominios Ig son evidentes al comparar los dominios unos con otros, y al comparar dominios homólogos de moléculas de receptor diferentes. El dominio Ig aminoproximal hallado en el clon de pollo se designó IgI. Como el clon de pollo contiene tres dominios Ig, los dominios se han numerado a partir

7 11 ES T3 12 del extremo aminoterminal. Como se indica en la Figura 6, el dominio IgI incluye 4 aminoácidos flanqueados por un par de residuos de cisteína. El dominio IgI de pollo tiene una alta homología de secuencia con el dominio IgI hallado en la secuencia genómica del FGF-R humano. Sin embargo, las formas humanas parece que carezcan de un dominio correspondiente al IgI. El siguiente dominio Ig se designó IgII, y en el receptor de pollo incluye 1 aminoácidos entre los dos residuos cisteína (ver Figs. 3 y 6). Como se describió anteriormente, este dominio, en combinación con el dominio IgIII está implicado con la unión al ligando. La homología de secuencia polipeptídica de este dominio entre los receptores de pollo y los receptores humanos es bastante elevada, como se muestra por las alineaciones de secuencia en la Fig. 7. Se tendrá en cuenta que los receptores humanos carecen de un dominio IgI, pero contienen dominios IgII e IgIII. Los residuos cisteína utilizados para diseñar este dominio son los residuos 176, 89, 87, 89 y 87 en el sitio aminoproximal, y 228, 141, 139, 141 y 139 en el sitio carboxiproximal para los receptores de pollo h2, h3, h4 y h, respectivamente. El tercer dominio Ig se denominó IgIII y en el receptor de pollo incluye 63 aminoácidos entre los dos residuos cisteína. Ver las Figs. 3 y 6. De nuevo, aunque los receptores humanos tienen sólo dos dominios, los dominios corresponden a IgII e IgIII. En ambas formas, la de pollo y la humana, el dominio IgIII es el más cercano al segmento transmembrana. Los residuos cisteínaparalos receptores del pollo, h2, h3, h4 y h, respectivamente, utilizados para diseñar este dominio son los residuos 274, 187, 18, 187 y 18 en el sitio aminoproximal y los residuos 339, 22,, 23 y 21 en el sitio carboxiproximal. Los receptores solubles h4 y h presentan un segmento terminal sustituido denominado IgIII. Este segmento es un segmento terminal sustituido que reemplaza parte de la membrana unida a IgIII y tiene 79 aminoácidos de largo. Esta secuencia corresponde a los aminoácidos 224 y 222 de h4 y h,respectivamente, que conserva muchas de las características halladas en el dominio IgIII excepto DSGSYSC. Debería considerarse, sin embargo, que las secuencias IgIIIT están conservadas entre las formas solubles del FGF-R humano. Entre el primer y segundo dominio semejante a inmunoglobulina, los receptores de FGF tienen una característica no hallada en otros miembros de la superfamilia de inmunoglobulinas (se ha mostrado para el FGF-R básico, aunque el mismo FGF-R se une a los FGFs acídicos y básicos). Existe una serie de ocho residuos acídicos consecutivos (EDDDDEDD en el caso del pollo, y EDDDDDDD en el caso del humano) seguido de tres residuos de serina y dos residuos acídicos adicionales (Figuras 3 y 7). Aunque se han descrito segmentos no interrumpidas de 7 a 3 residuos acídicos en ciertas proteínas intracelulares, en particular proteínas nucleares, tales regiones acídicas son poco comunes en la región extracelular de proteínas de receptores transmembrana. Las especies de receptor (p.ej., del pollo, las formas h2, h3, h4 y h) también presentan variabilidad en un sitio específico entre la región acídica conservada y el segundo dominio semejante a Ig conservado (IgII). Las formas de receptor h2 y h4 contienen dos aminoácidos (ArgMet) en las posiciones 9 y, mientras que el receptor de pollo contiene un sólo aminoácido (Asn) en esta posición y las formas de receptor h3 y h no contienen los correspondientes aminoácidos en esta posición (ver asteriscos, Fig. 8). Otra característica poco habitual es la longitud de la región yuxtamembrana, la región entre el segmento que se expande por la membrana y el dominio quinasa. Esta región está normalmente conservada entre los receptores tirosina quinasa. Por ejemplo, la región yuxtamembrana tiene una longitud de 49 a 1 residuos en los receptores de PDGF, CSF-1, factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor-2 de crecimiento epidérmico (HER- 2) y la insulina. Los receptores del FGF con un dominio intercelular tienen una larga región yuxtamembrana poco común de aproximadamente 87 residuos. Las regiones citoplasmáticas de las secuencias aminoacídicas son de aproximadamente 424 y 42 residuos de largo, respectivamente para las formas de pollo y humanas. Estas también contienen una secuencia tirosina quinasa (de los residuos 482 a 79, 39 a 672 y 393 a 670, respectivamente para el pollo, formas h2 y h3). En conjunto, la región quinasa de los receptores de bfgf comparten la mayor identidad de secuencia (aproximadamente 1 a 3 %) con los receptores PDGF y CSF-1. Los receptores de bfgf contienen el motivo GX- GXXG y el residuo de lisina conservado (aproximadamente en el residuo 12) que forma parte del sitio de unión a la adenosina -trifosfato (ATP) de las tirosina quinasas. Los receptores de bfgf también contienen los dos motivos característicos de tirosina quinasa, HRDLAARNVL y DFGLAR y una tirosina (aproximadamente en los residuos 61, 64 y 62) en la posición análoga al sitio de mayor fosforilación de pp v src (aproximadamente Tyr 416). La secuencia codificante de la quinasa de los receptores de bfgf, definida por la homología con otras tirosina quinasas, está dividida por una inserción de 14 aminoácidos. La longitud de la inserción en la región quinasa es más corta que la hallada en los receptores de PDGF y CSF-1 (4 y 70 aminoácidos, respectivamente) y es semejante a la longitud en los receptores para la insulina y el factor-i de crecimiento semejante a la insulina. El FGF-R parece que tenga tres funciones diferentes. La primera es la unión de ligandos, generalmente las proteínas FGF o sus análogos. Estos ligandos o análogos pueden también servir como agonistas o antagonistas. El sitio de unión al ligando está aparentemente en el dominio extracelular. El receptor transmite una señal en respuesta a la unión al ligando, y el resultado es una actividad modulada por el ligando. Como generalmente el ligando es un FGF, la señal estará normalmente modulada por el FGF. Una segunda actividad biológica hace referencia a la actividad enzimática de tirosina quinasa. Esta actividad está típicamente activada en respuesta a la unión al ligando. Sin embargo, parece que los receptores funcionan en un estado de dímero, las interacciones de unión intracatenarias 7

8 13 ES T3 14 pueden considerarse otra actividad biológica que puede mediarse por agentes bloqueantes. Esto puede servir como un medio adicional para modular la mediación por FGF de determinadas actividades. B. Implicaciones fisiológicas Las interacciones de FGFs con sus receptores causan cambios en, sobre tipos celulares determinados, la morfología y transformación celular, la proliferación celular, la diferenciación celular, la senescencia celular, la sensibilidad a la heparina y los efectos de la heparina. Los efectos in vivo del FGF incluyen, en organismos determinados, la modulación de diversas actividades, p.ej., la regeneración de miembros, la regeneración del cristalino, efectos angiogénicos sobre las células normales y tumorales, la curación de heridas, la diferenciación de adipocitos y el crecimiento de diversas células nerviosas y de mioblastos. Los FGFs también presentan actividades angiogénicas potentes. Se piensa que la actividad angiogénica de los FGFs es debida en gran parte a los efectos quimiotácticos y mitogénicos de estos factores sobre las células endoteliales. Además, se ha mostrado que la expresión constitutiva de los FGFs induce la transformación celular en las células transfectadas, lo que indica que la estimulación autocrina o paracrina por los FGFs puede estar implicada en la formación de tumores. Estos diversos efectos celulares y fisiológicos anuncian la central importancia de estas interacciones receptor-ligando. Las composiciones y las células que las incluyen pueden utilizarse con propósitos diagnósticos y para estudiar y tratar estas enfermedades asociadas con receptores de FGF. Las células que expresan vehículos de clonaje que contienen secuencias definidas pueden utilizarse para definir sitios específicos de un receptor de FGF necesario para efectuar una actividad particular. Alternativamente, estas células pueden ser útiles para confirmar la capacidad de un receptor seleccionado para unir ligandos diferentes (FGFs y análogos), proporcionando así una herramienta poderosa para evaluar el potencial de fármacos para promover o inhibir de modo específico las respuestas celulares inducidas por FGF. Las células transfectadas, inyectadas, infectadas o electroporadas con ADN o ARNm que contienen una secuencia de FGF-R natural de tamaño completo expresarán a menudo el receptor de tipo nativo o salvaje y responderán de acuerdo con ello. Se pueden utilizar concentraciones específicas de un receptor purificado o un fragmento polipeptídico de receptor para bloquear la unión del ligando (FGF) a los receptores de FGF nativos. De modo alternativo, los anticuerpos contra el receptor o el fragmento pueden tener el mismo efecto. Polipéptidos homogéneos y definidos y secuencias de ADN hallarán una utilidad en la producción de anticuerpos. En particular, los anticuerpos contra regiones específicas del receptor, p.ej., el dominio de unión al ligando, hallarán una utilidad en el análisis diagnóstico. Los reactivos de FGF-R, polipéptidos de FGF-R y anticuerpos contra regiones específicas del receptor se pueden para estudiar la regulación de las actividades mediadas por FGF. Por ejemplo, los agonistas de FGF podrían estimular el desarrollo de vasos sanguíneos, un efecto especialmente beneficioso en la curación de la herida y en el crecimiento colateral de vasos sanguíneos en áreas isquémicas del corazón. Los FGF antagonistas podrían tener una utilidad en la prevención de la angiogénesis anómala como pasa en la retinopatía diabética y la artritis reumatoide o en el control de tumores mediante el bloqueo de la proliferación de la vascularización de un tumor. II. Polipéptidos Esta invención incluye los polipéptidos del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos y las proteínas que tienen actividad de unión al ligando del FGF-R como se define en las reivindicaciones que se acompañan. Los símbolos para los residuos aminoacídicos se muestran en la Tabla I. TABLA I Abreviaciones para los residuos aminoacídico A, Ala; G, Gly; M, Met; S, Ser; C, Cys, H, His; N, Asn; T, Thr; D, Asp; I, Ile; P, Pro; V, Val; E, Glu; K, Lys; Q, Gln; W, Trp; F, Phe; L, Leu; R, Arg; Y, Tyr; X, cualquier aminoácido y Z, terminación. Se han clonado y caracterizado diversos receptores de FGF humanos nuevos, como se describe más adelante. A remarcar que se han descubierto diversas formas más cortas (h2 y h3) y versiones solubles (h4 y h) de receptores de FGF. Las proteínas solubles (p.ej., formas carentes de un segmento transmembrana) que poseen la capacidad de unirse al FGF indican que las formas más cortas hallarán utilizaciones terapéuticas y/o diagnósticas. Típicamente, los péptidos del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos de la presente invención exhibirán al menos un 8 % de homología con los receptores que se producen de forma natural en las regiones IgII e IgIII, generalmente al menos un 90 % de homología y preferentemente al menos un 9 % de homología. En particular, la función de unión al ligando se localiza en el dominio extracelular, y las formas solubles retienen esta función en particular. Los fragmentos solubles de los receptores de FGF podrían ser útiles en la sustitucióndeoenlainter- ferencia con las funciones de las variantes solubles naturales. Alternativamente, las formas solubles pueden interferir con la dimerización de los receptores de FGF, ya que los receptores pueden generalmente estar en una forma dimérica. La dimerización del receptor puede ser esencial para la transducción de la propia señal fisiológica. Los receptores humanos que poseen un segmento transmembrana son poco comunes al tener sólo el dominio IgII y el IgIII de los tres dominios Ig. La ausencia del dominio IgI indica que ciertas funciones pueden estar ausentes en el receptor humano, o más probablemente, que el dominio IgI es innecesario en el receptor humano. Los resultados que se presentan más adelante muestran que el dominio IgI no es esencial para la unión al ligando.

9 1 ES T3 16 Como se utiliza aquí, los términos sustancialmente pura y homogénea describen una proteína que ha sido separada de los componentes que la acompañan de forma natural. Típicamente, una proteína monomérica es sustancialmente pura cuando al menos un a 7 % de una muestra exhibe un esqueleto polipeptídico sencillo. Las variantes menores o modificaciones químicas comparten generalmente la misma secuencia polipeptídica. Una proteína pura sustancialmente comprenderá de modo característico de un 8 a 90 % de una muestra de proteína, más comúnmente comprenderá al menos un 9 %, y preferentemente será alrededor de un 99 % pura. Normalmente, la pureza se cuantifica en un gel de poliacrilamida, con la homogeneidad determinada por tinción. Para ciertos propósitos se utilizarála alta resolución y HPLC o un medio similar para la purificación. Para la mayoría de propósitos, se utilizará para determinar la pureza una columna de cromatografía simple o un gel de poliacrilamida. Una proteína está sustancialmente libre de componentes asociados de forma natural cuando se la separa de los contaminantes nativos que la acompañan en su estado natural. Así, una proteína que se sintetiza químicamente o se sintetiza en un sistema celular diferente de la célula de la cual se origina de forma natural estará sustancialmente libre de sus componentes asociados de forma natural. El término se utiliza para describir los receptores y ácidos nucleicos que se han sintetizado en las células de mamífero heterólogas océlulas vegetales, E. coli y otros procariotas. Un polipéptido es específicamente una forma entera unida a una membrana de un FGF-R cuando es un péptido de longitud completa que corresponde a, o altamente homólogo a una forma unida a una membrana que se produce de forma natural de un FGF-R. La presente invención proporciona preparaciones, solubles o unidas a membrana, especialmente puras. Se pueden inventar diversos procedimientos para su aislamiento a partir del material biológico, basados en parte sobre las descripciones estructurales y funcionales aquí contenidas. Los péptidos del receptor de FGF, incluyendo los receptores de FGF humano y de pollo, pueden purificarse utilizando las técnicas de química de proteínas clásica, ver más adelante. Por ejemplo, se puede utilizar un paso de cromatografía de afinidad por lectina, seguido por un procedimiento de cromatografía de afinidad por el ligando altamente específica que utiliza un conjugado de FGF con biotina a través de los residuos de cisteína del FGF. Los receptores de FGF-R purificados pueden también obtenerse por un procedimiento como la cromatografía de afinidad por FGF utilizando CH-Sepharose conjugada con FGF a través de grupos primarios de aminoácidos como se describe en Imamura, supra. Este procedimiento, sin embargo, aunque da como resultado una proteína purificada, puede que no proporcione una cantidad suficiente para trabajar de proteína purificada (es decir, cantidades mayores que nanogramos). Dependiendo de la capacidad de los anticuerpos específicos, como se proporciona aquí, los receptores de FGF específicos también se pueden purificar utilizando una cromatografía de inmunoafinidad. Los anticuerpos preparados, como se describe más adelante, se pueden inmovilizar para insertar una sustancia para generar una columna de afinidad altamente específica. Ver Harlow y Lane, más adelante. A modo de ejemplo y no de limitación, se puede utilizar un proceso de purificación que se aproveche del hecho que el bfgf marcado con biotina se une con alta afinidad a los receptores en las células que contienen cantidades elevadas de aquellos receptores. El biotina-bfgf marcado con I 12 se unirá a los receptores de bfgf en las células Swiss 3T3 y puede unirse a la proteína del receptor. Se pueden seleccionar como materiales de inicio varias fuentes celulares o tisulares según su abundancia en el receptor deseado. Se prefieren los embriones de pollo (día 6, estadio 29-) porque contienen cantidades relativamente grandes de la proteína del receptor como se determinó por unión de alta afinidad del bfgf humano y bovino. Los extractos embrionales se pueden, en primer lugar, fraccionar sobre aglutinina de germen de trigo (WGA) Sepharose 4B y luego se pueden unir a los receptores bfgf purificados parcialmente al biotina-bfgf. El complejo receptor-ligando puede ser adsorbido por una avidina-agarosa debido a la interacción de alta afinidad entre las porciones de biotina y avidina. Las columnas de avidina-agarosa se pueden eluir con compuestos que disocian el FGF de su receptor como el suramin o el SDS. La proteína de pollo que se une a la avidina-agarosa de forma dependiente de FGF migróeneltamaño esperado (1 KDa) del receptor de bfgf. Ver la Fig. 2B. Para determinar la secuencia aminoacídica u obtener los fragmentos polipeptídicos del receptor, éste se puede digerir con tripsina. Los fragmentos del péptido se pueden separar mediante cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa (HPLC) y analizarse mediante secuenciación en fase gaseosa. También se pueden utilizar otros procedimientos de secuenciación bien conocidos en la materia. Los receptores de FGF o las regiones externas específicas de los receptores se pueden utilizar para purificar por afinidad los FGFs respectivos. La región externa que comprende el dominio de unión al ligando del bfgf-r de pollo que se muestra en la Figura 3 se extiende desde el aminoácido 22 a aproximadamente el aminoácido 374. El dominio de unión al ligando del FGF-R humano en la Figura 4 se extiende desde aproximadamente el aminoácido 22 al aminoácido 28. El dominio de unión al ligando varia con los diferentes receptores de FGF y puede estar en cualquier sitio desde el % al 0 % de la región extracelular. La cantidad mínima de secuencia proteica necesaria para la unión al ligando se puede determinar mediante excisión de diversos segmentos del dominio extracelular y analizando la unión al ligando de la secuencia restante. Los estudios de interacción ligando-receptor indican que se requiere al menos la región de unión al ligando localizada en la región extracelular del receptor. Como se utiliza en esta solicitud, la ac- 9

10 17 ES T3 18 tividad de unión al ligando del receptor de FGF o FGF-R significa tener la capacidad de unirse al factor de crecimiento de fibroblastos u otro ligando específico. Generalmente estos ligandos serán miembros de la familia de FGF. Por ello la región externa tiene utilidad en la determinación de los agonistas o antagonistas de FGF. También es probable que el FGF-R, como muchos otros receptores de factores de crecimiento, se halle de forma natural en un complejo proteico multimérico, más frecuentemente en forma de dímero. Así, otras regiones importantes de un receptor serán aquellas, extracelulares o no, que estén implicadas en la dimerización. Las regiones intracelulares de los receptores (p.ej. el inicio a aproximadamente el aminoácido 396 en el extremo COOH terminal para el bfgf- R del pollo y el aminoácido 7 en el extremo COOH terminal para el FGF-R humano se muestra en las Figuras 3 y 4, respectivamente) se puede también utilizar como enzimas con actividad tirosina quinasa. El gen bek tiene una identidad de secuencia aminoacídica del 84 % respecto a la región análoga (región tirosina quinasa) del bfgf-r de pollo. El flg tiene una homología del 99 % con varias secuencias del receptor de FGF descritas en la Figura 4. Una secuencia señal o líder dirige la proteína através de la membrana de una célula. Las secuencias señal de los receptores pueden utilizarse en conjunto con sus respectivos receptores pero también pueden utilizarse con otras proteínas (p.ej., los aminoácidos del 1 al 21 de la secuencia N-terminal constituyen la secuencia señal o líder del bfgf-r de pollo que se muestra en la Figura 3 y el FGF-R humano que se muestra en la Figura 4). Se pueden realizar las derivaciones químicas y las modificaciones de polipéptidos, como las acetilaciones, carboxilaciones y similares, incluyendo las modificaciones de glicosilación y procesamiento de variantes de un polipéptido característico. Estas etapas de procesamiento incluyen de modo específico las modificaciones enzimáticas, como la ubiquinización. Ver, p.ej.,hershko y Ciechanover (1982), Mechanisms of Intracellular Protein Breakdown, Ann. Rev. Bioch., 1: Los análogo incluyen las variantes genéticas, naturales e inducidas. Los mutantes inducidos pueden derivarse a partir de diversas técnicas incluyendo la mutagénesis al azar de los ácidos nucleicos codificantes mediante la utilización de irradiación o exposición a EMS, o puede tomar la forma de cambios producidos por mutagénesis dirigida u otras técnicas de la moderna biología molecular. Ver, Sambrook, Fritsch y Maniatis (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2 ā ed), CSH Press. Además de los polipéptidos de longitud completa, la presente invención proporciona fragmentos activos biológicamente de los polipéptidos, como se define en las reivindicaciones que acompañan. Los inmunógenos se pueden producir con segmentos polipeptídicos repetidos en tándem, produciendo así proteínas altamente antigénicas. Alternativamente, tales polipéptidos servirán como competidores altamente eficientes para la unión específica. La producción de anticuerpos contra los polipéptidos del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos se describe más adelante. Se pueden producir polipéptidos de fusión entre los receptores y otras proteínas homólogas u heterólogas. Polipéptidos homólogos pueden ser fusiones entre receptores del factor de crecimiento diferentes, dando como resultado, en este caso, una proteína híbrida que presenta especificidad por el ligando de un receptor y el dominio intracelular de otro, o un receptor que puede tener una especificada de unión ampliada o debilitada. De esta manera, las fusiones heterólogas se pueden construir de modo que presenten una combinación de propiedades o actividades de las proteínas derivadas. Ejemplos típicos son las fusiones de un polipéptido marcador, p.ej., la luciferasa, con un dominio de un receptor, p.ej., un dominio de unión al ligando, de modo que pueda determinarse fácilmente la presencia o localización de un ligando deseado. Ver, p.ej., Dull y col., patente americana U.S Otras parejas de fusión génica incluyen la galactosidasa bacteriana, Proteína A de trpe, β-lactamasa, alfa amilasa, alcohol deshidrogenasa y el factor acoplante alfa de levadura. Ver, p.ej.,godowskiy col., (1988), Science 241: ; y la sección experimental de más adelante. Las proteínas de fusión se producirán de modo característico mediante procedimientos del ácido nucleico recombinante o mediante procedimientos de polipéptidos sintéticos. Las técnicas para la manipulación de ácidos nucleicos se describen generalmente, por ejemplo, en Sambrook y col., (1989). Cloning Molecular: A Laboratory Manual (2 ā ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory. Las técnicas para la síntesis de polipéptidos se describen, por ejemplo, en Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 8: (1963). Las secuencias de ácido nucleico recombinante utilizadas para producir proteínas de fusión de la presente invención pueden derivarse de secuencias naturales osintéticas. Muchas secuencias génicas naturales son obtenibles a partir de diversas bibliotecas de ADNc o genómico utilizando las sondas adecuadas. Ver, GenBank TM, National Institutes of Health. Las sondas típicas para los receptores del factor de crecimiento de fibroblastos pueden seleccionarse a partir de las secuencias de las Figuras 3, 4 ó 9 de acuerdo con procedimientos estándares. Los fragmentos de ADN sintéticos adecuados se pueden preparar mediante el procedimiento de la fosforamidita descrito por Beaucage y Carruthers, Tetra, Letts., 22: (1981). Se puede obtener entonces un fragmento de doble cadena mediante síntesis de la cadena complementaria y anillamiento de las cadenas juntas en las condiciones apropiadas o mediante adición de la cadena complementaria utilizando la ADN polimerasa con una secuencia de cebador adecuada. III. Acidos nucleicos La presente invención proporciona las secuencias de ácidos nucleicos que codifican para secuencias de receptor de FGF descritas anteriormente. Las Figuras 3, 4 y 7, respectivamente, muestran

11 19 ES T3 las secuencias que codifican para los receptores de FGF de pollo y humano. En la Figura 3, que muestra el FGF-R de pollo, los péptidos secuenciados a partir de proteína purificada están subrayados, incluyendo las secuencias NH2-proximal desde los aminoácidos 3-3 (ala arg), 6-67 (leu arg) y (glu lys). La secuencia transmembrana se indica por una barra gruesa, una única región aminoacídica está enmarcada, los residuos de cisteína se hallan dentro de un círculo, los sitios potenciales de N- glicosilación están indicados por puntos y la línea discontinua indica la secuencia señal putativa hidrofóbica. La secuencia aminoacídica incluye un codón de parada en el marco de lectura (en el residuo -12) seguido de una metionina iniciadora. La secuencia estructural se inicia en el aminoácido 22. En la Figura 4, que muestra el FGF-R humano, la metionina del codón de inicio en el nucleótido 92 es el primer aminoácido del gen de FGF-R. Por ejemplo, el aminoácido 22 del receptor descrito en la Figura 4 es un residuo de arginina (R) localizado en el segundo aminoácido desde la izquierda, dos líneas por encima del pie de página entre el 89 y el 6 en la página 1delaFigura4. Los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención poseerán una secuencia que se deriva de un gen natural de FGF-R humano, de pollo, u otro gen de FGF-R o uno que presente una gran homología con un gen FGF-R natural o una porción de éste. Las condiciones de estringencia de la hibridación incluirán de forma característica concentraciones de sales de menos de aproximadamente 1 M, más frecuentemente menos de 00 mm y preferentemente menos de aproximadamente 0 mm. Las condiciones de temperatura serán típicamente superiores a C, más frecuentemente superiores a C y preferentemente algo por encima de 37 C. Como otros factores pueden afectar de modo significativo la estringencia de la hibridación, incluyendo entre otros, la composición de bases y el tamaño de las cadenas complementarias, la presencia de solventes orgánicos y la magnitud de malapareamiento entre bases, la combinación de parámetros es más importante que la medida absoluta de cualquiera de ellos. Un ácido nucleico aislado es uno que ha sido purificado de otras secuencias que normalmente le acompañan, p.ej., otras secuencias de ácido nucleico celular. Generalmente, el término hace referencia a un fragmento de un genoma que ha sido selectivamente clonado, aislado y purificado hasta la homogeneidad. Las sondas se pueden preparar basándose en la secuencia de los ADNcs de receptores de FGF que se proporcionan en las Figuras 3, 4 y 9. Las sondas incluyen una ácido nucleico aislado unido a una molécula marcadora o informadora y que puede utilizarse para aislar otras secuencias de ácido nucleico del receptor de FGF mediante procedimientos estándares. Ver, p.ej., J. Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, vols. 1-3, CSH Press, N.Y. (1989). Se pueden seleccionar otros ácidos nucleicos similares mediante la utilización de ácidos nucleicos homólogos. Alternativamente, los ácidos nucleicos que codifican para los mismos polipéptidos de receptor o similares se pueden sintetizar o seleccionar haciendo uso de la redundancia en el código genético. Se pueden introducir diversas sustituciones de codones, p.ej., cambios silenciosos que por ello producen diversos sitios de restricción, u optimizar la expresión para un sistema en particular. Las mutaciones se pueden introducir para modificar las propiedades de los receptores, quizás para cambiar las afinidades de unión al ligando, las afinidades intracatenarias, o la degradación del polipéptido o la tasa de recambio. Las composiciones de ADN de esta invención se pueden derivar de ADN genómico o ADNc, preparado mediante síntesis o puede ser un híbrido de diversas combinaciones. También se proporcionan por esta invención los ácidos nucleicos recombinantes, que comprenden secuencias que de otra manera no se producen de forma natural. Una secuencia de ADN aislada incluye cualquier secuencia que se ha obtenido mediante un cebador o mediante reacciones de hibridaciónohasidosometida al tratamiento con enzimas de restricción o similares. Los oligonucleótidos sintéticos se pueden formular por el procedimiento del triéster de acuerdo con Matteucci, y col., J. Am. Chem. Soc., 3: 318 (1981) o mediante otros procedimientos como los sintetizadores de oligonucleótidos automatizados comerciales. Los oligonucleótidos se pueden marcar mediante un exceso de polinucleótido quinasa (p.ej., se utilizan unas unidades para 0,1 nmol de sustrato junto con Tris 0 mm, ph 7,6, ditiotreitol mm, MgCl 2 mm, ATP 1-2 mm, 1,7 pmoles de ATP-P 32 (2,9 mci/mmol), espermidina 0,1 mm, EDTA 0,1 mm). Las sondas también se pueden preparar mediantela reacción de translación de rotura, relleno con Klenow, u otros procedimientos conocidos en la materia. Se pueden rastrear las bibliotecas de diversos tipos de ADNc o genómico. La elección de bibliotecas de ADNc corresponde generalmente a una fuente de tejido que sea abundante en ARNm de los receptores deseados. Se prefieren generalmente las bibliotecas de fagos, pero también se pueden utilizar las bibliotecas de plásmidos. Por ejemplo, sería preferible para aislar un clon del receptor del factor de crecimiento de queratinocitos una biblioteca de ADN genómico o ADNc de células de queratinocitos. Las bibliotecas embrionales o de placenta se pueden utilizar para los receptores de int-2, FGF-yhst y para receptores del FGF acídico se prefiere una biblioteca de células endoteliales. Los clones de una biblioteca se extienden en placas, se transfieren a un sustrato para su rastreo, se desnaturalizan y se hibridan para conocer la presencia de las secuencias deseadas. Por ejemplo, en un proceso de hibridación en placa, se hibrida cada placa que contiene las calvas de bacteriófagos en filtros de nitrocelulosa por duplicado (Millipore-HATF). El ADN del fago se desnaturaliza con un tampón como NaOH 00 mm, NaCl 1, mm durante aproximadamente 1 minuto, y se neutraliza con p.ej., Tris-HCl 0, M, ph 7,, NaCl 1, M (3 veces durante minutos 11

12 21 ES T3 22 cada vez). Luego, se lavan los filtros. Después del secado, los filtros se hornean generalmente, p.ej., durante 2 horas a 80 C en un horno al vacío. Los filtros duplicados se prehibridan a 42 C durante 4-24 horas con ml por filtro de tampón de hibridación de ADN (formamida al -0 %, XSSC, ph 7,0, X solución de Denhardts (polivinilpirrolidona, más Ficoll y albúmina sérica bovina; 1X = 0,02 % de cada), tampón fosfato de sodio 0 mm a ph 7,0, SDS al 0,2 % y 0 µg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado). La hibridación con una sonda adecuada se puede realizar a 42 C durante 16 horas con ml/filtro de 1x 6 cpm/ml de tampón de hibridación de ADN que contiene la sonda marcada. La concentración final de formamida varía de acuerdo con la longitud de la sonda y el grado de estringencia deseado. Ver, p.ej., J.G: Wetmur y Davidson, J. Mol. Biol. 31: (1968); y M. Kanehisa, Nuc. Acids. Res. 12:3-213 (1984), para una discusión de las condiciones de hibridación y homología de secuencia. Una sonda oligonucleotídica basada en la secuencia aminoacídica de los dos péptidos trípticos del bfgf-r de pollo purificado se utilizó para rastrear una biblioteca de ADNc de embrión de pollo (día 6) en condiciones de baja estringencia. Las secuencias correspondientes a TVALGSNVEFVCK y VYSDPQHIQWLK, preparadas utilizando un sintetizador de oligonucleótidos automatizado comercial (Applied Biosystems) se utilizaron para obtener el clon del receptor de bfgf de pollo descrito en la Figura 3. Este clon, o secuencias derivadas de éste, se puede utilizar para aislar los bfgf-rs en otras especies así como otros FGF- Rs en una especies diana. Las sondas descritas anteriormente que se utilizaron par aislar el bfgf-r de pollo también se utilizaron para aislar un clon de ADNc del receptor de bfgf humano. De acuerdo con esta invención, cualquier secuencia de ADN aislada que codifique para una secuencia estructural completa de FGF-R se puede utilizar como sonda. Alternativamente, se puede utilizar cualquier secuencia de ADN que codifica para una señal hidrofóbica de FGF-R y su sitio de inicio de la traducción. Las sondas preferidas son clones de ADNc de cada receptor de FGF aislado. Las secuencias de ADN utilizadas en esta invención comprenderán generalmente al menos codones (1 nucleótidos), más generalmente al menos 7 codones, comúnmente al menos codones, preferentemente al menos 1 codones, más preferentemente al menos 2 codones y mejor al menos 3 codones. También pueden estar presentes uno o más intrones. Este número de nucleótidos es de generalmente la longitud mínima requerida para una sonda eficaz que hibridaría con específicamente con un receptor de FGF. Por ejemplo, los epitopos característicos de FGF-R pueden estar codificados en pequeños péptidos. Generalmente se utilizará la secuencia de tipo salvaje, en algunos casos se puede introducir una o más mutaciones, como deleciones, sustituciones, inserciones o inversiones que dan como resultado cambios en la secuencia aminoacídica para proporcionar mutaciones silenciosas, para modificar un sitio de restricción, o para proporcionar mutaciones específicas. La secuencia genómica no excederá generalmente unas 0 Kb, más generalmente no excederá unas 0 Kb, preferentemente no será mayor de 0, Kb. Se prefieren como sondas fragmentos de secuencia de ADN que tengan al menos 1 nucleótidos, generalmente al menos unos 1 nucleótidos, y menos de aproximadamente 6 Kb, generalmente menos de 1,0 Kb, a partir de una secuencia de ADN que codifica para un receptor de FGF. Las sondas también se pueden utilizar para determinar si el ARNm que codifica para un FGF-R está presente en una células o diferentes tejidos. Los fragmentos de ADN sintético o natural que codifican para un fragmento del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos deseado se incorporarán en las construcciones de ADN capaces de introducirse y expresarse en un cultivo celular in vitro. Generalmente, las construcciones de ADN serán adecuadas para la replicación en un huésped unicelular, como las levaduras o bacterias, pero también se pueden destinar para la introducción en, con o sin la integración dentro del genoma, líneas celulares de mamífero, plantas u otras líneas de células eucariotas. Las construcciones de ADN preparadasparalaintroducción en bacterias o levaduras se incluirán típicamente en un sistema de replicación reconocido por el huésped, el fragmento de ADN que codifica para el polipéptido del receptor deseado, secuencias reguladoras de la iniciación de la transcripción y traducción unidas de modo operativo al polipéptido que codifica para el segmento y secuencias reguladoras unidas operativamente al polipéptido que codifica para el segmento. Las secuencias reguladoras transcripcionales incluirán típicamente un incrementador heterólogo o un promotor que es reconocido por el huésped. La selección de un promotor apropiado dependerá delhuésped, pero los promotores como el trp, lac y promotores de fagos, promotores de tarn y promotores de enzimas glicolíticos son conocidos. Ver, Sambrook y col., (1989). Se pueden utilizar de modo conveniente los vectores de expresión disponibles que contienen el sistema de replicación y secuencias reguladoras de la transcripción y traducción junto con el sitio de inserción para la secuencia de ADN del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos. Ejemplos de combinaciones factibles de líneas celulares y vectores de expresión se describen en Sambrook y col., (1989); ver también, Metzger y col., (1988), Nature 334: Los vectores de expresión para estas células pueden incluir las secuencias control de la expresión, como un origen de replicación, un promotor, un incrementador y sitios necesarios de procesamiento de la información, como sitios de unión de ribosomas, sitios de ayuste de ARN, sitios de poliadenilación y secuencias terminadoras de la transcripción. Preferentemente, los incrementadores o promotores serán aquellos asociados de modo natural con genes que codifican para los receptores del factor de crecimiento de fibroblastos, aunque se sobreentenderá queenmuchos casos otros serán igualmente o mas adecuados. Otras secuencias control de la expresión preferi-

13 23 ES T3 24 das son los incrementadores o promotores derivados de virus, como el SV, el adenovirus, el virus del papiloma bovino y similares. De modo similar, los promotores preferidos son aquellos que se hallan de forma natural en las células productoras de inmunoglobulina (ver, patente americana U.S , pero se pueden utilizar el SV, el virus del polioma, el citomegalovirus (humano o murino) y el LTR de diversos retrovirus (como el virus de la leucemia murina, el virus del sarcoma murino o de Rous y el HIV), así como también promotores endógenos a los genes de FGF-R. Ver, Enhancers and Eukaryotic Gene Expression, Cold Spring Harbor Press, N.Y., Los vectores que contienen los segmentos de ADN de interés (p.ej., un gen del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos o la secuencia de ADNc o fragmentos de éstos) se pueden transferir a lacélulas huésped mediante procedimientos bien conocidos, que varían dependiendo del tipo de célula huésped. Por ejemplo, la transfección con cloruro de calcio se utiliza comúnmente para células procariotas, mientras que el tratamiento con fosfato de calcio se puede utilizar para otras células huésped. Ver, Sambrook y col., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2 ed.), CSFH Press (1989). El término célula transformada significa que también incluye la progenie de una célula transformada. Como con los polipéptidos purificados, los segmentos de ácidos nucleicos asociados con el segmento de unión al ligando, el dominio extracelular y el dominio intracelular son de interés particular. Estos segmentos génicos se utilizarán como sondas para el rastreo de nuevos genes que exhiben actividades biológicas similares, por ello los elementos controladores de estos genes también pueden ser de importancia. IV. Procedimientos para la producir receptores de FGF Las secuencias de ADN también se pueden utilizar para expresar los polipéptidos que exhiben o inhiben actividad de receptor de FGF. Por ejemplo, una secuencia de ADN desde aproximadamente 21 nucleótidos (aproximadamente 7aminoácidos) hasta 2,1 Kb (aproximadamente 700 aminoácidos) se pueden utilizar para expresar un polipéptido que tiene una actividad específica de receptor de FGF, típicamente de unión al ligando. Se pueden preparar grandes cantidades de las proteínas del receptor mediante la expresión del receptor entero o partes del receptor contenido en los vehículos de expresión en huéspedes compatibles como E. coli, levaduras,células de mamífero, células de insecto u oocitos de rana. Los vehículos de expresión se pueden introducir en las células utilizando procedimientos bien conocidos en la materia como la precipitación con fosfato de calcio (que se discute más adelante), la lipofección, electroporación o el dextran DEAE. Generalmente, los huéspedes de células de mamífero se inmortalizarán. Líneas celulares. Para estudiar las características de un FGF-R y su factor de crecimiento correspondiente, será de utilidad el transfectar, etc. las células de mamífero que carecen o tienen niveles bajos de un receptor de FGF, en el que la secuencia señal dirige el péptido al interior de la membrana. Las células sin los receptores de FGF significativos incluyen linfocitos, miocitos, células de mono verde cos-7 y células de ovario de hámster chino (CHO). Las células transformadas o transfectadas, etc., codifican para un receptor que es funcionalmente equivalente a un receptor de tipo salvaje y confiere una respuesta mitogénica sensible a FGF en la célula. Tales células permitirán analizar las propiedades de unión de diversos FGFs nativos. Las células transfectadas pueden también utilizarse para evaluar la eficacia de una composición o fármaco como un agonista o antagonista de FGF. El nivel de actividad del receptor tirosina quinasa o la tasa de síntesis de ácidos nucleico se puede determinar mediante el contacto de las células transfectadasconlosfármacos y comparando los efectos de FGFs o sus análogos sobre las células tratadas con el fármaco respecto al control. Aunque las células procariotas más comunes que se utilizan como huéspedes son cepas de E. coli, también se pueden utilizar otros procariotas como Bacillus subtilis o Pseudomonas. La secuencia de ADN de la invención, que incluye fragmentos o porciones de la secuencia codificante para un receptor entero, una porción del receptor o un polipéptido que tiene una actividad de FGF-R se puede utilizar para preparar un vehículo de expresión o construcción para un FGF-R o polipéptido que tiene una actividad de FGF-R. Generalmente la secuencia control será un promotor eucariota para la expresión en una célula de mamífero. En algunos vehículos, también se puede utilizar las secuencias control de los propios receptores. Un vector plasmídico procariota común para transformare. coli es pbr322 o sus derivados (p.ej., el plásmido pk279 (Clontech))(Bolavar y col., Gene, 2:9 (1977)). Los vectores procariotas también pueden contener promotores procariotas para el inicio de la transcripción, opcionalmente con un operador. Ejemplos de promotores procariotas más frecuentemente utilizados incluyen el promotor de la beta-lactamasa (penicilinasa) y de la lactosa (lac) (Chemg y col., Nature, 198:6 (1977), el promotor del triptófano (trp) (Goeddell y col., Nucleic Acid Res., 8: 47 (1980), el promotor P L y el sitio de unión al ribosoma del gen N (Shimatake y col., Nature, 292:128 (1981). Los promotores utilizados junto con las levaduras pueden ser promotores derivados del gen de la enolasa (Holland y col., J. Biol. Chem., 26:138 (1981) o el promotor para la síntesis de enzimas glucolíticos como la 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman y col., J. Biol. Chem., 2 (1980)). Adecuados promotores de mamífero no nativos pueden incluir los promotores temprano y tardío de SV (Fiers y col., Nature, 273:113 (1978) o los promotores derivados del virus de la leucemia Molony murina, virus del tumor mamario murino, virus del sarcoma de aves, adenovirus II, virus o polioma del papiloma bovino. Además, la construcción se puede unir a un gen amplificables (p.ej., DHFR) de modo que se puedan producir múltiples copias del gen del receptor de FGF. Los procariotas se pueden transformar me- 13

14 2 ES T3 26 diante diversos procedimientos, incluyendo el método del CaCl 2 (Cohen, S.N., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69:21 (1972)) o el método del RbCl (Maniatis y col., Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press 1982)). Las levaduras se pueden transformar utilizando un procedimiento descrito por Van Solingen y col, J. Bacter., 1:946 (1977) y C.L. Hsiao y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979). Respecto alascélulas eucariotas, las células de mamífero se pueden transfectar utilizando un procedimiento de precipitación con fosfato de calcio descrito por (Graham y van der Eb, Virology, 2:46 (1978)), o mediante lipofectina (BRL) o infección viral (E. Gilboa, Experimental Manipulation of Gene Expression, Capítulo 9, Academic Press pág. 17 (1983)). Los actuales vectores de expresión que contienen las secuencias adecuadas se pueden preparar de acuerdo con las técnicas estándares que implican la ligación y las enzimas de restricción (Ver p.ej., Maniatis supra.) Las enzimas de restricción disponibles comercialmente para el corte de sitios específicos del ADN se pueden obtener de New England BioLabs, Waltham, Massachusetts. Los clones se seleccionan mediante la utilización de marcadores dependiendo del tipo de construcción del vector. El marcador puede estar en la misma molécula de ADN o en una diferente, preferentemente en la misma molécula de ADN. Con las células de mamífero, el propio gen receptor puede ser el mejor marcador. En huéspedes procariotas se puede seleccionar el transformante mediante resistencia a ampicilina, tetraciclina u otros antibióticos. También puede servir como un marcador adecuado la producción de un producto determinado basada en la sensibilidad a la temperatura. Se pueden utilizar diversos procedimientos para cosechar y purificar la proteína del receptor FGF-R o un fragmento del péptido. El péptido se puede aislar a partir de un lisado del huésped. El péptido se puede aislar del sobrenadante celular si se secreta el péptido. El péptido FGF-R se purifica entonces como se discutióanteriormente mediante la utilización de HPLC, electroforesis, cromatografía de afinidad (preferentemente inmunoafinidad o afinidad por el ligando). Otro procedimiento que puede utilizarse para aislar los clones de ADNc de FGF-R de especies relacionadas implica la utilización de la reacción de la polimerasas en cadena (PCR). (Saiki, R.K., y col., Science 2:1 (198). En esta aproximación dos oligonucleótidos (27 mer) que corresponden a regiones distintas de la secuencia de FGF-R se sintetizan y luego se utilizan en la reacción de PCR para amplificar los transcritos de ARNm de una fuente de ARNm. El anillamiento de los oligonucleótidos y la reacción de PCR se realizan en condiciones de reducida estringencia como se describe más adelante en el Ejemplo 2. Los fragmentos amplificados resultantes se subclonan, y las colonias resultantes recombinantes se hibridan con el ADNc de FGF-R de tamaño completo marcado con P 32 utilizando condiciones de alta y baja estringencia (ver Ejemplos 2 y 3). Los clones que hibridan en condiciones de baja estringencia y no de alta representan los transcritos de ARNm relacionados con el FGF-R. Además esta aproximación se puede utilizar para aislar las especies de ADNc de FGF-R variantes que se producen como resultado del ayuste alternativo, ver Frohman, M.A., y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8:8998 (1988). V. Anticuerpos También se pueden preparar los anticuerpos policlonales y/o monoclonales contra diversos receptores de FGF. El término anticuerpo se utiliza para referirse a una entidad molecular homogénea, o a una mezcla como un producto sérico compuesto de una pluralidad de entidades moleculares diferentes. Los fragmentos peptídicos se pueden preparar de modo sintéticoenunsintetizador peptídico y conjugarse a una molécula transportadora (p.ej., la hemocianina de la lapa) e inyectarse en conejos durante varios meses. El suero de conejo se analiza para su inmunoreactividad con la proteína del receptor de FGF o fragmento. Los anticuerpos monoclonales se pueden realizar mediante inyección de los ratones con la proteína de FGF-R, los polipéptidos de FGF-R o las células de ratón que expresan niveles elevados del receptor de FGF clonado en su superficie celular. Los anticuerpos monoclonales se rastrearán mediante ELISA y se analizarán para conocer su inmunoreactividad específica con la proteína del receptor de FGF o polipéptidos de éste. Ver, E. Harlow y D. Lane, Antibodies: A Laboratroy Manual, CSH Laboratories (1988). Estos anticuerpos serán de utilidad en ensayos así comofármacos. Una vez que se ha obtenido una cantidad suficiente del polipéptido del receptor de factor de crecimiento de fibroblastos deseado, se puede utilizar la proteínaparadiversospropósitos. Una utilización típica es la producción de anticuerpos específicos para unirse a estos receptores. Estos anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales y pueden producirse mediante técnicas in vitro oinvivo. Para la producción de anticuerpos policlonales, se selecciona un sistema inmune diana adecuado, generalmente un ratón o un conejo. El antígeno purificado se presenta al sistema inmune de una manera determinada mediante diversos procedimientos adecuados para el animal y otros parámetros bien conocidos por los inmunólogos. Sitios típicos para la inyección son las almohadillas de las plantas de los pies, la vía intramuscular, intraperitoneal, o intradérmica. Desde luego, otras especies se pueden sustituir por un ratón o conejo. Una respuesta inmunológica se analiza generalmente con un inmunoensayo. Generalmente, estos inmunoensayos implican cierta purificación de una fuente de antígeno, por ejemplo, producido por las mismas células y de la misma manera en que se produjo el antígeno. El inmunoensayo puede ser un radioinmunoensayo, un ensayo ligado (ELISA), un ensayo fluorescente, o cualquiera de muchas otras elecciones, muchas de las cuales son funcionalmente equivalentes pero pueden exhibir ventajas en condiciones específicas. Los anticuerpos monoclonales con afinidades de 8 M 1 preferentemente 9 a,ómayores se producirán característicamente por procesos estándares como se describen, p.ej., en Harlow ylane,antibodies: A Laboratory Manual CSH Laboratory (1988): o Goding, Monoclonal Anti-

15 27 ES T3 28 bodies: Principles and Practice (2 ā ed) Academic Press, New York (1986). Brevemente, se seleccionarán los animales adecuados y se seguirá el protocolo de inmunización deseado. Al cabo del periodo de tiempo adecuado, se retiran los bazos de estos animales y las células del bazo individuales se fusionan, típicamente, con células de mieloma inmortalizadas en condiciones de selección adecuadas. Por ello, las células se separan mediante clonaje y los sobrenadantes de cada clon se analizan para su producción de un anticuerpo adecuado, específico para la región deseada del antígeno. Otras técnicas adecuadas implican la exposición in vitro de linfocitos con los polipéptidos antigénicos, o alternativamente la selección de bibliotecas de anticuerpos en vectores de fagos o similares. Ver, Huse y col., Generation of a Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda, Science 246: (1989). Los polipéptidos y los anticuerpos de la presente invención se pueden utilizar con o sin modificación. Frecuentemente, los polipéptidos y anticuerpos se marcarán mediante la unión, covalente o no covalente, a una sustancia que proporcione una señal detectable. Se conocen una gran diversidad de marcajes y técnicas de conjugación y están publicada extensamente en la bibliografía científica y de patentes. Marcajes adecuados incluyen los radioisótopos, las enzimas, los sustratos, cofactores, inhibidores, agentes fluorescentes, agentes quimioluminiscentes, partículas magnéticas y similares. Las patentes, que instruyen sobre la utilización de tales marcajes incluyen las patentes americanas U.S ; ; ; ; ; y También se pueden producir las inmunoglobulinas recombinantes, ver Cabilly, patente americana U.S VIII. Procedimientos a utilizar La presente invención proporciona un procedimiento de purificación del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF-R), así como un procedimiento para la síntesis de receptores de FGF en las células. También se proporcionan los receptores homogéneos producidos por estos procedimientos, las secuencias de ácidos nucleicos que codifican para los receptores o porciones de los receptores, así como los vehículos de expresión que contienen estas secuencias, las células que comprenden los receptores de FGF y anticuerpos contra estos receptores. De interés particular son las formas solubles de los receptores, que tienen sitios de unión que pueden competir con los receptores para unirse al FGF. Sin embargo, como se indicó anteriormente, el FGF-R funciona probablemente en un estado de dímero. Las formas solubles del receptor pueden interferir con la dimerización y pueden ser eficaces en el bloqueo de la transducción de señal por mecanismos diferentes de la afinidad competitiva para los ligandos de FGF. Se espera que los fragmentos solubles, intracelulares o transmembrana de las diversas formas de receptor interfieran con la formación del dímero y así puedan servir para bloquear al menos algunos tipos de, o cierta parte de la transducción de señal Esta observación proporciona un procedimiento para modificar in vivo una actividad modulada por el receptor del factor de crecimiento de fibroblastos, que comprende la administración a un paciente de una cantidad de un agente bloqueante del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos eficaz para inhibir la unión del factor de crecimiento de fibroblastos a los receptores del factor de crecimiento de fibroblastos. Como se discutió anteriormente, la familia de proteínas FGF desempeña un papel relevante en la regulación de muchos procesos fisiológicos importantes. Los polipéptidos de FGF-R solubles pueden ser eficaces en la modificación de la magnitud de modulación por FGF de estos procesos. Por esta razón, las formas solubles de los receptores pueden tener utilidad como sitios de unión competitivos para FGF. De la misma manera, los sitios de unión de FGF truncados o sitios de unión que han sido mutados, en particular aquellos derivados de las formas humanas descritas, pueden ser igualmente eficaces en este efecto a un coste inferior, tanto en términos económicos como en términos de efectos clínicos secundarios tras la administración. Los reactivos aquí proporcionados tendrán también utilidad en el diagnóstico de la producción de FGF o la producción de FGF-R. Diversas condiciones clínicas están indicadas por un nivel anómalo de producción de cualquiera de estas proteínas, incluyendo p.ej., el sarcoma de Kaposi, que produce el FGF de Kaposi y la retinopatía diabética. De este modo, los análisis diagnósticos dependientes de estos reactivos están ahora disponibles. Con los diferentes tipos de FGF, existe una probabilidad de que los tipos diferentes de receptores tengan variaciones en las afinidades por los diversos ligandos. Con los genes y proteínas de la presente invención, se hallarán las diferencias entre diversos tipos de receptores. De este modo, marcadores tisulares podrían estar disponibles. Ya que el crecimiento tumoral es tan dependiente de la microvascularización, la administración del FGF-R puede servir para prevenirlo y dar como resultado la supresión del crecimiento del tumor. Mediante prevención de la activación delfgf,lapresenteinvención puede representar un importante incremento al arsenal de agentes para la lucha contra el crecimiento tumoral. Las infecciones virales pueden ser también dependientes de la unión con receptores determinados durante el proceso de invasión. Existe una evidencia sugestiva de que el HSV (virus Herpes simplex) infecta mediante unión a las proteínas del FGF-R. De este modo, la administración de cantidades eficaces terapéuticamente de formas solubles de FGF-R o de fragmentos puede servir como una medida profiláctica para minimizar el riesgo de exposición a éste, u otros virus, que utilizan este mecanismo para la entrada en la célula. De nuevo, el mecanismo de protección puede depender de la unión competitiva, disrupción de la estructura del dímero, una combinación de ello u otra cosa. Las cantidades de reactivos necesarias para una terapia eficaz dependerán de muchos factores diferentes, incluyendo los medios de adminis- 1

16 29 ES T3 tración, el sitio diana, el estado fisiológico del paciente y otros medicamentos administrados. Así, se debería titular la dosis para el tratamiento de cada condición en particular. Típicamente, las dosis utilizadas in vitro pueden proporcionar una guía útil para las cantidades utilizar en la administración de estos reactivos. Los ensayos con animales de las dosis para el tratamiento de determinadas enfermedades proporcionará además una indicación predictiva de la dosificación en humanos. Diversas consideraciones se describen en Gilmann y col., Goodman y Gilman s: The Pharmacological Basis of Therapeutics, 7 ā ed., MacMilan, New York (198). Debido a la elevada afinidad de unión entre el FGF y sus receptores, se esperaría que dosis pequeñas de estos reactivos sean inicialmente eficaces. Así, se espera que los márgenes de dosificación se hallen generalmente en cantidades inferiores a concentraciones mm, típicamente inferior a concentraciones de µm, generalmente inferior a concentraciones de 0 nm, más comúnmente inferior a 1 nm, preferentemente inferior a pm (picomolar), más preferentemente inferior a 0 fm (fentomolar), y más preferentemente inferior a 1 1fM, con un vehículo adecuado. La invención se comprenderá mejor gracias a la referencia de los siguientes ejemplos ilustrativos. Ejemplo 1 Caracterización de un receptor de bfgf En primer lugar, el bfgf marcado con I 12 se unió competitivamente a células Swiss 3T3. Como se muestra en la Figura 1(A), el bfgf marcado con I 12 se añadió alascélulas 3T3 confluentes (6 fmol de bfgf marcado con I 12 por cada células) en presencia de concentraciones indicadas de: bfgf (-X-) no modificado; biotinabfgf (cuadrados rellenos); la fracción no unida después de que el biotina-fgf se incube con avidina-agarosa, (cuadrados vacíos); la fracción no unida después de que el bfgf se incube con avidina-agarosa, (triángulos abiertos). La unión se realizó durante minutos a 37 Cenmedio de cultivo (DME H21) que contenía gelatina al 0,2 %, y heparina (1 U/ml). Las células se lavaron tres veces con un tampón que contenía HE- PES mm (ph 7,4), gelatina al 0,2 % y NaCl mm. La radioactividad presente se determinó con un contador gamma Beckman. La máxima unión (0 % de inhibición) representa.700 cpm de unión específica (la unión inespecíficafuede0 cpm). Todas las determinaciones se realizaron por triplicado. El bfgf humano recombinante (Barr y col., J. Biol. Chem., 263: (1988)) se yodinó utilizando IODOBEADS (Pierce). El bfgf se yodinó utilizando 0,-1 mci; de I 12 por cada 1 µg de FGF, NaPi 0,2 M, ph 7,4, IODO- BEADS 2 y se incubó durante 1 min a temperatura ambiente, se templó con metabisulfito de Na y exceso de KI. El bfgf yodinado se separó del yodo libre sin reaccionar mediante filtración en gel en una columna PD equilibrada con fosfato de Na 0,2 M, ph 7,, NaCl 0,2 M, gelatina al 0,2%. El bfgf se biotiniló utilizando yodoacetil- LC-biotina (Pierce) a un exceso molar de 4:1 de residuos de cisteínaentris-hclmm(ph8,0) durante horas a 4 C, de acuerdo con el procedimiento de Yamamoto, y col., FEBS Lett. 176:7 (1984). La biotina no reaccionada se eliminó mediante filtración en gel con columnas PD como se describió anteriormente (Pharmacia). Durante el proceso de purificación, el bfgf modificado fue indiferenciable del bfgf no modificado en su capacidad para inhibir la unión del bfgf marcado con I 12 con los receptores de alta afinidad de bfgf en las células Swiss 3T3 y su capacidad de estimular la fosforilación de una proteína de 90 KDa, conocida por ser un sustrato de la actividad tirosina quinasa inducida por bfgf. Ver la Fig. 1(A). La reacción de biotinilación modificó el 90-9 % de las moléculas de bfgf como se cuantificó mediante unión a la agarosa conjugada con avidina. Como se muestra en la Fig. 1(B), los receptores de bfgf celulares in situ se unieron a bfgf marcado. Se añadió biotina-bfgf marcado con I 12 o bfgf marcado con I 12 (0,1 pmol)a células Swiss 3T3 (X células) en presencia o ausencia de bfgf no marcado como se indicó. Las células se lavaron y se conjugaron con disuccinimidil suberato 0,1 mm (DSS) (Pierce). Entonces, las células se solubilizaron, se sometieron a una electroforesis en gel de poliacrilamida y SDS (PAGE) y las proteínas marcadas con I 12 se detectaron por autoradiografía. El biotin-bfgf marcado con I 12 se unió a los receptores de bfgf en las células Swiss 3T3 con alta afinidad (constante de disociación igual a 1 nm) y se unió a una proteína de 1 KDa que comigraba con el receptor de bfgf unido al bfgf marcado con I 12 Ėl receptor de bfgf de pollo purificado se preparó mediante homogeneización de embriones de pollo de 6 días frescos (estadio 29-) con politrón Brinkmann (0 embriones/lote); (1:1 v/v) en una concentración final de sacarosa 0,2 M, HEPES 0 mm (ph 7,), EDTA 2 mm, NaF 0 mm, sodio ortovanadato µm, sodio pirofosfato mm, fenilmetilsulfonil fluoruro 1 mm (PMSF), aprotinina ( a unidades internacionales de kalikreina (KIU/ml), leupeptina ( µg/ml) y pepstatina (1 µg/ml). El homogenado se centrifugó a g durante 4 minutos a 4 C. El sedimento se resuspendió entampón de homogeneización (0 ml) y la suspensión resultante se denominó lafracción de membrana (Mb). La fracción de membrana se incubó entonces durante min a 4 C con un volumen igual de 2X tampón de lisis (1X tampón de lisis consiste de Tris-HCl mm (ph 7,)), NaCl 0 mm, EDTA mm, Triton X-0 al 1 %, NaF 0 mm, sodio ortovanadato µm, pirofosfato de sodio mm, PMSF 1 mm, aprotinina ( a KIU/ml), leupeptina ( µg/ml) y pepstatina (1 µg/ml), y luego se centrifugó a g durante min. El sobrenadante se aplicó por series de lotes a una columna WGA-Sepharose 4B de ml, se lavócon 0 ml de tampón de lisis seguido por 00 ml de tampón de columna que contenía HEPES mm (ph 7,), EDTA 2 mm, glicerol al %, Triton X-0 al 0,1 %, NaF 0 mm, ortovanadato de sodio µm, pirofosfato de sodio mm, PMSF 1 mm, aprotinina ( a KIU/ml), leupeptina 16

17 31 ES T3 32 ( µg/ml) y pepstatina (1 µg/ml). La columna se eluyó contampón de columna que contenía N- acetilglucosamina 0, M. Las fracciones que contenían los picos de proteínas se combinaron y se guardaron a -70 C. Para establecer la presencia de FGF-R en las membranas del embrión y el eluído WGA, el receptor del bfgf de pollo se unió mediante incubación con µl de la fracción de membrana de embrión de pollo (Mb), ó 0 µl del eluído de la columna WGA-Sepharose 4B, con bfgf marcado con I 12 (0,1 pmol) en presencia (+) o ausencia (-) de un exceso de 0 veces de bfgf no marcado durante min a 37 C (Ver Fig. 2(A)). Se añadió DSS a una concentración de 0,1 mm, y la mezcla de reacción se incubó durante min en hielo. Las muestras se sometieron a SDS PAGE seguido por autoradiografía. La unión específica y la unión del bfgf-i 12 a la fracción cruda de membrana de embrión de pollo puso de manifiesto sólo una banda protéica de KDa (Fig. 2(A)). Después de que se sustrajera la masa molecular del bfgf, el tamaño deducido del receptor de bfgf de pollo fue de 1-13 KDa. Como se muestra en la Fig. 2(B), se realizaron dos purificaciones de afinidad por el ligando a gran escala (utilizando cada una el material de.000 embriones). El eluido de la columna WGA-Sepharose 4B se incubó con biotina-bfgf preparado como se describió anteriormente (exceso molar de :1 de ligando respecto a receptor) y heparina a una concentración de 1 U/ml (para reducir la unión de baja afinidad) durante min a 4 C. La mezcla se pasó dos veces a través de una columna de avidina-agarosa de ml (bfgf-agarosa). Para determinar la unión no específica de proteínas a la avidina-agarosa (control), el eluído de la columna de WGA-Sepharose 4B se pasó através de avidina-agarosa en ausencia de biotina-fgf (control). Las columnas se lavaron con 0 ml del tampón de columna utilizado en la columna de Sepharose descrito anteriormente, que contenía NaCl 0,2 M seguido por el tampón de columna sin NaCl (0 ml) y luego eluídoconsuraminmmentampón de columna. Se recolectaron cuatro fracciones de ml (frac. 1-4) y las muestras de cada fracción se sometieron a SDS PAGE y se tiñeron con nitrato de plata. Como se muestra en la Fig. 2(B), sólo una proteína se unió a la avidina-agarosa de modo dependiente de FGF y migróeneltamaño esperado (1 KDa) del receptor de bfgf. Las proteínas eluidas se separaron mediante electroforesis en gel de acrilamida y se tiñeron con azul de Coomassie. La banda correspondiente al receptor bfgf se extrajo y la proteína se electroeluyó de acuerdo con el procedimiento de M.V. Hunkapiller, y col., Meth. In Enzymol. 91:227 (1983). Este proceso dió como resultado la purificación de 2 a ng de receptor de FGF puro por embrión de pollo con una recuperación global del % Ṗara mejor caracterizar el receptor, se digirió laproteína con tripsina. Los fragmentos del péptido se aislaron mediante cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa (HPLC) y se analizaron mediante secuenciación en fase ga seosa como se describe por Yarden y col., supra. Las secuencias de 14 péptidos, como se muestran en la Fig. 3, se obtuvieron a partir de preparaciones independientes. Tres de los péptidos fueron comunes a ambas preparaciones, lo que indicaba identidad entre los dos aislados independientemente. Cuatro de los péptidos trípticos (LIL- GKPLGEGCFQVVLA, IADFGLAR, MAPEAL- FDR y IYTHQSDWSFGV, ver la Tabla I y la Fig. 3) fueron homólogos a las secuencias consenso para los dominios de tirosina quinasa (Fig.6). Esto fue consistente con el hallazgo de que la actividad tirosina quinasa está asociada con el receptor de bfgf como se describió por Huang y Huang, J. Biol. Chem. 261:968 (1986). De este modo, se determinó que la proteína purificada era un receptor de bfgf purificado porque se unía a bfgf, presentaba el peso molecular esperado del receptor y contenía secuencias de tirosina quinasa. Como se discutió anteriormente las secuencias aminoacídicas de 11 de los 14 péptidos se identificaron en una secuencia publicada anteriormente de un clon de ADNc humano parcial, denominado flg (gen semejante a fms). Ver M. Ruta y col., Oncogene, 3: 9 (1988). Esa secuencia, se había aislado basándose en su homología con la secuencia del proto-oncogén, pero no se reconoció que codificara para una proteína de receptor de membrana. Ejemplo 2 Aislamiento de un clon de ADNc del receptor de bfgf de pollo de tamaño completo Se construyó una biblioteca de ADNc de embrión de pollo (día 6) a partir de ARNm polia+ seleccionado por tamaño. 0 µg dearnmpo- lia+ se fraccionaron por tamaño en una gradiente de sacarosa del % al % y las fracciones que contenían ARNm mayor o igual a 3, Kb se agruparon. Se utilizóµg del ARNm seleccionado por tamaño para generar el ADNc de acuerdo con el procedimiento de U. Gubler y B. Hoffman, Gene 2:263 (1986) utilizando un equipo de síntesis de ADNc de Pharmacia (cat.# ). Los ADNcs se seleccionaron por tamaño para AD- Ncs mayores o iguales a 2,0 Kb y los ADNc de tamaño cuantificado se clonaron en el sitio EcoRI del vectoriófagozapii (Stratagene, cat.#236211). La biblioteca resultante de ADNc contenía 2,0 x 6 recombinantes independientes. La biblioteca se rastreó con una sonda oligonucleotídica marcada con P 32 que codificaba para los dos péptidos contiguos mostrados en la Fig. 3 (TVALGSNVEFVCK y VYSDPQPHIQWLK). Los oligonucleótidos se prepararon utilizando un sintetizador de oligonucleótidos automatizado comercial. Los dos oligonucleótidos de 43-4 bases que contenían una secuencia complementaria solapante de 12 bases se anillaron y marcaron mediante relleno con Klenow y dntps(-dctp), dctp-p 32 y fragmento Klenow de la ADN polimerasa dando un rendimiento de una sonda marcada de 70 pb. Los filtros se hibridaron en condiciones de baja estringencia (formamida al %, solución salina de citrato X estándar (SSC) y solución de Denhardt X a 42 C) y se lavaron con SSC 0,2X a 42 C. Se aislaron veinticinco clones 17

18 33 ES T3 34 positivos tras 3 rondas de purificación en placa. De los 2 clones positivos, 11 hibridaron a elevada estringencia con el ADNc de FGF-R marcado por traslación de rotura y utilizado como una sonda (ver Ejemplo 3). Todos estos 11 clones fueron esencialmente idénticos excepto para la variación en la longitud en el extremo de los clones. La secuencia aminoacídica del mayor de los clones (3,2 Kb) contenía la secuencia de todos los 14 péptidos del receptor obtenidos en la purificación de proteínas descrita anteriormente (ver Fig. 3), ycontenía la secuencia codificane completa del FGF-R. La región transmembrana y la secuencia señal hidrofóbica se identificaron por el análisis de hidropatía de Kyte y Doolittle como se describe en Kyte y Doolittle, J. Mol. Biol., 17: (1982). Se identificó una banda única de aproximadamente 3, Kb mediante la hibridación del ARN poli(a)+ de embrión de pollo (µg) con el ADNc del receptor de bfgf de pollo de tamaño completo en condiciones de alta estringencia (formamida al 0 %), solución de Denhardt X y SSC X a 42 C. Luego se lavaron los filtros con 0,2XS- SSC a 6 C. La banda única de 3, Kb que hibridaba identificada por el análisis de transferencia de ARN, se muestra en la Fig. (A). Se realizaron experimentos de extensión por cebador con un oligonucleótido complementario a una secuencia cercana al extremo del clon. El ARN ( µg) poli(a)+ de embrión de pollo se desnaturalizó con metilmercurio mm, se anilló al cebador marcado con P 32 ( CTGCACGTCATCGCGCA-3 ) y se realizólaextensión de la síntesis con la transcriptasa inversa del virus de la leucemia Moloney murina. (Ver la Fig. (B): carril (S) representa los estándares de tamaño molecular de ADN marcados con P 32 (1Kb); carril (E)representa el fragmento extendido (23 nucleótidos); carriles (G,A,T y C) representan un gel de secuencia de acrilamida al %. Los resultados predicen que el ARNm del receptor era 48 nucleótidos más largo que el clon aislado. La secuencia de aminoácidos del marco de lectura abierto más largo (2,4 Kb) incluía un codón de parada en la pauta de lectura (residuo aminoacídico -12) seguido por una metionina iniciadora (residuo 1) y la secuencia entera codificante para el receptor (Fig. 3). El ADNc codificaba para una proteína con una masa molecular de 91,7 KDa que presentaba características halladas en varios receptores de factores de crecimiento conocidos. Contenía una única región queseexpandía por la membrana, una secuencia señal hidrofóbica NH2-terminal, tres dominios semejantes a la inmunoglobulina extracelulares y un dominio tirosina quinasa intracelular (Fig. 6). También se hallaron once potenciales sitios de N-glicosilación. La N-glicosilación y la O-glicosilación del receptor de bfgf de pollo pueden ser responsablesde la discrepancia entre el tamaño observado del receptor de bfgf y el tamaño predecido a partir de la secuencia del ADNc. Se identificaron tres dominios semejantes a la inmunoglobulina en la región putativa extracelular sobre la base de tres criterios: (i) la presencia de residuos de cisteína característicos en cada do minio; (ii) la presencia de un residuo consenso de triptófano, 11 a 12 aminoácidos del extremo COOH-terminal del primer residuo de cisteína en cada dominio semejante a la inmunogloulina; y (iii) la presencia de la secuencia consenso, DXGX- YXC, en el extremo NH2-terminal del segundo residuo de cisteína en cada dominio semejante a la inmunoglobulina. El receptor de la interleucina- 1(IL-1)tienetambién tres dominios semejantes a la inmunoglobulina y el bfgf tiene una identidad de secuencia del 2- % respecto al IL-1. Cinco dominios semejantes a la inmunoglobulina están presentes en los receptores para el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y el factor estimulador de la formación de colonias-1 (CSF-1). Entre el primero y el segundo de los dominios semejantes a la inmunoglobulina, el receptor de bfgf presenta una característica no hallada en otros miembros de la superfamilia de las inmunoglobulinas. Hay una serie de ocho residuos acídicos consecutivos (EDDDDEDD) seguido por tres residuos de serina y dos residuos acídicos adicionales (Fig. 3). Aunque fragmentos ininterrumpidos de 7 a 3 residuos acídicos se han descrito en ciertas proteínas intracelulares, en particular proteínas nucleares, tales regiones acídicas son inusualesen laregión extracelular de las proteínas del receptor transmembrana. Otra característica poco común es la longitud de la región yuxtamembrana, la región entre el segmento que se expande por la membrana y el dominio quinasa. Esta región está normalmente conservada entre los receptores tirosina quinasa. Por ejemplo, la región yuxtamembrana consiste de 49 a 1 residuos de longitud en los receptores del PDGF, CSF-1, factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor 2 del crecimiento epidérmico humano (HER2) y la insulina. El receptor de bfgf tiene una región yuxtamembrana inusualmente larga de aproximadamente 87 residuos. La región citoplasmática de la secuencia aminoacídica es de aproximadamente 424 residuos de largo y contiene una secuencia tirosina quinasa (aproximadamente residuos 482 a 79). En general, la región quinasa del receptor de bfgf comparte la mayor identidad de secuencia (aproximadamente del 1 % al 3 %) con los receptores de PDGF y CSF-1. El receptor de bfgf contiene el motivo GXGXXG y el residuo conservado de lisina (aproximadamente residuo 12)que forma parte del sitio de unión de la adenosina- -fosfato (ATP) de las tirosina quinasas. El receptor de bfgf también contiene los dos motivos característicos de tirosina quinasa, HRDLAARNVL y DFGLAR, y una tirosina (aproximadamente residuo 61) en la posición análoga al sitio de fosforilación de pp v src (aproximadamente Tyr 416). La secuencia que codifica para la quinasa del receptor de bfgf, definida por la homología con otras tirosina quinasas, está dividida por la inserción de 14 aminoácidos. La longitud de la inserción en la región quinasa es menor que la hallada en los receptores de PDGF y CSF-1 (4 y70aminoácidos, respectivamente) y es similar a la longitud de la secuencia insertada en los receptores para la insulina y el factor-1 de crecimiento semejante a la insulina.

19 3 ES T3 36 Ejemplo 3 Preparación del clon de ADNc del receptor de FGFhumanodetamaño completo Se aisló un clon de ADNc del receptor de FGF humano a partir de una biblioteca de ADNc de células endoteliales humanas de E. Sadler (R.D. Ye T-C Wun&J.E. Sadler, J. Biol. Chem., 262: (1987)) utilizando la misma sonda oligonucleotídica descrita en el Ejemplo 2. La biblioteca endotelial se hibridó aelevada estringencia con 1x 6 cpm/ml de la sonda marcada (formamida al 0 %, XSSC, Denhardt X, NaPO4 mm, ph 6,, 0 µg/ml de ADN de esperma de salmón a 42 C, (16-24 h) y se lavó a 6 C con 0,2XSSC, SDS al 0,1%. Del rastreo inicial de la biblioteca de ADNc de células endoteliales humanas, se identificaron cuatro clones y se purificaron mediante 3 rondas de purificación en placa. Los insertos de ADNc de tres de éstos clones generaron secuencias idénticas. Estos clones contenían secuencias altamente homólogas con las secuencias de fragmentos trípticos del bfgf-r de pollo purificado. La secuencia aminoacídica y de ácidos nucleicos del clon mayor (aproximadamente 3,6 Kb) se muestra en la Figura 4. Los aminoácidos 1-21 representan la secuencia señal hidrofóbica, los la región extracelular que contiene el dominio de unión al ligando, la región transmembrana y la región citoplasmática que contiene el dominio tirosina quinasa. Este procedimiento también aisló otros receptores de FGF humanos altamente relacionados. Ejemplo 4 Preparación del clon de ADNc de afgf-r humano Se hibridaron las bibliotecas de células endoteliales o de placenta con sondas de FGF-R de tamaño completo o sondas que contenían una porción de la secuencia del FGF-R. La hibridación se realizó en condiciones de baja estringencia y se lavó incrementando cada vez la estringencia. Se siguieron las condiciones de baja y alta estringencia descritas en los Ejemplos 2 y 3. Entre cada incremento, se realizó una autoradiografía. los clones que fueron positivos tras las condiciones de mayor estringencia están más relacionados con los receptores de bfgf descritos anteriormente en los Ejemplos 2 y 3. Los clones que son positivos a una estringencia moderada, pero que ya no lo son en condiciones de alta estringencia están relacionados de forma más distante. Todos los clones relacionados pero no idénticos (en la Figura 4) se determinaron mediante mapeo por restricción y secuenciación del ADN. Todos los clones relacionados se seleccionaron, se subclonaron y se expresaron. Luego, los ADNcs relacionados con FGF se analizaron para conocer su capacidad de unirse a los diversos FGFs, p.ej., FGF acídico. Alternativamente, se diseñaron dos sondas, una sonda que contenía la secuencia de FGF-R intracelular y otra que contenía la secuencia del FGF-R extracelular. Se realizaron filtros por triplicado. Un filtro se hibridó a elevada estringencia (ver Ejemplos 2 y 3) con la sonda de FGF- R intracelular. Dos filtros se hibridaron con la sonda extracelular, un filtro a elevada estringencia y uno a baja estringencia. Ya que los FGFs acídicos y básicos sólo tienen un % de identidad de secuencia, sus receptores también presentan un % de identidad de secuencia en el dominio de unión al ligando. Los clones que fueron positivos a elevada estringencia con la sonda intracelular y positivos sóloabajaestringenciacon la sonda extracelular son receptores relacionados con el FGF-R. De este modo, se seleccionaron los clones, se les realizó un mapeo por restricción y se expresaron. Los receptores expresados se analizaron para conocer su capacidad para unirse a variosfgfs,p.ej.,elfgfacídico. Ejemplo Caracterización de los clones de ADNc del FGF- R humano. Construcciones de plásmidos Para los experimentos de transfección, el ADNc del receptor del FGF de pollo de tamaño completo que contiene 46 nucleótidos de la secuencia no traducida y la secuencia 3 no traducidaentera,yeladnch2humanodetamaño completo que contiene 13 nucleótidos de la secuencia no traducida y la secuencia 3 no traducida entera se subclonaron individualmente en los sitios BamHI/SalI del vector de expresión de mamíferos psv7d (P. Luciw, Chiron Corporation). Esto colocó los fragmentos de ADNc en la orientación correcta directamente cadena abajo de un elemento del promotor de SV. Para preparar las construcciones para ser utilizadas como moldes para generar los ARNs transcritos in vitro, sesubclonó el ADNc del receptor de FGF de pollo de tamaño completo en los sitios BamHI/SalI de Bluescript SK (Stratagene) y los ADNcs del receptor de FGF humano de tamaño completo (h2 y h3) se subclonaron en los sitios PstI/SalI de Bluescript KS. Esto colocó lasse- cuencias del receptor directamente cadena abajo del elemento del promotor de la ARN polimerasa T7. Para aumentar la posibilidad de una traducción eficiente, se eliminaron las secuencias ATG cadena arriba del residuo metionina iniciador antes del subclonaje, dejando 46 y 13 nucleótidos intactos de la secuencia no traducida para las construcciones de pollo y humana, respectivamente. Líneas celulares y transfecciones Los mioblastos de músculo esquelético de rata L6 (ATCC CRL;148) se crecieron en DME H21 que contenía suero fetal bovino al % y se transfirieron a Opti-MEM (GIBCO) justo antes de la transfección. En las 24 horas después del plaqueo, 1 x 6 células se cotransfectaron con µg delaconstrucción apropiada (cfgfr/psv7d o h2fgfr/psv7d) y 1 µg de un vector que contenía el gen de resistencia a la neomicina (psv2neo). Las células se transfectaron utilizando 0 µg de Lipofectina (Bethesda Research Laboratories) según el protocolo proporcionado por el fabricante. Dieciséis horas más tarde, se añadió un volumen igual de medio DHE H21 que contenía suero fetal de ternera al %. Al cabo de 48 horas, las células se cosecharon y se realizaron pasajes (1:) en medio selectivo (DME H21, suero fetal de ternera al %, geneticina 00 µg/ml (GIBCO). Las colonias transfectantes se analizaron para la expresión del receptor de FGF mediante inmunotransferencia con antisuero policlonal anti-péptidos del receptor. 19

20 37 ES T3 38 Marcaje de afinidad El afgf humano recombinante y el bfgf humano fueron donados generosamente por Chiron Corporation y los indicados. Para los experimentos de marcaje de afinidad, x 6 células se incubaron durante minutos a 37 C con 0,1 pmoles de afgf-i 12 obfgf-i 12 en presencia o ausencia de un exceso de 0 veces del ligando no marcado correspondiente. Luego, las células se lavaron una vez con DMHE H21 helado que contenía HEPES mm, ph 7,4, gelatina al 0,2 %, y dos veces con PBS helado. Se añadió disuccinimidil suberato a una concentración final de 0,1 mm y se permitió que las incubaciones tuvieran lugar durante 1 minutos a 4 C. Entonces se eliminó el agente de unión y las células se resuspendieron en tampón de muestra que contenía ditrioteitol 0 mm, se hirvieron durante minutos y se sometieron a SDS PAGE seguido de autoradiografía. Transcripción in vitro de ARN Antes de la transcripción, las construcciones de plásmidos se linearizaron con XhoI. Los ARNs se transcribieron a partir de los moldes linearizados utilizando la ARN polimerasa de T7 en la presencia de rntps 00 µm (rgtp 0 µm) y GpppG 3 00 µm, (Pharmacia). Después de la incubación a 4 C durante 2 horas, las reacciones de transcripción se trataron con ADNasa libre de ARNasa, se extrajeron con fenol, se precipitaron con etanol se secaron y se resuspendieron en agua. Inyección en oocitos Los animales se anestesiaron con una solución de etil p-aminobenzoato al 0,006 por ciento. Los oocitos fueron retirados quirúrgicamente y diseccionados manualmente en grupos que comprendían - oocitos. Los grupos se incubaronensolución salina de Barth modificada (ver Maniatis, y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press (1982), incorporado aquí como referencia.), MBSH que contenía colagenasa de tipo II a 1 mg/nl (Sigma) durante dos horas a temperatura ambiente y luego se lavaron extensamente con MBSH que contenía2mg/mlde albúmina sérica bovina (BSA). Los oocitos individuales se mantuvieron a 19 C en MBSH (1 mg/ml de BSA). Los oocitos fueron inyectados en el polo vegetativo con 0 nl de agua o solución de ARN (1µg/ml en agua). Seguidamente a la inyección, los oocitos fueron incubados a 19 C durante 48 horas antes de realizar los ensayos de flujo de 4 Ca++. Ensayos de flujo de 4 Ca++ Grupos de 0 oocitos inyectados fueron añadidos a pocillos individuales de una placa de 24 pocillos y se lavaron cuatro veces con 0, ml de una solución de MBSH libre de Ca++ que no contenía BSA. Los oocitos se incubaron en 0, ml de la solución de lavado que contenía 4 CaCl 2 (0 µci/ml) durante 3 horas a 19 C. Seguidamente a la incubación, los oocitos se lavaron seis veces con 0, ml de MBSH (1 mg/ml de BSA), luego se transfirieron a otra placa de 24 pocillos ( oocitos por pocillo). Se realizaron los consiguientes lavados e incubaciones utilizando 0, ml de MBSH que contenía 1 mg/ml de BSA. A intervalos de tiempo de minutos, se retiraron los sobrenadantes condicionados de cada pocillo y se reemplazaron con medio fresco. Las muestras de medio condicionado se contaron individualmente en un contador de centelleo Beckman. Cuando el ruido de fondo del flujo se estabilizó, los ligandos se añadieron a las concentraciones especificadas y se continuaron las recogidas de medio. En 2 de los 16 experimentos, los oocitos inyectados con agua y estimulados con afgf o bfgf presentaban niveles de flujo de 4Ca++ similares a los obtenidos con oocitos inyectados con el ARN del receptor de FGF. No hemos determinado la razón para estas respuestas inesperadas, pero es posible que sean debidas a la expresión de receptores de FGF endógenos en células foliculares contaminantes, o en la superficie de los propios oocitos. En el resto de los experimentos, el agua inyectada a los oocitos no tuvo una respuesta de flujo significativa mientras que la respuesta del ARN del receptor al FGF fue diez a cuarenta veces la medida basal. Los niveles de receptor en oocitos inyectados no se han cuantificado porque nuestro antisuero policlonal anti-receptor reconoce una proteína de oocito abundante de aproximadamente la misma masa molecular que el receptor de FGF en transferencias de western. Además, los niveles de receptores exógenos expresados en oocitos parecen ser algo más inferiores. Aislamiento y caracterización de clones de ADNc humano Bibliotecas de ADN complementarias de células de placenta humana y de células endoteliales de la vena umbilical fueron generosamente donadas por J. Evan Sadler (Washington University School of Medicine, St. Louis). Las bibliotecas se rastrearon con oligómeros marcados con P 32 idénticos a los previamente descritos para identificar los clones de ADNc del receptor de FGF de pollo. Los filtros se hibridaron y se lavaron en condiciones de alta estringencia utilizando procedimientos estándares. Se aislaron un total de 7 clones positivos después de rastrear.000 fagos de ambas bibliotecas. Los 4 clones descritos en este informe (h2, h3, h4 y h) se secuenciaron mediante el método de los terminadores de cadena dideoxi, utilizando el sistema Sequanase (United States Biochemical Corporation). Los clones h2, h3 y h4 se obtuvieron de la biblioteca de células endoteliales y el clon h se obtuvo de la biblioteca de placenta. Los análisis de secuencia nucleotídica pusieron de manifiesto que los cuatro clones contenían secuencias no traducidas idénticas y tenían segmentos poli-a en sus extremos 3. Sin embargo, sólo el segmento poli-a en el extremo 3 de h2 estaba precedido cadena arriba por una secuencia señal de poliadenilación consenso (AATAAA; 37), lo que indicaba que la hibridación interna era responsable de los segmentos poli-a en los extremos 3 de los otros clones. Los ADNc de h2, h3, h4 y h contenían de 0,93 Kb, 0,78 Kb, 0,9 Kb y 0,2Kb de secuencia 3 no traducida, respectivamente. Las secuencias 3 no traducidas de h2 y h3 fueron idénticas y las secuencias 3 no traducidas de h4 y h fueron también idénticas. En contraste, las secuencias 3 no traducidas de h2/h3 fueron completamente diferentes de las secuencias 3 no traducidas de