USO DE ANTÍGENOS DE EXCRECIÓN-SECRECIÓN DE TRIPOMASTIGOTES (TESA) DE Trypanosoma cruzi EN EL DIAGNÓSTICO DE LA ENFERMEDAD DE CHAGAS

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1 UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACIA USO DE ANTÍGENOS DE EXCRECIÓN-SECRECIÓN DE TRIPOMASTIGOTES (TESA) DE Trypanosoma cruzi EN EL DIAGNÓSTICO DE LA ENFERMEDAD DE CHAGAS ANA LIDIA CABRERA AGUIRRE QUÍMICA BIÓLOGA Guatemala, septiembre 2004

2 UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACIA USO DE ANTÍGENOS DE EXCRECIÓN-SECRECIÓN DE TRIPOMASTIGOTES (TESA) DE Trypanosoma cruzi EN EL DIAGNÓSTICO DE LA ENFERMEDAD DE CHAGAS Informe de Tesis Presentado por ANA LIDIA CABRERA AGUIRRE Previo a optar al título de QUÍMICA BIÓLOGA Guatemala, septiembre 2004

3 UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACIA JUNTA DIRECTIVA DECANO M. Sc. Gerardo Leonel Arroyo Catalán SECRETARIA Licda. Jannette Sandoval Madriz de Cardona VOCAL I Licda. Gloria Elizabeth Navas Escobedo VOCAL II Licda. Liliana Vides de Urizar VOCAL III Licda. Beatriz Eugenia Batres de Jiménez VOCAL IV Br. Roberto José Garnica Marroquín VOCAL V Br. Rodrigo José Vargas Rosales

4 He aquí la prueba para verificar si tu misión en la tierra ha concluido: si estás vivo es porque aún te falta terminarla Richard Bach - De Ilusiones -

5 ACTO QUE DEDICO Le dedico este acto de graduación a Dios por ser quien impulsa mis días, quien me dio la convicción de que existe algo más grande por lo cual luchar incluso más grande que la vida misma. Quien pensó para mí un sinfín de posibilidades, dándome una vida completa, llena de muchos sabores facetas que me han convertido en la mujer que soy hoy. A Dios, quien escogió a Lidia y Tono como mis papas, para que con su sacrificio y entrega guiaran mi vida hacia un futuro lleno de oportunidades mientras crecía al lado de mis hermanos, Juan, Silvia y Walter, luchando por ser mejor gracias a su ejemplo. A ese Dios que nos rodeo de tíos y primos quienes le han dado a nuestras vidas un matiz muy especial y envió a nuestra familia cuatro estrellitas que han llenado nuestros corazones con su ternura y amor: Ivette, Ángela, José y Alejandra, a quien pronto conoceremos Por haberme permitido conocer también el tesoro de la amistad, en muchas formas distintas, de mucha gente diferente especialmente de María Eugenia, Ana Mary, Rebeca, Isabel, María, Anabeatriz, Sandrita, Mabel, Alma, Lilia y Gaby. A través de quienes me permitió conocer la generosidad de su mano, el valor del apoyo, la necesidad de raíces y la libertad del corazón. Porque en el subir de la montaña puso en mi camino a David, mi compañero en el andar, quien le pone alas a mis sueños En definitiva, a Dios por quien he conocido tantos rostros distintos (con miedo de dejar a alguien sin mención), a quien agradezco por las tantas personas a través de las que se ha manifestado para mí regalándome esperanza, amistad y apoyo: los que están y los que me acompañan desde el cielo, especialmente abuelito Juan, abuelito Tavo y abuelita Rosita. DIOS MIO: este acto es para ti.

6 AGRADECIMIENTOS A la Universidad de San Carlos de Guatemala, a la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia y a la Escuela de Química Biológica, por abrir sus puertas para la formación de la juventud guatemalteca y brindarme, a través de sus profesores, los conocimientos y herramientas para retribuir a mi Guatemala el privilegio de ser de esa escasa parte de la población con acceso a la Universidad. Al departamento de Citohistología, por el apoyo y la guía recibidas para la realización de este trabajo de tesis. A mis asesoras: Licda. María Paula De León y Licda. Vivian Matta, por sus consejos, dirección y principalmente por su amistad. A mis revisores: Licda. Amanda Gálvez y Lic. Martin Gil, por su tiempo y contribuciones durante la revisión de esta tesis. A la Licda. María Eugenia Paredes, Dra. Eufrosina Umezawa, Licda. Evelyn Piedrasanta, Teresita Véliz y Licda. Blanca Samayoa, por su asistencia técnica, teórica y práctica. Al Departamento de Microbiología, por su apoyo y amistad. A María Eugenia, por su apoyo y ayuda, pero principalmente por inyectarme la fe que por momentos parecía faltarme. A todos los que de alguna manera contribuyeron en la realización de este trabajo de tesis.

7 ÍNDICE Página No. I. RESUMEN 1 II. INTRODUCCIÓN 3 III. ANTECEDENTES 5 A. Generalidades de la enfermedad de Chagas 5 1. Datos históricos 6 2. Distribución geográfica 6 3. Vías de transmisión 7 B. Agente causal 8 1. Ciclo evolutivo 9 2. Características antigénicas 9 C. Patología 12 D. Respuesta inmune Respuesta celular Respuesta humoral 14 E. Tratamiento 14 F. Prevención 15 G. Diagnóstico Etapa aguda Etapa latente y crónica 17 IV. JUSTIFICACIÓN 26 V. OBJETIVOS 27 VI. HIPÓTESIS 28

8 VII. MATERIALES Y MÉTODOS 29 A. Universo de trabajo 29 B. Muestra 29 C. Recursos Recursos humanos Recursos institucionales Recursos materiales 30 D. Procedimientos (Fase I) Cultivo de línea celular Hep Obtención de tripomastigotes Producción y recolección de TESA Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) Transferencia electroforética 34 E. Procedimientos (Fase II) Selección del panel de sueros para la validación de TESA-blot Procedimiento técnico para TESA-blot 35 F. Diseño Estadístico Tipo de estudio Diseño de muestreo Análisis de resultados 36 VIII. RESULTADOS 37 A. Fase I Obtención de tripomastigotes Producción y recolección de TESA Inmunoelectroforesis 38 B. Fase II Comparación de bandas en aislamientos H-7 y H Evaluación del funcionamiento de lotes de TESA-blot H Validación 41

9 IX. DISCUSIÓN DE RESULTADOS 49 A. Fase I Obtención de tripomastigotes Inmunoelectroforesis de TESA 50 B. Fase II Comparación de bandas en aislamientos H-7 y H Evaluación de funcionamiento de lotes de TESA-blot H Validación 51 X. CONCLUSIONES 56 XI. RECOMENDACIONES 57 XII. REFERENCIAS 58 XIII. ANEXOS 62

10 1 I. RESUMEN La enfermedad de Chagas es una tripanosomiasis del continente americano que constituye la cuarta enfermedad parasitaria más importante a nivel mundial. Es causada por el parásito flagelado Trypanosoma cruzi. La Organización Mundial de la Salud (OMS) estima que 16 a 18 millones de personas padecen esta enfermedad y que alrededor de 90 millones de individuos que viven en áreas endémicas se encuentran en riesgo de contraer la infección. En la etapa inicial de la enfermedad se encuentran parasitemias significativas por lo que el diagnóstico se basa en la búsqueda del parásito. En esta etapa el sistema inmune responde precozmente a la infección produciendo anticuerpos IgM, indetectables en la fase crónica, y hacia la segunda y tercera semana de infección anticuerpos IgG, detectables durante todo el curso de la enfermedad. En las etapas latente y crónica las parasitemias son transitorias, por lo que el diagnóstico depende del hallazgo de anticuerpos circulantes contra T. cruzi. La OMS recomienda el uso de por lo menos dos técnicas complementarias para identificar a un paciente como chagásico. El estadío presente en la sangre y tejidos del hospedero es el tripomastigote, el cual libera diversos antígenos (mediante excreción-secreción) al espacio extracelular constituyendo la fracción conocida como TESA, que consiste en proteínas de kDa y varios componentes antigénicos de fase aguda (SAPA) de kDa, contra los que se producen anticuerpos específicos detectables en pacientes con infección aguda y crónica. Este es el principio de una prueba desarrollada en Brasil denominada TESA-blot, la cual, a través de un inmunoblot utiliza el TESA liberado al sobrenadante de los cultivos de células infectadas con T. cruzi. En varios estudios se ha reportado la existencia de un alto polimorfismo genético y antigénico entre las distintas cepas de T. cruzi, y se ha demostrado que el taxón se subdivide en dos líneas mayores: I y II. En México el agente principal de enfermedad de Chagas es T. cruzi I, mientras que en países de Sur América es T. cruzi II el principal responsable de infección humana. Estos hallazgos confirman la necesidad de desarrollar una técnica que emplee antígenos de aislamientos nativos responsables de la enfermedad en cada país, utilizando para su producción antígenos obtenidos a partir del estadío tripomastigote del parásito.

11 2 En la presente investigación se cultivaron 7 aislamientos guatemaltecos obtenidos por el Departamento de Citohistología de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia de la Universidad de San Carlos de Guatemala en la línea celular Hep-2. Se obtuvo el índice de infección necesario para la recolección de TESA en dos de ellos y se concentró el contenido proteico de ambos obteniéndose un mejor rendimiento antigénico con TESA H-64. Se comparó el número y peso molecular de las bandas obtenidas con TESA-blot H-64 y TESAblot H-7, presentando ambos una banda evidente y constante con peso molecular aproximado de 150 a 160 kda. Se separaron los antígenos obtenidos mediante electroforesis en geles de poliacrilamida y dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa; de esta forma se produjo 8 lotes de TESA-blot H-64 y se evaluó el funcionamiento de los mismos al desarrollarlos como inmunoblot. La prueba se validó utilizando un panel de sueros evaluados anteriormente mediante el uso de tres pruebas diagnósticas: inmunofluorescencia indirecta (IFI), ensayo inmunoenzimático (ELISA) y aglutinación con partículas de gelatina (GPAT). Este panel consistió en 50 sueros positivos, 51 negativos y 14 con serología discordante; así también se validó con TESA-blot Brasil el que fue producido con la cepa Y y donado por la Dra. Eufrosina Umezawa del Instituto de Medicina Tropical de Sao Paulo. Se obtuvo una sensibilidad relativa de 98.2% (IC 95% ) y una especificidad relativa de 100.0% (IC 95% ), además de 99.1% de concordancia con el panel de sueros utilizado. La prueba TESA-blot H-64 presentó una correlación del 98.2% con GPAT y de 99.1% con TESA-blot Brasil, siendo estas correlaciones óptimas. Se evaluó la ocurrencia de reacciones cruzadas de TESA-blot H-64 con 10 sueros positivos para Leishmania, obteniéndose 10% de reacciones positivas. Este dato debe confirmarse utilizando una mayor cantidad de sueros y se debe descartar la posibilidad de infecciones mixtas por Leishmania y T. cruzi. Con este estudio se demuestra que TESA-blot H-64 puede ser una alternativa en el diagnóstico confirmatorio de casos en los que se sospecha de infección con T. cruzi, así como para el diagnóstico de rutina junto a otra prueba como GPAT. Sin embargo, es necesario confirmar los casos en los que se sospeche Leishmaniasis o que sean provenientes de área endémica para la misma.

12 3 II. INTRODUCCIÓN La enfermedad de Chagas es una de las enfermedades parasitarias más importantes en América Latina, habiéndose documentado casos desde el sur de los Estados Unidos hasta la Patagonia en Argentina. La Organización Mundial de la Salud (OMS) estima que alrededor de 16 a 18 millones de personas padecen la enfermedad y que alrededor de 90 millones están en riesgo de contraer dicha infección (1,2). Se trata de una infección parasitaria causada por el protozoario flagelado Trypanosoma cruzi, que se transmite por medio de vectores, por vía transfusional, congénita y a través del transplante de órganos. Los vectores, principales responsables de la transmisión, habitan principalmente en regiones rurales; en Guatemala se les encuentra con mayor frecuencia en el este del país (3,4). La enfermedad se caracteriza por presentar una fase aguda corta con alta parasitemia y una subsecuente fase crónica persistente (5,6). La quimioterapia existente no es satisfactoria ni confiable. La respuesta inmunológica del paciente responde precozmente en el transcurso de la enfermedad con la producción de IgM, mientras que la IgG se produce hacia la segunda y tercera semana de la infección (3). La forma de diagnóstico de la enfermedad depende principalmente de la fase en la que la misma se encuentre. Durante la fase aguda se encuentran parasitemias importantes, por lo que se busca directamente al parásito por medio de técnicas como el xenodiagnóstico. Sin embargo, la sensibilidad de esta prueba disminuye hasta casi el 50 por ciento para la detección de casos crónicos. En la etapa crónica las parasitemias son transitorias y el diagnóstico se basa en el hallazgo de anticuerpos circulantes anti-t. cruzi y en la clínica de la enfermedad (3). La mayor parte de técnicas serológicas existentes para realizar el diagnóstico son elaboradas a base de antígenos crudos o purificados de epimastigotes (fase no infectiva del parásito), con los cuales se obtiene un alto porcentaje de reacciones cruzadas principalmente con Leishmania (7,8). El uso de antígenos producidos en la fase tripomastigote (fase infectiva del parásito) ha demostrado eliminar dichas interferencias y proporcionar pruebas altamente sensibles y específicas capaces de diagnosticar infecciones agudas, crónicas y congénitas (9).

13 4 Por otro lado, T. cruzi muestra un considerable polimorfismo genético y antigénico. Varios estudios han demostrado que las cepas existentes y responsables de infección severa en Sur América no son las mismas que las presentes en México y en Centro América. Es por ello que es necesario el desarrollo de pruebas de diagnóstico que utilicen cepas nativas y representativas de la cepa principal causante de infección en cada país (10). En Brasil se ha demostrado que el uso de los antígenos secretados-excretados por los tripomastigotes al espacio extracelular (TESA), permite realizar el diagnóstico por inmunoblot o ELISA con el mínimo de reacciones cruzadas. Sus estudios reportan que TESA-blot es 100% sensible y específico para el diagnóstico de la enfermedad de Chagas (11). El objetivo principal de la presente investigación fue utilizar la prueba TESA-blot para el diagnóstico de la enfermedad de Chagas con antígenos provenientes de parásitos aislados en Guatemala. Para tal propósito, se evaluaron siete aislamientos de T. cruzi realizados en el Departamento de Citohistología de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia de la Universidad de San Carlos de Guatemala de los que se eligió a uno de ellos, el aislamiento H-64. Una vez se obtuvo el TESA-blot se validó utilizando un panel de sueros provenientes de la seroteca del Departamento de Citohistología de la Facultad, los cuales habían sido evaluados con el uso de tres metodologías: aglutinación con partículas de gelatina (GPAT), inmunofluorescencia indirecta IgG (IFI-IgG) y ensayo inmunoenzimático (ELISA-IgG); siguiendo el criterio de OMS (4,8). Con los datos obtenidos se calculó la sensibilidad y especificidad relativas a la prueba y la concordancia Kappa de la misma respecto al panel de sueros utilizado en la validación. La presente investigación constituye un avance biotecnológico para el país ya que a partir de antígenos de un aislamiento nativo se produjo una prueba serológica altamente sensible y específica, que será de gran utilidad para el diagnóstico confirmatorio de la enfermedad de Chagas en Guatemala.

14 5 III. ANTECEDENTES A. Generalidades de la enfermedad de Chagas La enfermedad de Chagas es una afección parasitaria hemática e hística causada por el protozoario flagelado Trypanosoma cruzi. La existencia de la infección depende de la presencia del agente etiológico, de un vector y del hospedero adecuado, representado por el hombre y varios mamíferos domésticos y silvestres (3). Otro miembro de la misma familia y responsable de otra seria enfermedad humana es el protozoo flagelado agente causal de la Leishmaniasis, el cual comparte varios determinantes antigénicos con T. cruzi (12). La enfermedad de Chagas es la cuarta enfermedad parasitaria más importante a nivel mundial, después de la malaria, la esquistosomiasis y la parasitosis intestinal. Es la enfermedad parasitaria más importante en América Latina en cuanto a la pérdida de capacidades normales en el paciente (1). Un reporte reciente de la Organización Mundial de la Salud (OMS) estima que 16 a 18 millones de personas se encuentran infectadas con esta enfermedad y que alrededor de 90 millones de individuos que viven en áreas endémicas se encuentran en riesgo de contraer la infección (2). Además, existen mas de 72,000 casos en México y Centro América (13). El 84% de las formas agudas afectan a los niños antes de los 10 años de edad y el 36% involucra a menores de 1 año de vida. El 75% de los casos son formas benignas, el 20% son formas de mediana gravedad y sólo el 5% se presentan como formas graves (3). En 1996 la OMS reportó que 45,000 personas mueren de la enfermedad cada año (3,12). La enfermedad de Chagas se desarrolla como una infección de por vida en humanos, quienes sirven como reservorios del parásito. Esta infección se caracteriza por presentar una corta fase aguda con alta parasitemia, que no es diagnosticada en muchos casos, y una subsecuente fase crónica que es persistente (5,6). Debido al riesgo de infección congénita y/o transmisión horizontal por transfusión de sangre infectada, esta enfermedad se ha convertido en un gran problema en regiones no endémicas, sobre todo por el incremento en la migración de personas desde Centro y Sur América hacia países desarrollados (6). Se ha descrito también la forma indeterminada de la enfermedad, la cuál es asintomática en todo el transcurso de la

15 6 misma, estimándose que se presenta en 2/3 de los aproximados 18 millones de personas que padecen la enfermedad crónica, la mayoría habitantes de América Latina (14,15). 1. Datos históricos En 1909 Carlos Ribeiro Justiniano Chagas publicó en Brasil un artículo conocido como Nueva Tripanosomiasis Humana en el cual describía una nueva enfermedad, su agente causal, la existencia de un vector invertebrado y la transmisión experimental a mamíferos. En años posteriores describió las formas crónicas de la enfermedad, incluyendo la cardíaca, gastrointestinal y las manifestaciones neurológicas; describiendo en 1911 la infección congénita. La posibilidad de transmisión a través de transfusión sanguínea fue descrita por Mazza en 1936 (14,15). En 1913 se describió el uso de la prueba de fijación del complemento para el diagnóstico, en 1914 el xenodiagnóstico y hasta 1970 se documentó el desarrollo de otras pruebas serológicas, como las técnicas de inmunofluorescencia indirecta (IFI) y hemaglutinación indirecta (HAI) (15,16). En Guatemala la investigación sobre la enfermedad de Chagas se inicia en 1932, cuando el Profesor Dr. Edward Reichenow, del Instituto de Medicina Tropical de la Universidad de Hamburgo, estudia las fincas cafetaleras de Santa Rosa y Escuintla. Describió un insecto redúvido que por sus características supuso se trataba de Triatoma dimidiata, en quienes encontró un 40% de infección con T. cruzi. Sus estudios culminaron en el diagnóstico de los dos primeros casos de infección humana en el país, sin embargo, sus conclusiones no dieron la importancia merecida a la enfermedad, por lo que la investigación acerca de esta patología en nuestro país se retardó durante casi 15 años. Fue hasta 1947 que el Dr. Jorge Fernández estudió en el Hospital General San Juan de Dios el primer caso de cardiopatía chagásica con comprobación histológica, con lo que se reinició el estudio de dicha enfermedad (17). 2. Distribución geográfica La enfermedad de Chagas es una tripanosomiasis del continente americano, habiéndose reportado casos humanos desde el sur de los Estados Unidos hasta la Patagonia en Argentina (Anexo 1) (18). La transmisión en humanos depende de varios factores,

16 7 incluyendo la densidad de reservorios selváticos y domésticos, la densidad y rango de infección de los insectos triatominos y las condiciones de vida y vivienda de las personas (19). La población con mayor riesgo es aquella que vive bajo los 1600 msnm, en zona no tropical y en viviendas aptas para la proliferación del vector (20). Estudios realizados en Guatemala en 1959 enfatizan que la distribución de los vectores se limita a los departamentos situados al este del país, sin embargo, no existían estudios que abarcaran la totalidad del territorio nacional (20). En 1999 Tabaru y colaboradores confirmaron que los vectores son encontrados con mayor frecuencia en el este del país, en departamentos como Chiquimula, Jalapa, Jutiapa, Santa Rosa, Zacapa, oeste del Quiché y norte de Alta Verapaz. La evaluación de los vectores en diferentes zonas muestran que se encuentran infectados con T. cruzi 38.9% en Zacapa, 37.5% en Guatemala, 25.1% en Santa Rosa, 22.7% en Chiquimula, 8.2% en Jutiapa y 2.3% en Alta Verapaz. Este estudio estima que aproximadamente 330,000 personas viven en el tipo de casas con riesgo en toda la república de Guatemala (Anexo 2) (20). Los vectores de la enfermedad habitan en viviendas de regiones rurales con características especiales de construcción y uso de materiales como palma, bajareque y barro, construcciones relacionadas a condiciones de pobreza (19,20). De acuerdo al censo realizado en 1994 el 65% de la población guatemalteca vive en área rural, de ellos el 60% vive en casas construidas con paredes de barro las que presentan las características adecuadas para la supervivencia de los vectores (20). 3. Vías de transmisión Se ha vinculado la enfermedad de Chagas a varias vías de transmisión, siendo la vectorial la más importante. En Guatemala se pueden encontrar como principales vectores de la enfermedad a Triatoma dimidiata y Rhodnius prolixus, insectos hematófagos de la subfamilia Triatominae (Familia Reduviidae, Orden Hemiptera), conocidos como chinche picuda y distribuidos ampliamente en América Latina, desde México a Argentina (3,12,18,20,21). Existen otras vías de transmisión, de menor frecuencia, como son la transfusión de sangre, la congénita y a través del transplante de órganos. La transmisión transfusional se considera el segundo mecanismo de infección en zonas endémicas y el principal

17 8 mecanismo en zonas libres de vector; ésto es debido al incremento en la migración poblacional, sobre todo desde zonas endémicas hacia zonas no endémicas. El riesgo de transmisión del parásito por transfusión de sangre radica en las características biológicas de éste, ya que sobrevive en sangre total mantenida a 4 C por períodos prolongados, así como en los derivados de sangre, concentrados de glóbulos rojos y crioprecipitados; siendo viables hasta 250 días en muestras con citrato a temperatura ambiente y en sangre refrigerada hasta 18 días (4). En un estudio realizado en 1996, en Bancos de Sangre en toda la República de Guatemala, se encontró que el porcentaje de positividad a T. cruzi en donadores que acudieron a bancos de sangre fue de 1.4% de un total de 34,070 muestras procesadas en 1994 y 0.97% de un total de 17,775 muestras procesadas en 1995 (20). Los casos transmitidos vía congénita, son en su mayoría asintomáticos y disminuyen severamente la posibilidad de supervivencia del recién nacido (22). Esta forma de transmisión puede ocurrir durante cualquier etapa de la infección materna y el parásito puede infectar al feto con o sin compromiso placentario (4). Se ha sugerido la transmisión debida a la ingestión de carne mal cocinada de animales infectados (23). B. Agente causal T. cruzi pertenece al Orden Kinetoplastida y a la familia Trypanosomatidae; se caracteriza por presentar un núcleo central, un flagelo y una mitocondria única en la que está situado el kinetoplasto, organela especializada que contiene ácidos nucleicos. Su identificación es simple debido a sus particulares características morfológicas y biológicas, sin embargo, su morfología puede confundirse con T. rangeli, flagelado no patógeno transmitido por el mismo vector en algunas áreas de Centro y Sur América (24). T. cruzi presenta tres estadíos durante su ciclo de vida y morfogénesis. El estadío presente en la sangre y tejidos del hospedero es el tripomastigote, que posee su kinetoplasto en el extremo anterior al flagelo y el núcleo central, el flagelo emerge cerca del kinetoplasto. El estadío presente en el insecto vector es el epimastigote, el cual posee su kinetoplasto y flagelo posterior al núcleo. Además presenta un estadío intracelular en tejidos conocido como amastigote, el cual muestra un flagelo inconspícuo (Anexo 3) (24).

18 9 1. Ciclo evolutivo Los insectos triatóminos, por sus características hematófagas, pican al hospedero para alimentarse. Justo después, la chinche expulsa deyecciones contaminadas con tripomastigotes metacíclicos de T. cruzi que penetran por las excoriaciones de la piel producidas por el rascado luego del escozor causado por esta picadura (3). Ingresa al hospedero a través de una puerta de entrada cutánea o mucosa de donde los tripanosomas se diseminan por vía hemática o linfática alcanzando distintas vísceras, preferentemente corazón, sistema nervioso, músculo, sistema retículo-endotelial y aparato digestivo (3). El protozoo se divide por división binaria multiplicándose y pasando por la forma de amastigote intracelular. En cada localización, se producen fenómenos complejos de destrucción y reacción inflamatoria que prolongan la enfermedad. Después de alrededor de diez duplicaciones, los amastigotes se diferencian en tripomastigotes circulantes los que, previa ruptura de la célula hospedera, son liberados a la circulación. Los parásitos circulantes invaden otras células del organismo, vuelven a multiplicarse en ellas y a diferenciarse en tripomastigotes, repitiéndose el ciclo. Si bien el número de parásitos circulantes está limitado por la respuesta inmune del hospedero, ésta es incapaz de erradicarlos. El ciclo se cierra cuando otra chinche se alimenta del mamífero infectado. Los parásitos se multiplican en el estómago del vector y son los responsables de la persistencia de la infección en el insecto, así los epimastigotes continúan su progresión por el tubo digestivo hacia la ampolla rectal y allí se diferencian a tripomastigotes metacíclicos. El insecto al alimentarse de otro mamífero sano eliminará en las heces los tripanosomas infectantes, que al ingresar reiniciarán el ciclo evolutivo natural de la enfermedad (3,6). Existe gran cantidad de chinches y mamíferos silvestres que perpetúan en la naturaleza la existencia del tripanosoma infectante (Anexo 4) (3). 2. Características antigénicas Las poblaciones de T. cruzi están compuestas por una gran cantidad de cepas que circulan en ciclos selváticos y domésticos que involucran humanos, vectores y reservorios animales. Su aislamiento demuestra un amplio rango de cepas con distintas características. Esta variación intraespecífica ha sido muy investigada mediante caracterización biológica

19 10 (morfología de las formas sanguíneas, curvas de parasitemia, virulencia, patogenicidad y susceptibilidad a drogas), parámetros moleculares, farmacológicos, inmunológicos y bioquímicos (24,25). Las distintas poblaciones han sido estudiadas por análisis de los componentes de superficie de membrana y distribución de bandas en electroforesis en gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) así como con anticuerpos monoclonales, detectando reacciones cruzadas entre los antígenos (24). Varios autores han sugerido asociaciones entre cepas de T. cruzi con patrones de infección, características epidemiológicas y manifestaciones clínicas de la enfermedad (25). En 1999 Andrade y colaboradores, en un estudio realizado en Brasil, propusieron que las distintas clonas de T. cruzi muestran un tropismo diferencial hacia ciertos tejidos. Además, demostraron que presentan diferencias significativas en su composición superficial, como carbohidratos, lípidos y proteínas. Estas diferencias explican los distintos patrones de asociación de las distintas subpoblaciones de T. cruzi con sus vectores y hospederos específicos (25). T. cruzi muestra un considerable polimorfismo genético. Extensos estudios realizados utilizando la técnica de electroforesis enzimática multilocus (varios loci o genes), por medio de la cual pueden obtenerse patrones de migración específicos para enzimas que permiten distinguir entre cepas, han demostrado que las poblaciones naturales de T. cruzi tienen una estructura clonal que ha llevado a la subdivisión del taxón en dos líneas mayores I y II. Cada línea es genéticamente heterogénea y aunque no se han podido diferenciar subdivisiones en T. cruzi I, existen 5 subgrupos para T. cruzi II en base a análisis de ADN por la técnica de RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA) (10). Según datos epidemiológicos y ecológicos recolectados en Sur América existe una fuerte asociación de T. cruzi II con la enfermedad humana severa y el ciclo doméstico de transmisión, mientras que T. cruzi I es preferentemente detectado en ciclos selváticos e infección humana autolimitante en la región del Amazonas (6,25). Un estudio realizado en Argentina por Noia y colaboradores, demostró que todas las infecciones causadas por T. cruzi involucran al menos una cepa perteneciente a T. cruzi II, no encontrándose infecciones exclusivas por T. cruzi I en los pacientes chagásicos estudiados; aunque se observaron algunas co-infecciones I/II. Estos datos hacen necesario reevaluar las cepas

20 11 apropiadas para el desarrollo de modelos en el estudio de la patogénesis y el tratamiento de la enfermedad (6). Bosseno y colaboradores en un estudio realizado en México demostraron que los aislamientos mexicanos pertenecen únicamente a T. cruzi I. Esta clasificación debe ser considerada como base para los estudios de diversidad genética y de propiedades biológicas de T. cruzi, para establecer si la diversidad clonal tiene un impacto en el comportamiento biológico de los aislados. En México, por lo tanto, se puede considerar que el agente principal de enfermedad de Chagas es T. cruzi I, resultados que contrastan con la situación de países de Sur América en donde los parásitos pertenecientes a T. cruzi II son los principales responsables de infección humana (10). Los aislamientos de T. cruzi se componen de poblaciones heterogéneas, el cultivo in vitro y la inoculación en animales pueden seleccionar ciertas sub-poblaciones de la mezcla. Un largo mantenimiento de T. cruzi en animales de laboratorio lleva a alteraciones en las características biológicas de la cepa original, aumentando o disminuyendo considerablemente su virulencia. Su cultivo in vitro por largos períodos disminuye la virulencia e infectividad de la cepa en animales de laboratorio. Otros estudios han demostrado que después de pasajes sucesivos en cultivos in vitro se detecta una reducción en la metaciclogénesis disminuyendo la virulencia; un largo mantenimiento de las cepas con estas técnicas es determinante de alteraciones fenotípicas como reducción de la infectividad, virulencia y cambios en los perfiles electroforéticos de enzimas, además de modificaciones genotípicas (26). Durante todo el proceso de cambio o morfogénesis de epimastigote a tripomastigote metacíclico, a amastigote y a tripomastigote, suceden cambios dinámicos en las estructuras de superficie del parásito y por lo tanto en su genotipo antigénico (27). Los tripanosomas son incapaces de sintetizar ácido siálico por lo que usan la enzima transialidasa, la que está involucrada en el secuestro del ácido siálico de los sialoglicoconjugados presentes en sangre y otros tejidos del hospedero vertebrado infectado. El ácido siálico es transferido a galactosas terminales presentes en mucinas (proteínas o-glicosiladas) que cubren la superficie del parásito. Se sugiere que éstas y otras moléculas están involucradas en la invasión de las células del hospedero y en la protección contra la lisis por complemento (7,14,28).